ملزم الميثيل تسلسل القبض على الحمض النووي للأنسجة المريض

Summary

هنا نقدم بروتوكول للتحقيق في الحامض النووي الجينوم في الدراسات المريض السريرية واسعة النطاق الفحص باستخدام ميثيل ربط تسلسل الحمض النووي لقطة (MBDCap تسلسل أو مليون برميل يوميا وما يليها) التكنولوجيا وخط أنابيب تحليل المعلومات البيولوجية اللاحقة.

Abstract

مثيلة هي واحدة من تعديلات جينية الأساسية على الحمض النووي، وهي المسؤولة عن تنظيم دقيق للجينات اللازمة للتنمية مستقرة والتفريق بين أنواع الأنسجة المختلفة. التقلبات في هذه العملية وغالبا ما يكون السمة المميزة لمختلف الأمراض مثل السرطان. هنا، ونحن الخطوط العريضة واحدة من تقنيات التسلسل الأخيرة، ميثيل ربط الحمض النووي التقاط تسلسل (MBDCap وما يليها)، وتستخدم لتحديد مثيلة في مختلف الأنسجة الطبيعية والمرض لأفواج المرضى كبيرة. وصفنا بروتوكول مفصلة لهذا النهج تخصيب تقارب جنبا إلى جنب مع خط أنابيب المعلوماتية الحيوية لتحقيق الكمي الأمثل. وقد استخدمت هذه التقنية لتسلسل مئات المرضى عبر أنواع السرطان المختلفة كجزء من مشروع methylome 1000 (سرطان نظام Methylome).

Introduction

تنظيم جينية للجينات من خلال الحامض النووي هو إحدى الآليات الأساسية اللازمة لتحديد مصير الخلية عن طريق التمايز مستقر من أنواع الأنسجة المختلفة في الجسم ^1. وقد عرفت ديسريغولاتيون من هذه العملية أن تسبب الأمراض المختلفة بما في ذلك السرطان ^2.

هذه العملية تنطوي أساسا على إضافة مجموعات الميثيل على بقايا السيتوزين في dinucleotides الدليل السياسي الشامل من الحمض النووي ^3. هناك عدد من التقنيات المختلفة المستخدمة حاليا للتحقيق في هذه الآلية، ولكل منها ميزاتها الخاصة على النحو المبين في العديد من الدراسات ^2-8. هنا سوف نناقش واحدة من هذه التقنيات يسمى ميثيل ربط الحمض النووي التقاط تسلسل (MBDCap وما يليها)، حيث نستخدم تقنية تخصيب تقارب لتحديد مناطق مثيلة الحمض النووي. وتستند هذه التقنية على قدرة ملزم الميثيل من البروتين MBD2 لإثراء لشظايا الحمض النووي الجيني التي تحتوي على مواقع الدليل السياسي الشامل مثيلة. نحن نستخدم مجموعة تخصيب DNA مثيلة التجاريةلعزل هذه المناطق ميثليته. وقد فحص مختبرنا مئات العينات من المرضى باستخدام هذه التقنية، ونحن هنا نقدم بروتوكول الأمثل الشامل، والتي يمكن استخدامها لتحقيق أفواج المرضى كبيرة.

كما هو واضح مع أي تكنولوجيا تسلسل الجيل المقبل، يتطلب MBDCap وما يليها أيضا نهجا المعلوماتية الحيوية محددة من أجل تحديد دقيق لمستويات مثيلة عبر العينات. كانت هناك العديد من الدراسات التي أجريت مؤخرا في محاولة لتحسين عملية التطبيع وتحليل البيانات التسلسل ^{9 و 10.} في هذا البروتوكول، ونحن لشرح واحد من هذه الأساليب تنفيذ نهج الانتعاش قراءة فريدة من نوعها - LONUT - يليه تطبيع الخطي من كل عينة من أجل تمكين مقارنات مشاركات عبر عدد كبير من عينات المرضى.

Protocol

ويتم الحصول على جميع الأنسجة بعد موافقة لجنة مجلس المراجعة المؤسسية وعندما يقبل جميع المشاركين على حد سواء التحليلات الجزيئية ودراسات المتابعة. تمت الموافقة على بروتوكولات لجنة الدراسات الإنسانية في جامعة تكساس مركز العلوم الصحية في سان انطونيو.

