JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هذا البروتوكول استخراج تعديل يحسن RNA والحمض النووي العوائد من المناطق المستهدفة على نحو أدق من الفائدة في كتل الأنسجة النسيجية.

Abstract

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

Introduction

يسعى البحث العلامات البيولوجية الجيني لتحديد يرتبط الجزيئية التي تعكس بدقة وبشكل موثوق الحالة المرضية، والقيام بذلك بطريقة مفيدة سريريا. 1 تطوير العلامات البيولوجية هي التي تعتمد على تحليل بأثر رجعي من عينات الأنسجة مشروحة بشكل جيد. يتم تخزين عينات الأنسجة المريضة وطبيعية إما الأنسجة كما الطازجة المجمدة في المصارف البيولوجية المتخصصة أو الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPET) كتل الفورمالين ثابت في المحفوظات السريرية. تسمح الأنسجة الطازجة المجمدة لاستخراج الأحماض النووية ذات جودة عالية، واستخدمت على نطاق واسع في الدراسات اكتشاف العلامات البيولوجية الجينوم. 2،3 ومع ذلك، هي عينات الأنسجة أقل المتاحة في المصارف البيولوجية ودراسة هذه الأنسجة يدخل بالانحياز للعينات أكبر، والفئات غير عادية من المرض، والمرضى الذين تم فحصهم في مراكز متخصصة مع قدرات أكبر لحفظ الأنسجة. 4 FFPET، في المقابل، هو طريقة التخزين الافتراضي للأنسجة البشرية والحيوانية المريضة. في حين كتل FFPET الحفاظ م الخلويorphology، عملية التثبيت عبر الروابط المكونات الخلوية الأخرى للأحماض النووية. RNA عبر ربط والحمض النووي والقابلة للاسترداد، ولكن فقط في المتدهورة، أشكال مجزأة للغاية. 5،6 ومع ذلك، هذه DNA و RNA شظايا قابلة للتحليل من قبل مجموعة من توسيع فحوصات، بما في ذلك التعبير مرنا، hypermethylation الحمض النووي، والتسلسل المستهدف. 7،8 لاستغلال هذه الفرصة في كمية كبيرة ومتنوعة من FFPET متاحة للبحث، هناك حاجة لوضع بروتوكول استخراج فعالة وموثوق بها.

وتركز نسبة كبيرة من الأبحاث العلامات البيولوجية في أنسجة السرطان. مثل أنواع أخرى من الأنسجة المريضة والأنسجة السرطان غالبا ما يظهر عدم التجانس إقليميا هاما في الحفاظ على الخلية ونوع من الخلايا. منذ يعتمد البحث العلامات البيولوجية على القدرة على ربط مكونات الأنسجة المريضة مع ميزات الجزيئية، خطوة حاسمة في هذه العملية هي حصاد الدقيق من الأنسجة التي تم الحفاظ عليها بشكل جيد وإثراء للدisease قيد الدراسة. في FFPET، وغالبا ما تستخدم اثنين من التقنيات التخصيب: القبض على الليزر تسليخ مجهري (LCM)، وباجتزاء مشراح. [لكم تمكن شديدة التركيز حصاد الأنسجة، ويمكن استخدامها لعزل، أنواع معينة من الخلايا المحفوظة جيدا في الأنسجة غير المتجانسة. 9،10 ومع ذلك، LCM تتطلب معدات مكلفة وتستغرق وقتا طويلا باهظه لأعداد كبيرة من العينات. باجتزاء مشراح هو عملية أكثر تستخدم على نطاق واسع، حيث يتم قطع المقاطع رقيقة من كتل FFPET. 11،12 مشراح قطع المقاطع غالبا ما تشمل الأنسجة التي هي غير متجانسة في الحفاظ الخلية (على سبيل المثال، مقابل نخرية الحفاظ عليها جيدا) وتكوين (على سبيل المثال، والسرطان مقابل حمة حميدة)، وبالتالي قد يؤدي إلى تجانس الخصائص الجزيئية أفضل التحقيق بشكل منفصل. وبالتالي، هناك حاجة إلى طريقة إنتاجية عالية تثري للخلايا الفائدة. وهناك طريقة ثالثة، عزل الأحماض النووية من النوى FFPET، يوفر هذا التخصيب هو مناسبة لمارا عاليةhput البروتوكولات، واستخدمت من قبل الآخرين لعزل الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي من عينات الأنسجة منفصلة. 7،13،14

