بروتوكول مفصل للتميز الخط خلية الفئران C1498 ونموذج أسوشيتد اللوكيميا ماوس ل

Summary

توفر هذه المخطوطة إجراء الفني التي يمكن استخدامها لوصف الثقافات الخلية C1498 في المختبر وسرطان الدم الحاد الناجم في الفئران بعد الحقن الخاصة بهم. يتم تنفيذ المظهري والوظيفية التحليلات باستخدام التدفق الخلوي، المجهري المناعي، الكيمياء الخلوية ومايو جرونوالد تلطيخ بالغيمزا.

Abstract

وقد تم إجراء الحقن في الوريد من C1498 الخلايا في الفئران مسانج أو مسانج منذ عام 1941. وهذه الحقن تؤدي إلى تطوير سرطان الدم الحاد. ومع ذلك، فإن طبيعة هذا المرض لم يتم توثيقها جيدا في الأدب. هنا، ونحن نقدم بروتوكول الفني لتمييز الخلايا C1498 في المختبر وتحديد طبيعة سرطان الدم يتسبب في الجسم الحي. وركز الجزء الأول من هذا الإجراء على تحديد النسب المكونة للدم ومرحلة تمايز الخلايا C1498 مثقف. ولتحقيق ذلك، يتم استخدام متعدد حدودي تلطيخ تدفق cytometric للكشف عن علامات الخلايا المكونة للدم. المجهر المناعي، الكيمياء الخلوية وتلطيخ مايو جرونوالد بالغيمزا ثم يتم إجراء تقييم التعبير عن الميلوبيروكسيديز، ونشاط المونوأمينوأوكسيداز والتشكل الخلوي، على التوالي. الجزء الثاني من هذا البروتوكول هو مخصص لوصف مرض سرطان الدم الذي يتسبب فيالجسم الحي. وهذا الأخير لا يمكن أن يتحقق من خلال تحديد الترددات من خلايا اللوكيميا والمتأصلة في الدم، وأجهزة المكونة للدم (مثل نخاع العظام والطحال) والأنسجة غير اللمفاوية (على سبيل المثال، والكبد والرئتين) باستخدام تلطيخ محددة والتدفق الخلوي التحليلات. طبيعة سرطان الدم ثم يتم تأكيد استخدام مايو جرونوالد بالغيمزا تلطيخ وتلطيخ لالمونوأمينوأوكسيداز محددة في نخاع العظام. هنا، فإننا نقدم النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول في الفئران C1498- وبرنامج تلفزيوني حقن العمر المتطابقة.

Introduction

يتميز سرطان الدم النخاعي الحاد (AML) بسبب الانتشار غير المحدود للخلايا الدم النخاعي المكونة للدم التي يتم حظرها في مراحل مختلفة من النضج. هذه التقلبات يمكن أن تؤثر على المحببات، وحيدي، الكريات الحمر أو مسارات التمايز megaryocytic ^1. خلايا مكافحة غسل الأموال تتراكم في نخاع العظام، مما يؤدي إلى تكون الدم منخفضة القيمة، مما يؤدي إلى قلة الصفيحات، اللمفاويات وفقر الدم. خلايا اللوكيميا أيضا تغزو الدم والأعضاء غير اللمفاوية.

تم استخدام نموذج C1498 الماوس لعقود نموذجا لسرطان الدم الحاد منذ تم عزل خلايا السرطان من اللوكيميا البالغ من العمر 10 أشهر C57BL / 6 (H-2 ^ب) فئران في عام 1941. ويصف الأدب الغزو في الدم والأعضاء المكونة للدم (على سبيل المثال، والطحال والغدد الليمفاوية) وأجهزة غير المكونة للدم (مثل الكبد والرئتين والمبيض، والكلى) من قبل خلايا C1498 التكاثري للغاية بعد أن تم حقن عبر فيtravenous، تحت الجلد أو الطريق داخل البريتوني في الفئران عرضة ^2-4. ومع ذلك، أفيد هذا نموذج الفأر للحث إما المحببات ^2،5 أو حيدي نقوي ⁶ اللوكيميا. وفي الآونة الأخيرة، وصفت دراسة نشرت في عام 2002 هذا النوع من السرطان كما NKT الفئران خلايا سرطان الدم ^(7). وهكذا، يختلف الأدبيات بشأن طبيعة هذا الخط الخلية C1498 وسرطان الدم المرتبطة أنه يدفع في الفئران. ويرجع ذلك أساسا إلى عدم وجود مفصلة ومحدثة المعلومات المنشورة حول الخلايا والمرض اللوكيميا بشكل عام لأن العديد من الدراسات أجريت في عام 1950 هذه التناقضات - 70.

هنا نقدم بروتوكول مفصلة لوصف كيفية تميز الخلايا C1498 وتحليل طبيعة المرض ابيضاض الدم التي يسببها الحقن في الوريد بهم في الفئران. ويكرس القسم الأول من هذا البروتوكول إلى وصف الخلايا C1498 التي تم تربيتها في المختبر. مكافحة الفلورسنتواستخدمت الهيئات الموجهة ضد السطحية وعلامات المكونة للدم داخل الخلايا لتحديد ملامحهم باستخدام التدفق الخلوي. تم تقييم وجود الميلوبيروكسيديز باستخدام المناعي المجهري، وجرى تقييم للدم النسب والتمايز المرحلة الخاصة بهم باستخدام الكيمياء الخلوية لتقييم نشاط المونوأمينوأوكسيداز، وأجريت مايو جرونوالد تلطيخ بالغيمزا. ثم تم حقن الخلايا C1498 في الفئران، ويوصف هذا المرض سرطان الدم الحاد الذي يتسبب في القسم الثاني من هذه المخطوطة. تم استخدام نفس التقنيات لتحديد الترددات والظواهر من خلايا اللوكيميا والمتأصلة في نخاع العظام والدم المحيطي والطحال والأجهزة غير المكونة للدم (الكبد والرئتين).

هذا البروتوكول هو تكرار للغاية، وسوف البيانات المقدمة هنا يساعد الباحثين لتقييم آثار استراتيجيات علاجية جديدة. وقد تم بالفعل استخدام هذا النموذج سرطان الدم الماوس لاختبار النهج العلاج المناعي لالثانية مختلفة أدوية السرطان العلاج الكيميائي ^8،9. تم تقييم فعاليتها من خلال تحديد تطور عبء الورم ومعدلات البقاء على قيد الحياة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتقديم معلومات إضافية حول توزيع والإقامة للسكان الخلية المكونة للدم اللوكيميا وغيرها خلال فترة العلاج.

Protocol

تمت الموافقة على حظائر الحيوانات وجميع الإجراءات التجريبية من قبل اللجنة الأخلاقية رعاية الحيوان المحلية، CEEA.NPDC (no.512012 الاتفاق)، وأجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية الفرنسية والأوروبية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.