1. ملزم الميثيل الحمض النووي القبض على (MBDCap)

1. جمع العينات وعزل الحمض النووي
   1. جمع الورم بالجملة أو عينات الأنسجة الطبيعية من البارافين جزءا لا يتجزأ من عينات الأنسجة المرضى.
   2. استخدام طقم الحمض النووي مصغرة التجارية لعزل الحمض النووي الجيني من البارافين جزءا لا يتجزأ من عينات الأنسجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   3. استخدام مجموعة تخصيب DNA مثيلة للإجراءات المنصوص هنا وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
2. غسل حبة الأولي
   ملاحظة: يتم استخدام الخرز لزوجين مع البروتين مليون برميل يوميا، البيوتين، الذي يكتشف الحامض النووي في الجينوم. وعادة ما علقت الخرزفي المحلول. استخدم الخطوات التالية ليغسل هذا السائل.
   1. Resuspend والأوراق المالية من الخرز streptavidin (انظر الجدول المواد) من قبل pipetting بلطف صعودا وهبوطا للحصول على تعليق متجانسة. لا تخلط حبات من قبل vortexing.
   2. لميكروغرام واحد من الحمض النووي المدخلات، add10 ميكرولتر من الخرز لأنبوب مع 90 ميكرولتر من 1X ربط / غسل العازلة. تناوب لمدة 1 دقيقة. لا تخلط قبل vortexing.
   3. وضع أنبوب (ق) على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة.
   4. إزالة السائل مع ماصة وتجاهل السائل.
   5. إضافة 250 ميكرولتر من 1X ربط / غسيل العازلة إلى الخرز وتناوب لمدة 1 دقيقة.
   6. كرر الخطوات من 1.2.3 - 1.2.5 مرتين.
3. اقتران البروتين مليون برميل يوميا على البيوتين الخرز
   1. 1.2 ميكروغرام من الحمض النووي المدخلات، إضافة 7 ميكرولتر (3.5 ميكروغرام) من البروتين مليون برميل يوميا على البيوتين كل أنبوب.
   2. إضافة 93 ميكرولتر من 1X ربط / غسيل العازلة للبروتين لجعل الحجم النهائي من 100 ميكرولتر.
   3. خلط حبات البروتينالخليط على خلاط الدورية في RT لمدة 1 ساعة.
4. مجزأة الحمض النووي (المدخلات)
   1. الحمض النووي يصوتن بإضافة 1.2 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي الجيني في 96 ميكرولتر من العازلة TE و 24 ميكرولتر من 5X ربط عازلة / غسل لجعل حل 120 ميكرولتر. استخدام 30 ثانية على السلطة و30 ثانية OFF السلطة خلال صوتنة، 20 - 25 مرة.
   2. تشغيل 1 ميكرولتر من محلول الحمض النووي sonicated باستخدام نظام bioanalyzer مع حساسية عالية طقم الحمض النووي التجارية للتحقق من حجم الشظايا لتكون في حدود 150-350 نقطة أساس وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
5. غسل مليون برميل يوميا الخرز
   1. وضع أنبوب يحتوي على مليون برميل يوميا الخرز على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة.
   2. إزالة والتخلص من السوائل مع ماصة دون لمس الخرز.
   3. resuspend والخرز مع 250 ميكرولتر من 1X ربط / غسل العازلة.
   4. خلط حبات على خلاط الدورية في RT لمدة 5 دقائق.
   5. كرر الخطوات من 1.5.1 - 1.5.4 مرتين.
6. رد فعل مجزأة القبض على الحمض النووي (1 ميكروغرام إدخال DNA)
   1. نقل الخليط الحمض النووي / العازلة إلى الأنبوب الذي يحتوي على مليون برميل يوميا الخرز.
   2. مزيج من مليون برميل يوميا الخرز مع الحمض النووي في خلاط الدورية لمدة 1 ساعة على RT. بدلا من ذلك، مزيج O / N عند 4 ^{درجة مئوية.}