وهناك عدد من البروتوكولات نشرت يحدد طرق استخراج الأحماض النووية من FFPET (الجدول 1). ومع ذلك، فقد تم تحسين بروتوكولات حيث يتم استخراج الحمض النووي الريبي والحمض النووي من الأنسجة نفسها لأقسام الأنسجة مشراح، ولكن ليس لالنوى الأنسجة. 15،16 البروتوكولات وبالمثل، نشرت الذي نقدم زيادة خصوصية النسيج، إما عن طريق النوى الأنسجة أو microdissections الشرائح، تحديد الإجراءات لاستخراج الحمض النووي، ولكن ليس الحمض النووي الريبي. 7،17 هنا، بروتوكول الأمثل لاستخراج المزدوج من كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي من صميم النسيج نفسه ويتجلى. ويتم حصاد النوى الأنسجة عن طريق إدراج ميكروأري الأنسجة (TMA) اللكمات إلى المناطق ذات الاهتمام تعيينها إلى كتل FFPET. يتم تنفيذ التعيين من قبل التأشير شريحة المجهر مع القلم علامة ونقل هذا الشرح لسطح FFPE المقابلةكتلة T (الشكل 1).

تضمن عمل مسبق التي أدت إلى تطوير هذا البروتوكول المقارنة بين عدة أنظمة استخراج الحمض النووي المتاحة تجاريا. في هذه المقارنة، تعديلات على البروتوكولات التجارية، كما هو موضح أدناه توفير أعلى DNA و RNA الغلة والجودة (Selvarajah آخرون، في الإعدادية). النوى الأنسجة أكثر سمكا من أقسام ميكرون 5-10 ميكرون التي تستخدم عادة في FFPET بروتوكولات استخراج 11،12،14،18 - 20، ويمكن أن تحتوي على كميات أكثر تنوعا من البارافين. للتعويض عن ذلك، تم تعزيز deparaffinization بتكرار العلاج زيلين والإيثانول وعن طريق إدخال خطوة التجانس بمحركات (الشكل 1). وعلاوة على ذلك، تم تطول مرات الهضم بروتين كاف لزيادة العائد الحمض النووي. وعموما، هذا البروتوكول هو فعالة من حيث التكلفة ويمكن إقامة روابط بين السمات الجزيئية والنسيجية من المرض في لوس أنجليسRGE والسكان تتميز أيضا. ويمكن إجراء البروتوكول في مجملها من موثوق داخل 2 أيام، بما في ذلك 3 ساعة من التدريب العملي في الوقت المحدد، مع حاجة كبيرة لمعدات متخصصة أو باهظة الثمن.

بروتوكول خطوة بخطوة هو الآخرة كما نسخة معدلة من بروتوكول الشركة المصنعة. 21 يرجى الاطلاع على جدول المواد / المعدات للمواد محددة والمعدات والمصنعين.

Protocol

1. نسيج تقوير

  1. مراجعة شريحة المجهر وتحديد المنطقة (ق) من الاهتمام باستخدام علامة دائمة غرامة نقطة. قطع جزء من البارافين فيلم كبيرة بما يكفي لتغطية المنطقة من الفائدة على شريحة المجهر. وضع الفيلم بقوة على شريحة والتفاف الفيلم على حواف للحفاظ على الفيلم من الانزلاق. باستخدام علامة دائمة غرامة نقطة، الخطوط العريضة للنسيج كامل والمنطقة (ق) من الفائدة داخل الأنسجة، والحفاظ على لمس الخطوط العريضة - ولكن خارج - المنطقة (ق).
  2. إزالة الفيلم وتحويلها إلى كتلة الأنسجة المقابلة. توجيه الفيلم عن طريق التقليب أو بالتناوب بحيث الخطوط العريضة للنسيج كامل يطابق الشكل الملحوظ من الأنسجة في كتلة (الشكل 1). اضغط على الجزء من الفيلم بقوة إلى السطح من كتلة لمنع انزلاق.
  3. باستخدام غيض من علامة دائمة، وجعل المسافات البادئة الضحلة ولكن مرئية (~ 0.2 ملم) على طول الخطوط العريضة في المنطقة (ق) من فيterest، ثم إزالة الفيلم. تحميل 1 مل من المبيض، و 70٪ من الإيثانول، والمياه إلى 1.5 أو 2.0 مل أنابيب microcentrifuge منفصلة.
  4. تنظيف لكمة مستقبلات (الحمراء) من لكمة 0.6 ملم التي وضعتها انزلاق لكمة صعودا وهبوطا عدة مرات بينما هي غارقة طرف في أنبوب يحتوي على مواد التبييض. كرر الخطوة السابقة مع 70٪ من الإيثانول ثم الماء (حاسمة لضمان أن التبييض وإزالة).
  5. اضغط على لكمة في الأنسجة، داخل المنطقة من الفائدة على عمق 3 مم وسحب لكمة. حرر الأساسية إلى أدنى مستوى ملزمة أنبوب 1.5 أو 2 مل من خلال دفعه للخروج من لكمة مع القلم. تخزين النوى في -20 درجة مئوية (طويلة الأجل) أو 4 درجات مئوية لاستخدامها على المدى القصير.
  6. تنظيف لكمة وفقا لخطوة 1.4 وتواصل مع المناطق أو عينة المقبلة.