1. في توصيف المختبر من الخط C1498 خلية

1. في الثقافة المختبر من خلايا C1498
   1. إعداد كامل RPMI (معهد روزويل بارك التذكاري) 1640 المتوسطة وذلك بإضافة 50 مل من مصل بقري جنيني (FBS)، 5 مل من البنسلين (100 U / مل) -streptomycin (100 ميكروغرام / مل)، 500 ميكرولتر من 50 ملي β-المركابتويثانول ، 5 مل من N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-الإيثان حمض السلفونيك (HEPES)، 5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية و5 مل من البيروفات الصوديوم إلى 500 مل من RPMI المتوسطة.
   2. تنمو خط الخلية C1498 في كامل RPMI. حصاد الخلايا في تعليق من قبل pipetting، ونقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة supernaتانت.
   3. إضافة 20 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (1X) حل، الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة طاف.
   4. resuspend الخلايا في 10 مل من المنشط الإسفار فارز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) العازلة (2.5 غرام من ألبومين المصل البقري BSA) مسحوق (و 2 مل من 0.5 M ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل EDTA الحل () في 500 مل من محلول PBS). عد الخلايا باستخدام خلية توما عد الغرفة بعد تلطيخ الخلايا مع الأزرق التريبان.
2. التوصيف المظهري من خط الخلية C1498 باستخدام المناعية والتدفق الخلوي تحليل
   1. تلوين سطح الخلية
      1. إعداد FACS العازلة.
      2. ضبط الخلايا التي تحصد في FACS العازلة إلى 10 ⁷ خلية / مل والاستغناء عن 10 ⁶ خلايا (في 100 ميكرولتر) لكل تجربة تلطيخ إلى التدفق الخلوي الأنابيب.
      3. تسمية الخلايا مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة التالية أو ضوابط نمط إسوي المرتبطة بها مخففة في FACS العازلة:
         1. شكلarkers السلائف وخلايا متباينة، تسمية الخلايا مع anti-CD11b / مكافحة CD18 (1)، ومكافحة لي-6G (1)، ومكافحة CD19، ومكافحة B220 (2)، ومكافحة NK1.1، ومكافحة CD49b، ومكافحة CD4 (1)، ومكافحة CD8 (2)، ومكافحة CD3 (3)، ومكافحة CD21 / 35، ومكافحة CD115 ومكافحة TCRVβ الأجسام المضادة.
         2. للدم علامات الخلايا الجذعية / السلف، استخدام مزيج من مكافحة CD34 / مكافحة CD117 / المضادة للهيئة السلع التموينية-1، المضادة للCD150 / مكافحة CD117 / المضادة للهيئة السلع التموينية-1، المضادة للCD117 / مكافحة CD127 أو المضادة CD16 الأجسام المضادة / 32 البيوتين وحدها.
         3. لعلامات من وظائف الخلية (على سبيل المثال، التصاق، تقديم المستضد، وشارك في تنشيطية الجزيئات ومستقبلات)، وصمة عار على الخلايا مع مكافحة CD18 (2) / مكافحة CD11a، ومكافحة MHC الصف الأول، ومكافحة MHC من الدرجة الثانية، ومكافحة CD31، ومكافحة CD44، ومكافحة CD80-البيوتين، ومكافحة CD86، ومكافحة CD274 الأجسام المضادة.
      4. احتضان كل من التدفق الخلوي أنابيب في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      5. غسل الخلايا مرتين بإضافة 2 مل من FACS العازلة لكل أنبوب، الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف.
      6. إضافة 100 ميكرولتر من FACS العازلة لكل أنبوب، والشروع في تلطيخ الثانوي بإضافة 100 ميكرولتر من streptavidin الفلورسنت (1/100 العازلة في نظام مراقبة الأصول الميدانية لتخفيف النهائي 1/200) إلى الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز مترافق. احتضان الأنابيب عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      7. غسل الخلايا مرتين كما يلي: إضافة 2 مل من FACS العازلة لكل أنبوب، أنابيب الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف قبل pipetting.
      8. Resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة ووضع الخلايا على الجليد، وحفظ لهم في الظلام باستخدام رقائق الألومنيوم لتغطية الأنابيب. تحليل النتائج باستخدام عداد الكريات ^10.
   2. تلطيخ الخلايا
      1. إعداد عازلة تثبيت بإضافة 125 مل من محلول بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) إلى 375 مل من محلول برنامج تلفزيوني.
         ملاحظة: لإعداد 500 مل من 4٪ PFA، حرارة 400 مل من محلول PBS إلى ما يقرب من 60 درجة مئوية على طبق من ضجة في غطاء التهوية. إضافة 20 غرام من مسحوق PFA، ورفع درجة الحموضةحتى يتم حل PFA. يسمح الحل ليبرد، وضبط درجة الحموضة إلى 6.9، وجعل وحدة التخزين إلى 500 مل مع برنامج تلفزيوني.
      2. إعداد المخزن المؤقت permeabilizing بإضافة 0.5 غرام من سابونين و 0.5 غرام من BSA إلى 500 مل من محلول برنامج تلفزيوني.
      3. ضبط الخلايا التي تحصد في FACS العازلة إلى 10 ⁷ خلية / مل وتوزيع 10 ⁶ من الخلايا (100 ميكرولتر) لكل تجربة تلطيخ إلى التدفق الخلوي الأنابيب. الطرد المركزي الخلايا في 350 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف.
      4. إصلاح الخلايا في 200 ميكرولتر من محلول 1٪ PFA واحتضان لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      5. إضافة 2 مل من العازلة permeabilizing لكل أنبوب، أنابيب الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف قبل pipetting. إضافة 100 ميكرولتر من permeabilizing العازلة إلى كل أنبوب.
      6. تسمية الخلايا مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة التالية أو ضوابط نمط إسوي يناظرها بعد تمييعها في permeabilizing المخزن المؤقت: مكافحة CD3 (2) / مكافحة CD8 (1)، ومكافحة CD3 (3) / أالمعهد القومي للاتصالات-CD4 (2)، ومكافحة CD107b ومكافحة CD3 (3) / مكافحة TCRVβ.
      7. احتضان الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      8. غسل الخلايا مرتين بإضافة 2 مل من permeabilizing العازلة إلى كل أنبوب. أنابيب الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف.
      9. إضافة 100 ميكرولتر من permeabilizing عازلة للخلايا. انتقل إلى تلطيخ الثانوي بإضافة 100 ميكرولتر من streptavidin الفلورسنت مخففة في permeabilizing عازلة لالأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز مترافق. احتضان الأنابيب عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      10. إضافة 2 مل من permeabilizing العازلة لكل أنبوب، أنابيب الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
      11. Resuspend الخلايا في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة، ومن ثم وضع الخلايا على الجليد في الظلام. تحليل النتائج باستخدام قياس التدفق الخلوي ^10.
3. إعداد تعليق خلية على الشرائح للفحص المجهري