7. إزالة الحمض النووي غير الاستيلاء عليها من الخرز
   1. بعد خلط الحمض النووي ومليون برميل يوميا الخرز، ووضع أنبوب على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة لتركيز كل من الخرز على الجدار الداخلي للأنبوب.
   2. إزالة السائل طاف مع ماصة وحفظه في أنبوب microcentrifuge خالية الدناز نظيفة كما الحمض النووي nonmethylated. تخزين هذه العينة على الجليد.
   3. إضافة 200 ميكرولتر من 1X ربط / غسيل العازلة إلى حبات لتغسل حبات.
   4. خلط حبات على خلاط الدورية لمدة 3 دقائق.
   5. وضع أنبوب على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة.
   6. إزالة السائل مع ماصة وحفظه في أنبوب microcentrifuge.
   7. لغطاءتلح ردود فعل ≤1 ميكروغرام من الحمض النووي المدخلات، كرر الخطوات من 1.7.3 - 1.7.6 ل2 أكثر الكسور غسل في المجموع.
8. شطف جزء واحد
   1. مزيج عازلة قليل الملح مع العازلة عالية من الملح (1: 1) للحصول على شطف العازلة (1000 ملي كلوريد الصوديوم).
   2. resuspend والخرز في 200 ميكرولتر من شطف العازلة (1000 ملي كلوريد الصوديوم).
   3. احتضان حبات على خلاط الدورية لمدة 3 دقائق.
   4. وضع أنبوب على الرف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة.
   5. مع الأنبوب في مكانه على الرف المغناطيسي، وإزالة السائل مع ماصة دون لمس الخرز مع طرف ماصة، وحفظه في أنبوب 1.5 مل microcentrifuge خالية الدناز نظيفة. تخزين هذه العينة على الجليد.
   6. كرر الخطوات من 1.8.1 - 1.8.4 مرة واحدة، وجمع العينة الثانية في نفس أنبوب (الحجم الكلي سيكون 400 ميكرولتر). تخزين عينة مجمعة على الجليد.
9. الإيثانول هطول الأمطار (تنظيف DNA)
   1. إلى كل noncaptured، وغسل، وشطف جزء الابام الخطوات السابقة، إضافة 1 ميكرولتر الجليكوجين (20 ميكروغرام / ميكرولتر، موجودة في الطقم)، وحجم 1/10 عينة من 3M خلات الصوديوم، ودرجة الحموضة 5.2 (على سبيل المثال، 40 ميكرولتر لكل 400 ميليلتر من العينة) و 2 أحجام عينة من 100٪ الإيثانول (على سبيل المثال، 800 ميكرولتر لكل 400 ميليلتر من العينة). الحجم الكلي هو 1241 ميكرولتر.
   2. تخلط جيدا واحتضان عند -80 ^درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل.
   3. أنبوب الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 11363 x ج في 4 ^{درجة مئوية.}
   4. بعناية تجاهل طاف دون الإخلال بيليه.
   5. إضافة 500 ميكرولتر من البرد الايثانول 70٪.
   6. أنبوب الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 11363 x ج في 4 ^{درجة مئوية.}
   7. بعناية تجاهل طاف دون الإخلال بيليه.
   8. كرر الخطوات من 1.9.6 - 1.9.7 مرة واحدة وإزالة أي طاف المتبقية المتبقية.
   9. الهواء الجاف بيليه ل~ 5 دقائق. لا تجف تماما بيليه.
   10. Resuspend بيليه في الحمض النووي في 37.5 ميكرولتر من المياه خالية من الدناز أو غيرهاحجم مناسب من العازلة.
   11. وضع الحمض النووي على الجليد أو تخزين الحمض النووي في -20 ^درجة مئوية أو أقل حتى استخدامها مرة أخرى.
   12. تأكد من أن المبلغ الإجمالي من الحمض النووي أكثر من 20 نانوغرام، (على سبيل المثال، استخدام نظام تحديد الكميات فلوروميتريك، انظر المواد الجدول).