2. Deparaffinize في الصميم الأنسجة FFPE

  1. deparaffinization همتها في 1.5 أو 2 مل أنابيب بإضافة 1 مل زيلين حتى النخاع الأنسجة وvortexing لبقوة لمدة 10 ثانية. هيئة التعليم العالير لمدة 3 دقائق عند 50 درجة مئوية.
  2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) والحد الأقصى للسرعة (21130 x ج) ومكان أنبوب على الجليد لمدة 5 دقائق (يسمح بقايا شمعية ليصلب على أعلى).
  3. إزالة بعناية البارافين المتراكمة حول الغضروف المفصلي مع طاف باستخدام طرف ماصة وتكرار العلاج زيلين (الخطوات 2،1-2،2).
  4. إضافة 1 مل من الإيثانول (100٪) ودوامة بقوة لمدة 10 ثانية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في RT (السرعة القصوى)، وتجاهل بعناية الايثانول. كرر الخطوة السابقة مرة واحدة.

3. التجانس في الصميم Deparaffinized

  1. Resuspend والنوى في 700 ميكرولتر من الإيثانول (100٪) قبل التجانس. باستخدام الخالط الأنسجة الآلية، طحن النوى الى جزيئات الأنسجة الدقيقة (~ 1 دقيقة على الإعداد المتوسط). تنظيف التحقيق الخالط بين كل عينة للحد من المرحل التلوث.
    1. ملء 15 مل أنابيب مع ~ 10 مل من التبييض، ريبونوكلياز الحل تحييد و 70٪ من الإيثانول. بعد عينة وطيgenization، وغسل التحقيق الخالط في كل من حلول التنظيف في النظام المذكور أعلاه. تشغيل الخالط على أعلى سرعة خلال مرحلة الغسل.
    2. مسح التحقيق مع الأنسجة والسماح التحقيق حتى يجف تماما قبل المجانسة العينة القادمة. تفقد البصر شفرات التحقيق لقطع الأنسجة المتبقية. إذا وجدت، وتنظيف التحقيق مرة أخرى. تغيير حلول التنظيف (التبييض، والإيثانول، وحل ريبونوكلياز تحييد) يوميا.
  2. بعد التجانس، ليصبح حجم العينة إلى 1 مل عن طريق إضافة المزيد من الإيثانول بنسبة 100٪ (~ 300 ميكرولتر). أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 15 دقيقة، ونضح بعناية الايثانول والهواء الجاف بيليه لحوالي 15-20 دقيقة قبل الشروع في استخراج الحمض النووي الريبي.

4. الهضم مع بروتين كاف

  1. Resuspend وبيليه في 150 ميكرولتر بروتين K الهضم العازلة وأنابيب نفض الغبار لتخفيف بيليه. إضافة 10 ميكرولتر من درجات الحرارة مستقرة بروتين كاف ومزيج من قبل عبها (لادوامة الأنبوب). احتضان المحتوى في أنبوب عند 56 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع الإثارة معتدل.
  2. السماح أنبوب لاحتضان على الجليد لمدة 3 دقائق. التبريد الكامل مهم لهطول الأمطار كفاءة في الخطوة التالية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في أقصى سرعة.

5. الحمض النووي الريبي منفصلة من الحمض النووي

  1. نقل بعناية طاف، دون الإخلال بيليه، إلى الجديدة 1.5 مل لتنقية الحمض النووي الريبي.
  2. الحفاظ على بيليه لتنقية الحمض النووي (يمكن تخزين بيليه لمدة 2 ساعة على RT، لمدة تصل إلى 1 اليوم في 2-8 درجة مئوية، أو لفترات أطول في -20 درجة مئوية).