   1. غسل 10 ⁶ من هكتارخلايا rvested C1498 (حصلت عليه في الخطوة 1.1.4) مع 5 مل من FACS الباردة العازلة مرتين، وتمييع الخلايا في 1 مل من العازلة FACS الباردة. وضع أنابيب على الجليد.
   2. وضع الشرائح في غرف القابل للتصرف مع بطاقات مرشح المرفقة مسبقا ووضع هذه في cytocentrifuge.
   3. إضافة 100 ميكرولتر من العازلة FACS إلى كل بطاقة الغرفة والتصفية، وتدور عليهم لمدة 2 دقيقة على 4.52 ز س.
   4. إضافة 100 ميكرولتر من الخلايا لكل بطاقة الغرفة والتصفية، وتدور الخلايا في 4.52 x ج لمدة 2 دقيقة.
   5. إزالة بعناية الشرائح من الدوائر والهواء الجاف الشرائح قبل تلطيخ لهم الميلوبيروكسيديز (الخطوة 1.4)، المونوأمينوأوكسيداز (الخطوة 1.5) أو مايو جرونوالد بالغيمزا (الخطوة 1.6).
4. تلطيخ الميلوبيروكسيديز لالمناعي
   1. إصلاح الخلايا على الشرائح بغمر الشرائح في الميثانول البارد: الأسيتون (1: 1) حل لمدة 2 دقيقة، ثم الهواء يجف الشرائح.
   2. لحصر السائل إلى المنطقة من الشريحة التي تحتوي على الخلايا، رسم كاريتاس الدوليةrcle حول الخلايا باستخدام قلم بالماء طارد.
   3. شطف الخلايا في 200 ميكرولتر من محلول برنامج تلفزيوني الباردة لمدة 10 دقيقة.
   4. منع الخلايا في 200 ميكرولتر من 3٪ BSA عازلة / PBS تحتوي على 10 ميكرولتر من المصل حمار عادي و 10 ميكروغرام / مل من النقاء مكافحة CD16 / 32 الأجسام المضادة.
   5. تطبيق 200 ميكرولتر من الميلوبيروكسيديز مكافحة فأر (مخفف إلى 20 ميكروغرام / مل في 3٪ BSA عازلة / PBS). احتضان الخلايا O / N عند 4 درجات مئوية في غرفة الرطوبة.
   6. غسل الخلايا مع 200 ميكرولتر من البرد 0.1٪ BSA / برنامج تلفزيوني.
   7. تطبيق 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة الماعز المخفف في 1/250 في 3٪ BSA / العازلة في برنامج تلفزيوني. احتضان الخلايا لمدة 2 ساعة على RT في غرفة الرطوبة.
   8. غسل الخلايا 3 مرات مع 200 ميكرولتر من 0.1٪ BSA / العازلة في برنامج تلفزيوني ومرتين في برنامج تلفزيوني الباردة.
   9. وصمة عار في نوى الخلايا مع 200 ميكرولتر من هويشت المخفف في 1/1000 في برنامج تلفزيوني (لتركيز النهائي في 1 ميكروغرام / مل) لمدة 2 دقيقة في RT.
   10. تغسل الشرائح مع المياه والسماح لهم الهواء الجاف قبل مونتينز. تطبيق قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة 1 إلى الخلايا، ضع حافة واحدة من غطاء من الزجاج على الشريحة، وبعناية خفضه على الخلايا باستخدام ملقط. اضغط بلطف على غلاف من الزجاج لإزالة أي فقاعات الهواء.
5. استريز الكيمياء الخلوية
   ملاحظة: قبل الدافئة جميع الكواشف لRT.
   1. إعداد تثبيتي
      1. لإعداد الحل السيترات، الأسيتون، الفورمالديهايد (CAF)، إضافة 2.5 مل من محلول سترات، 6.5 مل من الاسيتون و 0.8 مل من 37٪ الفورمالديهايد في زجاجة. المزيج بلطف وتخزين عند 4 درجات مئوية.
   2. النفثول AS-D Chloroacetate استريز (CAE) فحص النشاط
      1. منزوع الأيونات الماء الدافئ إلى 37 درجة مئوية.
      2. في أنبوب 50 مل، إضافة 1 مل من محلول نترات الصوديوم إلى 1 مل من محلول الصبغة. المزيج بلطف واسمحوا الوقوف لمدة 2 دقيقة. إضافة 40 مل من الماء منزوع الأيونات قبل تحسنت، 5 مل من درجة الحموضة 6.3 عازلة التركيز و 1 مل من محلول نفثول AS-D Chloroacetate. خلط ونقل إلى جرة Coplin.
      3. إصلاح الخلايا علىالشرائح (انظر القسم 1.3) لمدة 30 ثانية مع الحل CAF (راجع الخطوة 1.5.1.1)، وغسل الشرائح لمدة 45 ثانية مع الماء منزوع الأيونات.
      4. نقل الشرائح في الحل الذي تم إعداده في خطوة 1.5.2.2، واحتضان الشرائح عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في غرفة الرطوبة محمية من الضوء.
      5. تجفيف الشرائح ثم شطف لهم عن طريق الغمر في الماء منزوع الأيونات لمدة 2 دقيقة.
      6. مباين الخلايا عن طريق إضافة بضع قطرات من محلول الهيماتوكسيلين وتفرخ لهم لمدة 1 دقيقة.
      7. تغسل الشرائح مع المياه المحايدة (الرقم الهيدروجيني 7) والسماح لهم الهواء الجاف. تطبيق قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة من 2 إلى الخلايا، ضع حافة واحدة من غطاء من الزجاج على الشريحة وبعناية خفضه على الخلايا باستخدام ملقط. اضغط بلطف على غلاف من الزجاج لإزالة أي فقاعات الهواء.
   3. ألفا النفثول الزبدات استريز (الأهلي المصري) فحص النشاط
      1. دافئ α-النفثول حل الزبدات إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
      2. تمييع قرص واحد من أحمق الصوديومطقوس في 6.25 مل من الماء منزوع الأيونات.
      3. في أنبوب 50 مل، إضافة 1.5 مل من محلول قرص نتريت الصوديوم و 1.5 مل من محلول الباراروزانيلين. المزيج بلطف والسماح الحل للوقوف لمدة 5 دقائق. تكملة الحل مع 40 مل من محلول الفوسفات. جلب لدرجة الحموضة 6 بإضافة بعناية 10 N هيدروكسيد الصوديوم قطرة قطرة. إضافة 5 مل من محلول الزبدات α-النفثول، مزيج الحل كله، وتحويلها إلى جرة Coplin.
      4. إصلاح الخلايا على الشرائح لمدة 10 ثانية باستخدام حل CAF في RT وشطف لمدة 45 ثانية مع الماء منزوع الأيونات.
      5. نقل الشرائح في جرة Coplin تحتوي على الحل الذي تم إعداده في خطوة 1.5.3.2 واحتضان معا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في غرفة الرطوبة في حين محمية من الضوء.
      6. شطف الشرائح لمدة 2 دقيقة في المياه المحايدة (الرقم الهيدروجيني 7) والهواء الجاف.
      7. مباين الخلايا مع الميثيلين الأزرق حل عن طريق إضافة بضع قطرات على الشريحة واحتضان لمدة 4 دقائق.
      8. تزج الشرائح في deioالفالحة الماء لمدة 2 دقيقة والسماح لهم الهواء الجاف. لتحميل الشرائح، وتطبيق قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة 2 إلى الخلايا، ضع حافة واحدة من غطاء من الزجاج على الشريحة، وبعناية خفضه على الخلايا باستخدام ملقط. اضغط بلطف على غلاف من الزجاج لإزالة أي فقاعات الهواء.
6. مايو-جرونوالد بالغيمزا (MGG) تلطيخ
   1. وصمة عار على الخلايا (المعد في القسم 1.3) بغمر الشرائح في جرة Coplin تحتوي على حل مايو جرونوالد لمدة 3 دقائق.
   2. نقل الشرائح في جرة Coplin التي تحتوي على محلول منظم درجة الحموضة 6.8 لمدة 1 دقيقة.
   3. وصمة عار على الشرائح عن طريق وضعها في وعاء يحتوي على Coplin الحل بالغيمزا R (مخفف إلى 20/01 في درجة الحموضة حل 6.8 العازلة) لمدة 10 دقيقة. تغسل الشرائح مع المياه المحايدة (الرقم الهيدروجيني 7) لمدة 10 ثانية.
   4. استنزاف والهواء الجاف الشرائح. جبل الشرائح من خلال تطبيق قطرة واحدة من تصاعد المتوسطة 2 على الخلايا. ضع حافة واحدة من غطاء من الزجاج على الشريحة وخفض بعناية علىإلى الخلايا باستخدام ملقط. اضغط بلطف على غلاف من الزجاج لإزالة أي فقاعات الهواء.