2. التسلسل

1. استخدام الحمض النووي شظايا استردادها من إجراء MBDCap عن التسلسل. لكل عينة لتكون متسلسلة، بمبلغ إجمالي قدره 20 - مطلوب 40 نانوغرام الحمض النووي لإعداد مكتبة.
2. لإعداد مكتبة الحمض النووي وما يليها استخدام نظام البناء مكتبة مؤتمتة بالكامل (انظر الجدول المواد) واتباع بروتوكول قياسي المقدمة من قبل الشركة المصنعة. اختر شظايا الحمض النووي من حجم 200-400 نقطة أساس لإعداد مكتبة. نظام إعداد مكتبة أتمتة يسمح توحيد إجراءات إعداد مكتبة والتقليل من الاختلافات في كافة العينات بسبب إعداد دليل.
3. استخدام محول رئيس الوزراءالتمرير وتمييع لتركيز 100X. هذا، استخدام 10 ميكرولتر لكل عينة.
4. الخطوة التالية 2.2، واخراج رد فعل، وتحديد مكتبة الحمض النووي وما يليها باستخدام نظام تحديد الكميات فلوروميتريك (انظر الجدول المواد).
   1. إعداد إجراءات التضخيم PCR. اختيار مزيج الرئيسي PCR هو تحسين كفاءة PCR من المنطقة GC المخصب من الجينوم. في أنبوب PCR، إضافة مكتبة 15 ميكرولتر الحمض النووي وما يليها، 25 مزيج الرئيسي ميكرولتر PCR (انظر الجدول المواد)، 2 ميكرولتر PCR مزيج التمهيدي (انظر الجدول المواد)، و 8 ميكرولتر H ₂ O.
5. بتوصية PCR من الشركة المصنعة لمزيج الرئيسي PCR، وتغيير الأوقات وركوب الدراجات ودرجات الحرارة لاختلاف المواد الأولية: 98 ^درجة مئوية لمدة 45 ثانية، دورات X من 98 ^درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 65 ^درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 ^درجة مئوية لمدة 30 الصورة، ثم 72 ^درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. عقد في 4 ^{درجة مئوية.}
   1. الأداء الإقتصادي الأداءاسندت كافية دورات في نهاية المطاف مع 2-10 نانومتر من الحمض النووي مكتبة (8-10 دورات).
6. تنظيف تفاعل PCR مع نسبة 1: 1 من الخرز تنقية PCR وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر الجدول المواد).
7. أزل مع 20 - شطف العازلة 30 ميكرولتر.
8. الباركود لكل عينة وتجمع 4 عينات معا في حارة واحدة من خلية تدفق. استخدام بروتوكول قياسي 50 نقطة واحد قراءة لتسلسل (انظر الجدول المواد).

3. تحليل المعلومات البيولوجية

ملاحظة: عملية أخرى الملفات fastq الخام تم الحصول عليها من تسلسل لأداء مراقبة الجودة ورسم خريطة تسلسل الحمض النووي قصيرة (قراءة) إلى الجينوم.