2. في التنمية فيفو وتوصيف اللوكيميا الحادة

ملاحظة: تم الحفاظ مسانج الفئران C57BL / 6J-Ly5.1 عمرها أربعة أسابيع الإناث في ظل ظروف معينة خالية من مسببات المرض (أي في بيئة معقمة). تم حقن الفئران عندما كانت أعمارهم تتراوح بين 5 و 6 أسابيع من العمر.

1. الحقن في الوريد مع خلايا C1498
   1. حصاد الخلايا C1498 مثقف في تعليق من قبل pipetting. نقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 10 دقيقة. غسل الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة مرتين، وإعداد تعليق خلية من 10 ⁷ خلية / مل في برنامج تلفزيوني. ضع تعليق الخلوي على الجليد قبل إجراء الحقن.
   2. ضع الماوس في رادع وتنفيذ أعمال الحقن تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي.
   3. استخدام إبرة 29G مع حقنة لحقن الخلايا فيالوريد الذيل. فهم الذيل في النهاية البعيدة، وتعقيمها مع اسفنجة الشاش غارقة في الايثانول 70٪. تحقق للتأكد من عدم وجود أي فقاعات هواء في الحقنة، ثم حقن ببطء 100 ميكرولتر من تعليق خلية C1498 (10 ⁶ خلايا) في الوريد الذيل.
   4. بعد الحقن، وإزالة الإبرة من الذيل، والسيطرة على أي النزيف عن طريق الضغط مع اسفنجة شاش معقم في موقع الحقن. عودة الحيوان إلى قفصه، والتحقق بعناية الصحية خلال الساعات والأيام القادمة.
2. الرجعية جمع الدم المداري
   1. مراقبة سلوك الفئران PBS- وC1498 حقن لعلامات المرض ابيضاض الدم (على سبيل المثال، انتصاب الشعر، بمعزل عن المجموعة، وانخفاض أو أي حركات في القفص).
      ملاحظة: هذا يحدث عادة بين 17 إلى 19 يوما بعد أن يتم حقن الخلايا.
   2. أداء الرجعية جمع الدم المداري قبل القتل الرحيم (راجع الخطوة 2.2.7) تحت ظروف معقمة في تدفق الصفحيغطاء محرك السيارة وتحت مصباح التدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم.
   3. للتخدير، واستخدام الكيتامين في 150 ملغ / كغ وزيلازين في 10 ملغم / كغم. إعداد حل مخدر عن طريق تمييع 1.5 مل من الكيتامين و 0.5 مل من زيلازين في 18 مل من محلول برنامج تلفزيوني.
   4. تخدير السيطرة والفئران اللوكيميا. شروع في إجراء حقن داخل الصفاق من 200 ميكرولتر من محلول مخدر في 10 غرام من الماوس باستخدام إبرة 26G وحقنة 1 مل. تحقق من فقدان المنعكس دواسة لتأكيد التخدير.
   5. ادخال انبوب شعري في لحاظ وسطي من العين. سوف الدم ترتفع من الجيوب الأنفية المداري في الأنابيب الشعرية. السيطرة على النزيف عن طريق الضغط بلطف على العين مع اسفنجة شاش معقم.
      ملاحظة: حجم 100-200 ميكرولتر من الدم يمكن جمعها باستخدام هذه التقنية.
   6. جمع الدم في أنبوب EDTA، وتخزين العينة على الجليد قبل عزل الخلايا وحيدة النواة.
   7. الموت ببطء الماوس باستخدام خلع عنق الرحم، وانتقل إلى عزل الأجهزة (القسم 2.3).
3. الأجهزة وزنازين العزل
   1. أجهزة العزلة
      1. ضع الماوس الموت الرحيم على ظهرها على لوحة بلاستيكية واستخدام الإبر يعلقون أقدام الحيوان لتسهيل العزلة الجهاز. تطهير الماوس باستخدام الايثانول 70٪ قبل إجراء شق.
      2. باستخدام مقص العقيمة، إجراء شق بطني من جلد البطن في الرقبة. قطع طريق جدار البطن للوصول إلى الكبد. قطع طريق القفص الصدري والحجاب الحاجز للوصول إلى الرئتين. تحرك الأمعاء إلى الجانب وإزالة الطحال باستخدام مقص العقيمة وملقط.
      3. لعزل نخاع العظم، وقطع الأرجل في الجزء العلوي من عظام الفخذ فوق مفصل باستخدام مقص العقيمة. قطع الساق من عظم الفخذ عن طريق سحب بلطف، وإزالة الجلد والعضلات من العظام باستخدام ملقط ومقص.
      4. ضع كل جهاز والعظام في أنبوب 50 مل الباردة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني، ووضعها على الجليد.
   2. عزل الخلايا من الأجهزة
      1. وزن الطحال قبل تعطيل الخلايا. تعطيل ميكانيكيا الطحال والرئتين والكبد عن طريق الضغط عليها من خلال مصفاة 70 ميكرون باستخدام المكبس حقنة في أنبوب 50 مل، وجمع الخلايا في 30 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
      2. لجمع خلايا نخاع العظم، ووضع عظام الفخذ وtibias في طبق بيتري على الجليد، وقطع الأطراف باستخدام مقص العقيمة، وطرد نخاع العظام عن طريق إدخال إبرة 26G تعلق على حقنة 10 مل تحتوي على 5 مل من برنامج تلفزيوني الباردة.
         1. تعطيل خلايا نخاع العظام عن طريق تمرير تعليق الخلية من خلال إبرة / المحاقن، وتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل.
      3. أجهزة الطرد المركزي كل من الأنابيب التي تحتوي على كل من أجهزة وخلايا نخاع العظم في 350 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف، و resuspend الخلايا التي تم جمعها من الرئتين ونخاع العظام في 2 مل من تحلل العازلة (1X) والخليةق معزولة عن الكبد والطحال في 5 مل من تحلل العازلة (1X) من قبل pipetting بلطف الخليط صعودا وهبوطا. ملء أنابيب إلى 50 مل مع برنامج تلفزيوني الباردة.
      4. الطرد المركزي الخلايا في 350 x ج لمدة 10 دقيقة. resuspend الخلايا في عازلة نظام مراقبة الأصول الميدانية لتحليل التدفق الخلوي أو لإعداد الخلايا للفحص المجهري. عد الخلايا باستخدام توما غرفة عد الخلايا بعد تلطيخ لهم التريبان الأزرق.
4. خلية تلوين سطح الخلايا المعزولة من أجهزة للتحليل التدفق الخلوي
   1. في التدفق الخلوي أنبوب، تسمية 10 ⁶ الخلايا التي تم عزلها من الأجهزة مع 10 ميكروغرام / مل من النقاء مكافحة CD16 / 32 الأجسام المضادة في 100 ميكرولتر من FACS العازلة.
   2. 10 ⁶ خلايا نخاع العظام، وإضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة التالية أو مجموعات من الأجسام المضادة والضوابط نمط إسوي يناظرها المخفف في المخزن FACS: مكافحة CD11b / مكافحة CD3 (1) / مكافحة Ly6C / مكافحة Ly6G (2)، مكافحة B220 (1) /anti-CD45.2/anti-CD19، ومكافحة CD115 / مكافحة CD3 (1) / لTI-Ly6C / مكافحة Ly6G (2)، ومكافحة CD45.2، ومكافحة Ly6G (2)، ومكافحة CD11b، ومكافحة CD115 أو مكافحة CD19 وحدها لضبط التعويض.
   3. لsplenocytes، إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة التالية والضوابط نمط إسوي يناظرها المخفف في المخزن FACS: مزيج من مكافحة CD11b / مكافحة CD3 (1) / مكافحة Ly6C / مكافحة Ly6G (2)، ومكافحة B220 (1 ) /anti-CD45.2/anti-CD19، ومكافحة CD45.2، ومكافحة Ly6G (2)، ومكافحة CD11b أو مكافحة CD19 لإعدادات التعويض.
   4. لخلايا الرئة والكبد، إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة لمكافحة CD45.2 وسيطرتها نمط إسوي المقابلة المخفف في 1/100 في FACS العازلة.
   5. احتضان كل الحلول خلية لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
   6. غسل الخلايا بإضافة 2 مل من FACS العازلة إلى كل أنبوب. أنابيب الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 x ج والتخلص من طاف قبل pipetting. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
   7. resuspend الخلايا المسمى في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الباردة. تبقي الخلايا على الجليد ومحمية من الضوء قبل تنفيذ التدفق الخلوي للميلانquisition وتحليل ^10.
5. عزل الخلايا وحيدة النواة في الدم وتلطيخ مناعي لتحليل التدفق الخلوي
   1. قبل البدء في البروتوكول، ما قبل الحارة حل فصل لRT.
   2. نقل عينة الدم (100-200 ميكرولتر، التي تم الحصول عليها من الخطوة 2.2) في أنبوب microcentrifuge، وإضافة PBS / 1 ملم EDTA حل حتى حجم الحل هو 500 ميكرولتر. طبقة بعناية 500 ميكرولتر من فصل الحل تحت محلول يحتوي على الدم باستخدام إبرة 30G وحقنة 1 مل. لا تخلط الدم والحل الفاصل.
   3. أنابيب الطرد المركزي في 800 x ج (بدون فرامل) لمدة 20 دقيقة في RT. بعد الطرد المركزي، وجمع عصابة الخلوية (الطبقة البيضاء مبهمة) باستخدام ماصة. نقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge.
      ملاحظة: طبقة بيضاء غير شفافة تحتوي على الخلايا الليمفاوية وكذلك حيدات ويظهر بين الطبقة السفلى - الحل الفاصل - والطبقة العليا.
   4. إضافة 1 ملالحل برنامج تلفزيوني، وأجهزة الطرد المركزي أنبوب في 350 x ج لمدة 10 دقيقة. Resuspend الخلايا في 600 ميكرولتر من FACS العازلة.
   5. إضافة 10 ميكروغرام / مل من النقاء مكافحة CD16 / 32 الأضداد، وتوزيع 100 ميكرولتر من تعليق خلية في ستة أنابيب منفصلة (100 ميكرولتر لكل منهما).
   6. تسمية الخلايا مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة التالية أو ضوابط نمط إسوي المرتبطة بها مخففة في FACS العازلة: مزيج من مكافحة CD3 (1) / مكافحة B220 (1) /anti-CD45.2 ومكافحة Ly6C / مكافحة CD115 /anti-CD45.2 أو مكافحة CD45.2 ومكافحة CD115 وحدها لضبط التعويض.
   7. احتضان كل من الأنابيب عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
   8. غسل الخلايا بإضافة 2 مل من FACS العازلة لكل أنبوب، ثم الطرد المركزي الأنابيب لمدة 10 دقيقة في 350 x ج، وتجاهل طاف باستخدام ماصة.
   9. resuspend الخلايا المسمى في 500 ميكرولتر الباردة برنامج تلفزيوني. تبقي الخلايا على الجليد ومحمية من الضوء قبل تنفيذ التدفق الخلوي اقتناء وتحليل ^10.
6. إعداد تعليق خلية نخاع العظام على الشرائح للفحص المجهري
   1. اتبع الخطوات الموضحة في القسم 1.3، ولكن في الخطوة 1.3.1، استخدم 10 ⁵ خلايا نخاع العظم، وفي الخطوة 1.3.4، وتدور الخلايا في كل من المجلسين على 72.26 x ج لمدة 10 دقيقة.
7. المقايسات النشاط استريز باستخدام خلايا نخاع العظام
   1. لإجراء فحوصات نخاع العظم استريز الكيمياء الخلوية، والمضي قدما من الخطوات 1.5 إلى 1.5.3.7.
8. مايو جرونوالد تلطيخ بالغيمزا من خلايا نخاع العظام
   1. وصمة عار خلايا نخاع العظام، واتباع البروتوكول هو موضح في القسم 1.6، ولكن في الخطوة 1.6.1، احتضان الشرائح في حل مايو جرونوالد لمدة 5 دقائق.

النتائج

لتوصيف نموذج C1498 الماوس، أننا تقدمنا ​​مع اثنين من الخطوات الرئيسية. أولا، كانت تتميز الخلايا C1498 لتحديد المكونة للدم النسب ونضوج المرحلة في المختبر (الشكل 1). ثم تم حقن هذه الخلايا في الفئران مسانج، وجرى تقييم طبيعة المرض ابيضاض الدم الناجم عن لتحديد ملامح مختلفة: ابيضاض الدم تسلل خلية، ملامحهم لتقدير حجم الخلايا المكونة للدم (ناضجة والأسلاف / السلائف) في نخاع العظام، والترددات من C1498 الخلايا والخلايا المكونة للدم الناضجة في الدم وتقييم تورم الجهاز (في الطحال والكبد، والرئتين) وتكوين الخلايا.

لتوصيف الظواهر الخلية C1498 في المختبر، وصفت الخلايا مع أجسام مضادة موجهة ضد الجزيئات التي يتم التعبير عنها بواسطة السلائف المكونة للدم والخلايا الناضجة (الجدول 1)، وتم تحليل النتائج باستخدام cytomet تدفقراي. وكانت الخلايا C1498 إيجابية للتعبير عن سطح الخلية من ماك-1 (CD11b / CD18) (~ 7٪)، B220 (> 25٪)، وعرضوا التعبير داخل الخلايا CD3ε، مستقبلات الخلايا التائية سلاسل (TCR) Vβ وماك -3 (أرقام 2A و B). وكانت الخلايا سلبية على علامات سطح الخلية Ly6G، Ly6C، CD115، CD21 / CD35، CD19، CD3، CD4، CD8، NK1.1، وعموم NK الجزيئات وللتعبير داخل الخلايا CD4 و CD8 (لا تظهر البيانات) . ثم تم فحصها للعلامات من الخلايا الجذعية المكونة للدم والأسلاف (الجدول 1). كانوا السلبي للتعبير عن سطح الخلية من CD117، CD34، هيئة السلع التموينية-1، CD150 وCD16 / 32 أيضا (لا تظهر البيانات). ثم تم اختبار هذه الخلايا اللوكيميا لتحديد التعبير عن التصاق، تقديم المستضد والجزيئات شارك في تنشيطية. أعربت خلايا علامات سطح LFA-1 (CD11a / CD18)، CD44، CD31 (PECAM-1)، وH-2D ^ب وكانت سلبية لمعقد التوافق النسيجي الكبير الثاني، CD80، CD86 وCD274 (لا تظهر البيانات). C1498 خلايا تيherefore أعرب كلا النخاعي (ماك-1، ماك 3) وعلامات اللمفاوية (B220، CD3، TCR).

لتوصيف أفضل نسبهم المكونة للدم، وجرى تقييم التعبير الميلوبيروكسيديز باستخدام المناعي المجهري. كافة الخلايا كانت إيجابية للالميلوبيروكسيديز، التي تحققت أصل النخاعي بها (الشكل 3A). والغالبية العظمى من الخلايا أيضا ملطخة إيجابية لالمونوأمينوأوكسيداز α-النفثول الزبدات (الشكل 3B، لوحة اليسرى)، وبعضهم ملطخة للالنفثول AS-D المونوأمينوأوكسيداز chloroacetate (الأسهم السوداء) (الشكل 3B، اللوحة اليمنى). وتشير النتائج إلى أن الخلايا تحتوي على خليط من خلايا الوحيدات والمحببات. بعد تم إجراء مايو جرونوالد تلطيخ بالغيمزا، لوحظت خلايا C1498 لعرض شكل يشبه الانفجار مع ارتفاع نسبة نواة-هيولية، 3-5 النويات في النواة، هالة محيط بالنواة، والعديد من الفجوات والسيتوبلازم مستقعد (الشكل 3C ). عشرلنا، ويتكون خط الخلية C1498 من monoblasts وmyeloblasts.

والخلايا C1498 (CD45.2 ⁺⁾ ثم حقنها عن طريق الوريد إلى CD45.1 ⁺ الفئران. توفي الفئران بعد 17 إلى 19 يوما تم حقن الخلايا. تمت التضحية هذه الفئران بحيث يمكن تحليل نوع سرطان الدم قبل وفاته من المرض. والسيطرة على الفئران التي حقنت مع برنامج تلفزيوني تم تحليلها، عند نقاط نفس الوقت للمقارنة. الفئران حقن الخلايا C1498 عرض تسلل الهائل للخلايا C1498 في نخاع العظام، كما يدل على ذلك ظهور مثل انفجار الخلايا بعد إجراء مايو جرونوالد بالغيمزا تلطيخ (الشكل 4A). وهم ايضا الحفاظ حيدي والظواهر المحببات (الشكل 4B و C)، مما يدل على تراكم خلايا monoblastic وأرومية نقوية الذي هو سمة من سرطان الدم وحيدي نقوي حاد.

لدetermine سواء النخاعية أعداد الخلايا المكونة للدم كانت أقل في أعقاب غزو خلايا اللوكيميا، CD45.2 ⁺ C1498 الخلايا، B الليمفاوي، وحيدي والسكان المحببات (بما في ذلك الأسلاف، السلائف والخلايا الناضجة)، وكميا باستخدام تلوين مناعي والتدفق متعدد حدودي تحليل الخلوي. خلايا اللوكيميا تمثل 16-36٪ من الخلايا المكونة للدم (لا تظهر البيانات). وجميع أنواع الخلايا الأخرى الموجودة بأعداد أقل بكثير في حقن الفئران C1498-مما كانت عليه في حقن الفئران برنامج تلفزيوني (بنسبة 5 أضعاف في المتوسط ​​لمجموعات فرعية الخلايا البائية، 4 أضعاف في المتوسط ​​للخلايا المحببات و 3 أضعاف في المتوسط لمجموعات فرعية الوحيدات) (الشكل 5A إلى C).

وأظهر التحقيق في ترددات الخلايا وحيدة النواة في عينات الدم اللوكيميا والتحكم الماوس أنها تحتوي على نسبة مماثلة من الخلايا الليمفاوية (الشكل 6A) ولكن تردد أعلى من وحيدي وخلايا اللوكيميا. وهذه الخصائص هي تمثيلية من سرطان الدم الحاد وحيدي نقوي ¹¹ (الشكل 6B).

ومن بين الميزات الأخرى من سرطان الدم الحاد وحيدي نقوي ^12، وحقن الفئران C1498-قدمت مع كبد تورم (تضخم الكبد) والرئتين والطحال (تضخم الطحال) (الشكل 7A). تم الكشف عن ترددات مختلفة من الخلايا CD45.2 ⁺ C1498 في هذه الأجهزة باستخدام مناعي تلطيخ وتحليل التدفق الخلوي (الشكل 7B). كما تضخم الطحال يمكن أن تنجم عن ارتفاع أعداد حيدات تسلل، ونحن أيضا تقدر نسبة السكان الطحال. وكانت أعداد الخلايا في B الليمفاوي، وحيدي وكسور الخلايا المحببة أكبر من ذلك بكثير، بمعدل 2 أضعاف، 2.5 أضعاف و 3 أضعاف، على التوالي، في الطحال اللوكيميا منها في الطحال التحكم (الشكل 7C).