1. استخدام ربطة قصيرة قراءة اليجنر، الجينوم أداة رسم الخرائط على كل ملف عينة fastq لخريطة يقرأ لجينوم المرجعية. تتوفر لتنفيذ هذه الخطوة العديد من أدوات رسم الخرائط قراءة، ويمكن استخدامها على أساس تفضيل شخصي.
   1. السماح تصل إلى 2 عدم التطابق في جملةيقرأ البريد في حين رسم خرائط للجينوم المرجعية. بلغ ما يصل الى 20 أفضل التحالفات لكل قراءة. على سبيل المثال، استخدام ربطة -v 2 --best كيلو 20 --chunkmbs 200 .
2. استخدام LONUT ⁹ لاسترداد معين تتضاعف يقرأ لتحسين الكشف عن المناطق المخصب. لكل قراءة، في معظم محاذاة واحدة سوف تشفى عندما يكون قريب بما فيه الكفاية إلى أي من دعا فوق القمم. على سبيل المثال، استخدام: بيرل lonut.pl -g hg19 -w 250 -p 99 . سوف LONUT بتنفيذ الخطوات التالية.
   1. التحالفات انقسم الى تعيين فريد يقرأ وتعيين تتكاثر يقرأ. ذروة ندعو تعيين فريد يقرأ باستخدام ذروة المتصل حزام ^11. الخيار -w 250 و -p 99 في المثال القيادة هي للحزام.
   2. الجمع بين تعيين فريد يقرأ مع تعافى يقرأ تم الحصول عليها من LONUT، وجنبا إلى جنب يقرأ، في شكل سرير، سيتم استخدامها في إجراء مزيد من التحليل. احسب عدد تنافسيةإد يقرأ للتطبيع في المستقبل.
3. بن ليقرأ. يقرأ استخراج في المنطقة ذات الاهتمام باستخدام النصي بيرل: بيرل methyPipeline.pl -up <تمتد المنبع طول> -dn <المصب طول تمتد>. لكل ملف السرير المدرجة في sampleInfoFile، والسيناريو بيرل بتنفيذ المهام التالية.
   ملاحظة: انظر التكميلي ترميز ملف البرنامج النصي بيرل.
   1. بن ليقرأ في حجم بن ثابت، على سبيل المثال، 100 نقطة أساس، لمدة 24 الكروموسومات.
   2. لكل الجينات المحددة في refGeneFile، استخراج صناديق حول الموقع النسخ بداية (TSS)، وصولا إلى طول تمديد يحددها -up الخيار و-dn. على سبيل المثال، استخراج البيانات في المنطقة التي هي قائمة والمصب 4 كيلوبايت من خدمات الدعم التقني. في بن حجم 100 سنة مضت، استخراج هذه البيانات لديها 81 صناديق، وبن مركز يتوافق مع خدمات الدعم التقني.
   3. لجين على حبلا بواسطة العقاقير، والوجه المنطقة المستخرجة من اليسار إلى اليمين بحيث صناديق المنبع دائما جيش التحرير الشعبى الصينىدائرة الهندسة المدنية على اليسار مع المخطوطة.
   4. تقسيم كذلك خدمات الدعم التقني ± المنطقة 4 كيلوبايت إلى ثلاث مناطق فرعية هي: اليسار، المنبع 4 كيلوبايت إلى المنبع 2 كيلوبايت. الأوسط، صعودا والمصب 2 كيلوبايت. الحق، المصب 2 كيلو بايت إلى 4 كيلوبايت.
   5. لكل عينة، وتقسيم عدد من يقرأ في كل حاوية من العدد الإجمالي للمجتمعة معين يقرأ المحسوبة في 3.3.3. تطبيع سيقضي على عينة محددة قراءة الاختلاف ويسمح لمقارنة يقرأ عبر عينات مختلفة.
4. تشغيل البرنامج النصي باش (كما هو مبين في ملف نصي) لأداء اختبار إحصائي على تطبيع يقرأ تم الحصول عليها من منطقة اليسار، للكشف عن مثيلة الفرق بين مجموعة طبيعية والحال في مناطق توصف بأنها في منطقة الجناح.
   ملاحظة: انظر التكميلي ترميز ملف البرنامج النصي باش. واستنادا إلى المناطق التي يتم ميثليته تفاضلي، هناك سبع مجموعات:
   المنطقة كلها: مثيلة الفرق في جميع أنحاء TSS ± ​​المنطقة 4 كيلو بايت
   Middlمثيلة التفاضلية في كل من المنطقة الوسطى واليسار: eLeft
   مثيلة التفاضلية في كل من المنطقة الوسطى واليمين: MiddleRight
   مثيلة التفاضلية في كل منطقة اليسار واليمين: الجناح
   اليسار: مثيلة التفاضلية في منطقة اليسار فقط
   مثيلة التفاضلية في المنطقة الصحيحة فقط: الصحيح
   مثيلة التفاضلية في المنطقة الوسطى فقط: الشرق
5. استخدام البرنامج النصي باش نفسه لتصور مثيلة التفاضلية في مؤامرة اعصار. رسم المفرط ونقص سكر الدم جينات مثيلة على لوحة منفصلة، ​​وفرز في ترتيب مزيج المنطقة كما هو موضح في 3.4، على التوالي.

النتائج

وقد استخدمنا MBDCap وما يليها لدراسة التعديلات الحامض النووي في عدد كبير من المرضى من أنواع السرطان المختلفة بما في ذلك الثدي ^12، بطانة الرحم ¹³ والبروستاتا ^14، وسرطان الكبد وغيرها. نحن هنا لشرح بعض المعلومات من دراسة سرطان الثدي نشرت مؤخرا ^12. في هذا المثال، اس...

Discussion

تقنية MBDCap وما يليها هو نهج تخصيب تقارب ^3، التي تعتبر بديلا فعالا من حيث التكلفة عند التحقيق الأفواج مع عدد كبير من المرضى ^15. خط أنابيب المعروضة هنا يصف اتباع نهج شامل من شراء عينة لتحليل البيانات وتفسيرها. واحدة من أهم الخطوات ووضع إجراء التضخيم PCR لتحسين كفاءة PCR من ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylminer DNA enrichment Kit	Invitrogen	ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	112-05D
Bioruptor Plus Sonication Device	diagenode	B01020001
3 M sodium acetate, pH 5.2	Sigma	S7899	100 mL
SPRIworks Fragment Library System I	Beckman Coulter	A50100	Fully automated library construction system
Adapter Primers	Bioo Scientific	514104	PCR primer mix
Qubit	Invitrogen	Q32854	Fluorometric Quantitation System
PCR master mix	KAPA scientific	KK2621	PCR master mix
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	PCR Purification beads
EB Buffer	Qiagen	19086
HiSeq 2000 Sequencing System	Illumina