رقيقة الصفحات = "1">
وقد حددت لأول مرة الشكل 1. التمثيل التخطيطي لبروتوكول إعداد للتميز في خطوط خلايا مستنبتة في المختبر C1498 وفي أوصاف الجسم الحي من اللوكيميا الحادة. والنسب المكونة للدم ومرحلة تمايز الخلايا C1498-مثقف الأنسجة. ثم تم حقن الخلايا C1498 في الفئران مسانج للحث على تطوير سرطان الدم الحاد. تم إجراء عزل نخاع العظام والدم المحيطي والطحال والكبد وأنسجة الرئة لتحديد الترددات، الظواهر والتغيرات المورفولوجية بعد الخلايا تسلل C1498. رابعا: MGG الوريد:-مايو جرونوالد بالغيمزا الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إعلان / 54270 / 54270fig2.jpg "/>
وترد الجزيئات التي ارتبطت المكونة للدم تمايز الخلايا الناضجة الشكل 2. تحليل المظهري من C1498 الخلايا بعد في المختبر الثقافة. التدفق الخلوي الممثل المؤامرات نقطة ورسوم بيانية من سطح الخلية (A) وبين الخلايا (ب) C1498-التعبير عنها. وكان حصاد الخلايا C1498 من الثقافات، وغسلها وصفت باستخدام الأجسام المضادة الفلورسنت التي كانت محددة لسطح الخلية CD11b، CD18 وعلامات B220 أو ضوابط نمط إسوي بهم. لتلطيخ الخلايا، وإصلاح الخلايا، permeabilized وصفت باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد ماك-3، CD3ε، وحاتمة المشتركة للTCR (مستقبلات خلايا T) سلسلة Vβ أو ضوابط نمط إسوي بهم. أجريت تحليلات باستخدام النابضة مع الخلايا الحية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ntent "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 ">
الرقم 3. وظيفية والمورفولوجية توصيف الخلايا مثقف C1498. تم حصاد الخلايا C1498 من الثقافات وطرد على الشرائح للفحص المجهري. (A) قد أنجز تلطيخ للتعبير الميلوبيروكسيديز باستخدام المناعي. واستخدمت (ب) ردود الفعل Cytochemical لتحليل استريز α-النفثول الزبدات (الأهلي المصري) والنفثول AS-D chloroacetate استريز (CAE) الأنشطة في الخلايا C1498. واعتبرت الخلايا لتكون إيجابية لكل التسمية عند البني والأحمر الأرجواني، حبيبات هيولية كبيرة، على التوالي، لوحظت. (C)-مايو جرونوالد بالغيمزا (MGG) تلطيخ C1498 الخلايا. لكل تجربة تلطيخ، يشار إلى التكبير موضوعي المجهر. كل صورة ممثل من ثلاثة تجارب منفصلة.large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. نخاع العظم الأشكال التضاريسية في PBS- والفئران C1498-حقن. وقد تم عزل خلايا نخاع العظام من PBS- والفئران المحقونة خلية C1498 وطرد على الشرائح للفحص المجهري. (A)-مايو جرونوالد بالغيمزا (MGG) تلطيخ (B ) استريز α-النفثول الزبدات (الأهلي المصري) وجيم) النفثول (AS-D تم تقييم chloroacetate استريز (CAE) وظائف باستخدام الكيمياء الخلوية. في لوحة و، والفرقة (غير ناضج) أو مجزأة العدلات (الناضجة) هي أقل وضوحا في نخاع العظم من فئران حقنت C1498-من حقن الفئران برنامج تلفزيوني. لوحة B و C تشير إلى أن هناك تراكم للخلايا الوحيدات والمحببات في نخاع العظام اللوكيميا مقارنة بالأعداد التي لوحظت في نخاع العظام السيطرة. جميعأجريت التحاليل المجهرية باستخدام الهدف التكبير 100X. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5. التحليل الكمي للسكان النخاع في PBS- والفئران C1498 حقن. وقد تم عزل خلايا نخاع العظام من PBS- والفئران المحقونة خلية C1498 وقدر بعد تم إجراء عد الخلايا. تم تحديد الترددات من السكان مختلفة من الخلايا بعد المناعية والخلايا بوابات تدفق الحية تحليل الخلوي. وشملت (A) في مجموعات فرعية الخلايا البائية CD19 ⁺ B220 ⁺ الخلايا في مراحل من الخلايا الموالية-B إلى أن تنضج الخلايا الليمفاوية B (ب) الخلايا المحببة في CD3 ^- وCD11b ⁺ Ly6G ⁺ الأنساب، والتي تضمنت السلائف ل. الثانية المحببة غير الناضجة والناضجة (C) وتم تحديد مجموعات فرعية الوحيدات كما CD3 ^- CD115 ⁺ وشملت الخلايا في السلف إلى أن تنضج مراحل الوحيدات. ن ترد = 7 الفئران / مجموعة، والبيانات ورسوم بيانية تبين الوسائل ± SEM. ***، ف <0.0001 و**، ف <0.01، اختبار أونبايريد الطالب تي مقارنة PBS- وحقن الفئران C1498. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم تحليل 6. الدم من مجموعات فرعية خلية وحيدة النواة في PBS- والفئران C1498 حقن. تدفق التمثيلي الخلوي المؤامرات نقطة من (A) T و B نسب الخلايا اللمفاوية، التي تم تعريفها على التوالي كما CD3 ⁺ وB220 ⁺ الخلايا في PBS- وC1498 خلية حقن. الفئران (B) ترددات خلية الوحيدات في ابيضاضي C1498 والسيطرة وتم تحديد (PBS) الفئران عن طريق تحليل CD115 ⁺ Ly6C ^- وCD115 ⁺ Ly6C خلايا ^عالية. تم إجراء التحليل من قبل النابضة الخلايا الحية. لمقارنة الفئران اللوكيميا والسيطرة، CD45.2 ⁺ استبعدت C1498 الخلايا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7. تقدير الطحال السكان في اللوكيميا ومراقبة الفئران. (A) مقارنة الصور التمثيلية للالكبد والرئة والطحال تورم في الفئران ابيضاض الدم للسيطرة على الفئران. تم جمع الطحال وزنه، واحصي splenocytes بعد تعطل الأنسجة. (ب) رسم بياني يمثل الترددات خلية اللوكيميا في مهرجان دبي السينمائي الدوليأجهزة erent بعد تم تنفيذ المناعية للCD45.2 ⁺ الخلايا وتم تحليل النتائج باستخدام التدفق الخلوي. (C) التقديرات من الطحال B، أعداد الخلايا المحببة والوحيدات بعد المناعية والتدفق الخلوي النابضة تحليل أجريت لتحديد الحية CD19 ⁺ B220 ⁺ ، CD3 ^- CD11b ⁺ Ly6G ^+، CD3 ^- CD11b ⁺ Ly6C ^- وCD3 ^- CD11b ⁺ Ly6C خلايا ^عالية. القضبان على نطاق وتعرض لالرئتين، الطحال والكبد وتشير 1 سم. .. ن = 5-8 الفئران / مجموعة، والبيانات تتمثل في رسوم بيانية كوسيلة ± SEM *، ف <0.05، **، ص الفئران = 0.0033، اختبار أونبايريد الطالب تي مقارنة PBS- وC1498 حقن الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

نوع من الخلايا	غشاء أو بين الخلايا جزيئات
السلائف والخلايا الناضجة
الخلايا القاتلة الطبيعية	NK1.1 +، لعموم NK +
خلايا NKT	NK1.1 +، لعموم NK +، TCR Vbeta + (8.2)، CD3 +
الخلايا الليمفاوية T	TCR Vbeta +، CD3 +، CD4 +، CD8 +
الخلايا البائية السلائف والخلايا الليمفاوية B	B220 +، CD19 +، CD21 / 35 +
السلائف المحببات والمحببة	Ly6G +، ماك-1 +، + CD11b
السلائف الوحيدات وحيدات / الضامة	CD11b +، ماك-1 +، ماك 3 +، CD21 / 35 +، CD115 +، Ly6Chi
الأسلاف
الأسلاف متعددة القدرات	CD117 + هيئة السلع التموينية-1+ CD34 + (Lin- CD150-)
الأسلاف متعدد القدرات معبي اللمفاوية	CD117hi هيئة السلع التموينية، 1hi CD127 + (Lin-)
الأسلاف اللمفاوية المشتركة	CD117lo هيئة السلع التموينية، 1lo CD127 + (Lin-)
الأسلاف النخاعي المشتركة	CD16 / 32lo CD117 + CD34int (Lin- هيئة السلع التموينية-1-)
الأسلاف-محببة بلعم	CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (Lin- هيئة السلع التموينية-1-)
الأسلاف-النواء محمر	CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (Lin- هيئة السلع التموينية-1-)
الخلايا الجذعية المكونة للدم	CD117 + هيئة السلع التموينية-1 + CD150 + (Lin- CD34-)

الجدول 1. علامات الأنساب الخلية المكونة للدم والتمايز.
CD: مجموعة من التمايز. لين: علامات من الخلايا الناضجة. لو:انخفاض التعبير. مرحبا: ارتفاع التعبير. الباحث: التعبير المتوسط. NK: الخلايا القاتلة الطبيعية؛ TCR: مستقبلات الخلايا التائية.

Discussion

في دراسات سابقة، وقد وصفت خط الخلية C1498 بمثابة محفز من المحببات الحاد ^{5، 6} حيدي نقوي أو NKT ⁷ خلية سرطان الدم. ومع ذلك، كانت البيانات التوضيحية في الأدب إما غائبة أو غير مكتملة. بروتوكول المعروضة هنا يستخدم تقنيات مختلفة، مثل التدفق الخلوي، المناعي، MGG تلطيخ والمقايسات cytochemical، وتوصيف الخلايا C1498 مثقف وتحديد طبيعة سرطان الدم الذي يتسبب في الفئران بعد حقنها.

عندما كنا phenotyped في المختبر مثقف خلايا C1498 بعد المناعية والتدفق الخلوي وأجريت التحاليل، لاحظنا بعض القيود بسبب هذه الخلايا أعربت بعض علامات المكونة للدم سطح الخلية التي تم وصفها سابقا في الأدب ^6،7. في اتفاق مع نتائجنا، لم ابيل وآخرون. تراع التعبير سطح الخلية ناضجة TCR على خلايا C1498 باستخدام cytomet تدفقراي تلطيخ. ومع ذلك، فإنها تعتبر في ان يكون في خط الخلية NKT بعد الكشف عن CD3ε وTCRVβ8.2 من mRNAs ^7. نحن أيضا لاحظ التعبير داخل الخلايا سلاسل TCRVβ والجزيئات CD3ε في معظم الخلايا (> 70٪)، ولكن لا يمكن تحديد الأنساب الخاصة بهم للدم لأنه كان هناك أيضا ما يصاحب ذلك التعبير داخل الخلايا جزيء ماك-3.

أظهر الميلوبيروكسيديز، MGG تلطيخ والتقييمات لتحليل المونوأمينوأوكسيداز الوظيفية باستخدام الكيمياء الخلوية أن خط الخلية C1498 زيارتها أصل النخاعي وكان يتألف من monoblasts وmyeloblasts. وكانت هذه النتائج متطابقة مع نسبة ماك 3 ⁺ الخلايا التي تم الحصول عليها في تحليل التدفق الخلوي تلطيخ. وإن لم يكن الكمية، وتمثل هذه الخطوات التجارب الرئيسية التي يتعين القيام بها. في الواقع، إلا أنها تبقى، حتى الآن، أفضل الطرق القائمة لوصف مرحلة النسب وتمايز الخلايا المكونة للدم التي تعبر أو لا و مصريات علامات المظهرية محددة.

التدفق الخلوي تلطيخ كان مفيدا لإظهار تطور سرطان الدم الحاد في الفئران مسانج بعد حقنت C1498 الخلايا عن طريق الوريد. كانت CD45.2 ⁺ C1498 الخلايا التي تسللت إلى داخل الدم المحيطي ومختلف أجهزة معزولة، وكانت مصممة تردداتها. تم إجراء تقدير أيضا لتحليل النخاع الكامنة وخلايا الطحال بعد المناعي. ووجهت القيود عندما تم فحص النمط الظاهري خلية C1498 في الأجهزة كما أعرب بعض علامات المكونة للدم (سوى عدد قليل منهم B220 ^+). لتحديد طبيعة سرطان الدم الحاد لوحظ، مايو جرونوالد بالغيمزا تلطيخ وتحليلا للأنشطة وحيدي وأجريت المونوأمينوأوكسيداز المحببات باستخدام نخاع العظام. وأظهرت النتائج أن C1498 خلايا الحفاظ التشكل نقوي الأرومات وmonoblastic وظيفة، وكشف عن ظهور سرطان الدم وحيدي نقوي.

الصورة = "jove_content"> ومقابل خطوات حاسمة الموصوفة في هذا البروتوكول، وينبغي إيلاء اهتمام خاص لدرجة الحموضة عند تنفيذ ردود الفعل cytochemical وMGG تلطيخ بسبب أخطاء في الرقم الهيدروجيني يمكن أن تؤدي إلى تفسيرات غير صحيحة للنتائج. على سبيل المثال، α-النفثول الزبدات النشاط استريز غير محددة لخلايا الوحيدات فقط في الرقم الهيدروجيني من 6.0 لالمحببة والخلايا الليمفاوية ويمكن أيضا وصمة عار ايجابية لهذا الاختبار في قيم درجة الحموضة العالية. تثبيت مكان الخلايا لا ينصح قبل إجراء MGG تلطيخ، وأظهرنا أن تثبيت CAF الوحيد قدمت نتائج مرضية عند تنفيذ المونوأمينوأوكسيداز ردود الفعل cytochemical باستخدام C1498 الخلايا. للحفاظ على التعبير عن جزيء CD115 وكشف من خلال التدفق الخلوي، يجب أن تبقى كل من العينات (الخلايا مثل الدم ونخاع العظام، والطحال) على الجليد أثناء العملية. إذا لوحظ أي تلطيخ في التدفق الخلوي و / أو تجارب المناعي، وإشارة من الأجسام المضادة، على إعادة التخزينيجب أن يتم التحقق الثناء والتخفيفات الخاصة بهم. وقد تم تحديد المراجع المحددة في الجدول المواد / المعدات اللازمة لالتدفق الخلوي أو المناعي التطبيقات. و/ الأجسام المضادة الثانوية الابتدائي أو fluorophores من مترافق قد فقدوا نشاطهم بسبب التخزين غير المناسب (على سبيل المثال، والتعرض للضوء أو الحرارة)، التخفيف غير لائق، واسعة النطاق تجميد / الذوبان أو استخدام مخازن الملوثة. تشغيل الضوابط الإيجابية للتأكد من أنها تعمل بشكل صحيح. استخدام الماوس نخاع العظم أو الخلايا المشتقة الطحال التي هي معروفة للتعبير عن البروتينات المثيرة للاهتمام. لتجنب خلفية عالية وتلطيخ غير محددة، تأكد من أن الخلايا يتم غسلها بشكل صحيح والاحتفاظ بها في الرطوبة العالية (لالمناعي) وأن الأجسام المضادة والمخفف طبقا للتعليمات. استخدام نفس التركيز والتخفيف عن الأجسام المضادة isotype السيطرة والأجسام المضادة الأولية لتحديد دقيق لمستوى الخلفية في العينة. للتجارب استريز الكيمياء الخلوية، والكواشف يمكن اختبار باستخدام الشرائح الموجبة والسالبة تحكم يحتوي الماوس المنقى المحببات الطحال (Ly6G ⁺⁾ وحيدي (CD115 ⁺⁾ الخلايا.

وأظهر للإجراءات المنصوص عليها في هذه الدراسة أن العديد من الميزات اللوكيميا لوحظ في الفئران بعد حقن الخلايا C1498 المشتركة بصمات المشتركة مع الإنسان سرطان الدم الحاد وحيدي نقوي ^11،12. أسفرت خلايا اللوكيميا غزا في الحد من الناضجة وغير الناضجة (الأسلاف والسلائف) الخلايا المكونة للدم النخاع. خلايا C1498 موجودة في وتيرة عالية (> 20٪) في الدم المحيطي، وكذلك خلايا الوحيدات. وقد لوحظ تضخم الكبد وتضخم الطحال أن تنجم عن تسلل خلايا اللوكيميا، ولوحظت زيادات كبيرة في الخلايا الليمفاوية B وخلايا الدم النخاعي أيضا لمرافقة تضخم الطحال. لوحظ قلة الصفيحات أيضا عندما قدرت أعداد الصفائح الدموية باستخدام محلل أمراض الدم.

وكان المعرضن، استخدام في التجارب المختبرية، أن C1498 الخلايا وتمنع تكون الدم الفئران العادية عن طريق إفراز العوامل القابلة للذوبان ^(13). في عدة نماذج ورم الماوس، وقد برزت أيضا خلايا الدم النخاعي غير ناضجة (بما في ذلك وحيدي والخلايا المحببة) لترحيل من نخاع العظم لالطحال، حيث أنها تمنع المضادة للورم تنشيط الخلايا T محددة وانتشار ^14. وهكذا، فإن انخفاض في الخلايا المكونة للدم الذي لوحظ في نخاع العظام قد تكون ناجمة عن أي نقص في تكون الدم و / أو من هجرتهم. هذه الآلية الأخيرة يمكن أن تفسر وجود كثرة الوحيدات في الدم المحيطي أو مراقبة كسور الدم النخاعي تضخم في الطحال. ومن الممكن أيضا تصور أن هذه الخلايا يمكن أن استمدت من تحسين تكون الدم الطحال. في الواقع، في ظل ظروف مستقرة، وقد تم تحديد بعض مجموعات فرعية من الخلايا باء الطحال كما السلائف ناضجة ب اللمفاويات ^15. وعلاوة على ذلك، في ظل ظروف التهابات، ميدوقد تبين أن الخلايا الجذعية ullary والأسلاف في الانتقال إلى الطحال للحث على إنتاج حيدات ناضجة ^16. هذا البروتوكول لا يسمح لنا لاستخلاص استنتاجات بشأن الآليات التي تشارك في تطوير سرطان الدم، وينبغي استخدام المقايسات الفنية وكذلك الجزيئية إضافية للقيام بذلك. ومع ذلك، تتضمن هذه البيانات معلومات مفصلة عن المظاهر السريرية لسرطان الدم وحيدي نقوي حاد، وسوف تساعد الباحثين على تقييم وفهم آثار العوامل العلاجية الجديدة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C1498 cell line	ATCC	TIB 49
C57BL/6J-Ly5.1	Charles River	B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl
Cells culture reagents
2-Mercaptoethanol, Gibco	ThermoFisher Scientific	21985
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	10270
HEPES, Gibco (1 M)	ThermoFisher Scientific	15630
Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco	ThermoFisher Scientific	11140
Penicillin-Streptomycin, Gibco	ThermoFisher Scientific	15140
RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement)	ThermoFisher Scientific	61870
Sodium Pyruvate, Gibco (100 mM)	ThermoFisher Scientific	11360
Flow cytometry staining reagents
anti-mouse B220 APC (1)	ebiosciences	17-0452	clone RA3-6B2, final dilution 1/100
anti-mouse B220 biotin (2)	ebiosciences	13-0452	clone RA3-6B2, 1/400
anti-mouse CD3 eFluor450 (1)	ebiosciences	48-0032	clone 17A2, 1/100
anti-mouse CD3 PE (2)	BD biosciences	555275	clone 17A2, 1/100
anti-mouse CD3 PE-Cy5 (3)	ebiosciences	15-0031	clone 145-2C11, 1/100
anti-mouse CD4 APC (1)	ebiosciences	17-0041	clone GK1.5, 1/500
anti-mouse CD4 PE (2)	ebiosciences	12-0041	clone GK1.5, 1/200
anti-mouse CD8 biotin (1)	ebiosciences	13-0081	clone 53-6.7, 1/100
anti-mouse CD8 eFluor450 (2)	ebiosciences	48-0081	clone 53-6.7, 1/500
anti-mouse CD11a biotin	ebiosciences	13-0111	clone M17/4, 1/100
anti-mouse CD11b PE	ebiosciences	12-0112	clone M1/70, 1/200
anti-mouse CD16/32 biotin	ebiosciences	13-0161	clone 93, 1/400
purified anti-mouse CD16/32 (FcR blocking)	BD biosciences	553141	clone 2.4G2
anti-mouse CD18 biotin (1)	ebiosciences	13-0181	clone M18/2, 1/100
anti-mouse CD18 FITC (2)	ebiosciences	11-0181	clone M18/2, 1/50
anti-mouse CD19 PE	ebiosciences	12-0193	clone 1D3, 1/200
anti-mouse CD21/35 PE	ebiosciences	12-0211	clone 8D9, 1/50
anti-mouse CD31 PE	ebiosciences	12-0311	clone 390, 1/100
anti-mouse CD34 eFluor660	ebiosciences	50-0341	clone RAM34, 1/20
anti-mouse CD44 PE	BD biosciences	553134	clone IM7, 1/50
anti-mouse CD45.2 FITC	ebiosciences	11-0454	clone 104, 1/100
anti-mouse CD49b/Pan NK PE	BD biosciences	553858	clone DX5, 1/50
anti-mouse CD80 biotin	ebiosciences	13-0801	clone 16-10A1, 1/200
anti-mouse CD86 biotin	ebiosciences	13-0862	clone GL1, 1/200
anti-mouse CD107b (Mac-3) PE	ebiosciences	12-5989	clone M3/84, 1/40
anti-mouse CD115 PE	ebiosciences	12-1152	clone AFS98, 1/100
anti-mouse CD117 eFluor450	ebiosciences	48-1171	clone 2B8, 1/100
anti-mouse CD127 PE	ebiosciences	12-1271	clone A7R34, 1/100
anti-mouse CD150 APC	ebiosciences	17-1501	clone 9D1, 1/20
anti-mouse CD274 (PD-L1) biotin	ebiosciences	13-5982	clone MIH5, 1/200
anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE	ebiosciences	12-5981	clone D7, 1/100
anti-mouse Ly-6C APC	ebiosciences	17-5932	clone HK1.4, 1/200
anti-mouse Ly-6G  (Gr-1) biotin (1)	ebiosciences	13-5931	clone RB6-8C5, 1/400
anti-mouse Ly-6G FITC (2)	ebiosciences	11-9668	clone 1A8, 1/50
anti-mouse MHC class I (H-2Db) biotin	ebiosciences	13-5999	clone 28-14-8, 1/50
anti-mouse MHC class II (I-A/I-E) PE-Cy5	ebiosciences	15-5321	clone M5/114.15.2, 1/1000
anti-mouse NK1.1 PE	BD biosciences	557391	clone PK136, 1/50
anti-mouse TCRVb FITC	BD biosciences	553170	clone H57-597, 1/50
streptavidin PE-Cy5	ebiosciences	15-4317	1/200
Immunofluorescence staining reagents
Anti-mouse myeloperoxidase (heavy chain antibody)	Santa Cruz Biotechnology	sc-16129	1/10 (20 µg/ml)
anti-goat IgG (Texas Red coupled antibody)	Jackson Immunoresearch	705-076-147	1/250
Normal donkey serum	Jackson Immunoresearch	017-000-001
Hoechst solution	BD Biosciences	561908	1/1000
Mounting medium 1 (Fluoromount)	Sigma-Aldrich	F4680
Acetone	VWR	20066
Methanol	Merck Millipore	106009
Esterase cytochemical staining reagents
Naphtol AS-D chloroacetate solution	Sigma-Aldrich	911
Dye solution (Fast Red Violet LB Base solution)	Sigma-Aldrich	912
pH6.3 buffer concentrate (TRIZMAL)	Sigma-Aldrich	913
Sodium nitrite solution	Sigma-Aldrich	914
Citrate solution	Sigma-Aldrich	915
Hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	GHS3
Acetone	VWR	20066
Formaldehyde solution, 37%	Sigma-Aldrich	F1635
α-naphthyl butyrate solution	Sigma-Aldrich	1801
Phosphate buffer solution	Sigma-Aldrich	1805
Sodium nitrite Tablet	Sigma-Aldrich	1809
Pararosaniline solution	Sigma-Aldrich	1804
Methylene blue solution	Sigma-Aldrich	1808	1/10
mounting medium 2 (Clearmount)	Invitrogen	00-8010
May-Grünwald Giemsa staining reagents
May-Grünwald solution	RAL Diagnostics	320070
Giemsa R solution	RAL Diagnostics	320310	1/20
pH 6.8 buffer solution	RAL Diagnostics	330368
Others materials, reagents and equipment
Ketamine 1000 (100 mg/ml)	VIRBAC	3597132111010
Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/ml)	CEVA
Bovin albumin serum (BSA) powder	ThermoFisher Scientific	BP671
PBS solution (1x concentrate)	ThermoFisher Scientific	14190
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	158127
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
Ultra Pure 0.5 M EDTA solution, pH 8.0	ThermoFisher Scientific	15575
Separating solution (Pancoll Mouse)	PANBIOTECH	P04-64100
Lysis buffer (Red Blood Cells Lysing Buffer) (10x)	BD Biosciences	555899	1/10
NaOH 10 N	ThermoFisher Scientific	SS267
Trypan blue solution (0.4 %)	ThermoFisher Scientific	15250-061	1/2
50 ml tube (Falcon)	Fisher Scientific	14-432-22
70 µm Cell Strainer (Falcon)	Corning Life Sciences	352350
Chamber & filter card (EZ Cytofunnel Shandon)	Thermo Scientific	A78710003
Microscope Cover Glasses, 24 x 24mm	Knittel Glass	VD1 2424 Y100
Slides (Starfrost - ground edges 90)	Knittel Glass	VS1137# 077FKB
EDTA Tube	Greiner Bio-One	454034
Pasteur Pipette 150 mm (capillary tube)	Fisherbrand	1154-6963
26 G needle	Terumo	NN-2613R
insulin syringe and needle 29 G	Terumo	BS05M2913
30 G needle	Becton & Dickinson	304000
Flow cytometry tubes (blue)	Beckman Coulter	2523749
Water-repellent pen (Dakopen)	Dako	S200230
Sharp sterile scissors	Nessi-care	SCI-01
Sterile forceps	Dominique Dutscher	956506
Thoma cell counting chamber	VWR	631-0397
Petri Dishes (Fisherbrand Plastic)	ThermoFisher Scientific	S33580A
Microcentrifuge tube (1.5 ml)	ThermoFisher Scientific	05-408-129
Cylindrical Restrainer 15 - 30 gm	Stoelting	51338
Shandon Cytospin 3 Cytocentrifuge	ThermoFisher Scientific
10 ml syringe	Terumo	SS-10L
1 ml syringe	Terumo	SS-01T
Ethanol	Merck	1.08543
Sterile gauze sponges	URGO	501580