6. RNA تنقية

  1. احتضان طاف التي تحتوي على الحمض النووي الريبي في 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة (لا يتجاوز هذا الوقت). بعد ذلك، أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة في أنبوب لجمع قطرات من داخل الغطاء.
  2. إضافة 320 ميكرولتر العازلة RLT لضبط الأوضاع ملزمة، ومزيج من قبل pipetting. المقبل، إضافة 720 ميكرولتر الإيثانول (100٪)، ودوامة.
  3. نقل 600 ميكرولتر من العينة، بما في ذلك أي راسب قد شكلت، إلى العمود RNA تدور (مرفق في المجموعة) وضعت في أنبوب جمع 2 مل وتوضع جانبا محتوى المتبقية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج، تجاهل التدفق من خلال إعادة استخدام أنبوب جمع.
  4. نقل ما تبقى العينة على عمود، بما في ذلك الرذاذ الذي قد تراكمت في غطاء الأنبوب، الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج، وتجاهل التدفق من خلال.
  5. إضافة 350 ميكرولتر العازلة سندات شركة لعمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج، تجاهل التدفق من خلال إعادة استخدام أنبوب جمع.
  6. المزيج بلطف 10 ميكرولتر الدناز أنا حل الأسهم مع 70 ميكرولتر العازلة نشر الإشعاعات، إضافة مباشرة لغشاء عمود الدوران، واحتضانها في RT لمدة 15 دقيقة.
  7. إضافة 500 ميكرولتر العازلة سندات شركة لعمود الدوران، الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج وحفظ التدفق من خلال لاستخدامها في الخطوة التالية. لتعزيز الانتعاش من الرنا صغيرة، ضع عمود الدوران في جديد أنبوب جمع 2 مل وتطبيق التدفق من خلال الخطوة السابقة لعمود الدوران.
  8. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج، تجاهل التدفق من خلال إعادة استخدام أنبوب جمع في الخطوة التالية. إضافة 500 ميكرولتر العازلة RPE إلى عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج، تجاهل التدفق من خلال إعادة استخدام أنبوب جمع في الخطوة التالية.
  9. إضافة 500 ميكرولتر العازلة RPE إلى عمود الدوران وأجهزة الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج وتجاهل أنبوب جمع مع التدفق من خلال.
  10. ضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل، وفتح غطاء وأجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 5 دقائق. تجاهل أنبوب جمع مع التدفق من خلال.
  11. ضع عمود الدوران في الجديد مجموعة 1.5 مل، إضافة 20 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية من المياه مباشرة على الغشاء عمود الدوران، واحتضان الأنبوب لمدة 1 دقيقة في RT. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة إلى أزل الحمض النووي الريبي. تخزين عينة الحمض النووي الريبي مزال في -80 درجة مئوية.

معشوقة = "jove_title"> 7. الحمض النووي تنقية

  1. Resuspend وبيليه تم الحصول عليها خلال استخراج الحمض النووي الريبي بإضافة متدرجة من 45 ميكرولتر من العازلة بروتين كاف (400 ملي تريس 7.5، 400 مم كلوريد الصوديوم، 3 ملي MgCl 2، 4٪ SDS)؛ 45 ميكرولتر H 2 O؛ و 400 ميكروغرام من رجولية عالية بروتين K.
  2. احتضان الحل أعلاه عند 56 درجة مئوية لمدة 24 ساعة (مستحسن) أو بين عشية وضحاها. Performincubation في 90 درجة مئوية لمدة 2 ساعة دون الإثارة لفترة وجيزة أجهزة الطرد المركزي في أنبوب microcentrifuge لجمع قطرات من داخل الغطاء.
  3. السماح للعينة لتبريد لRT ثم قم بإضافة 4 ميكرولتر ريبونوكلياز ألف (100 ملغ / مل). احتضان العينة لمدة 2 دقيقة في RT.
  4. إضافة 200 ميكرولتر العازلة AL إلى عينة، ومزيج دقيق من قبل vortexing. المقبل، إضافة 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪، وتخلط جيدا من قبل vortexing. نقل العينة بأكملها إلى العمود المقدمة تدور، ومكان في أنبوب جمع 2 مل، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في ≥8،000 ز س.
  5. تجاهل أنبوب جمع معتتدفق من خلال ووضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل. إضافة 700 ميكرولتر العازلة AW1 إلى عمود الدوران، الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج، تجاهل التدفق من خلال إعادة استخدام أنبوب جمع.
  6. إضافة 700 ميكرولتر العازلة AW2 إلى عمود الدوران، الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج، تجاهل التدفق من خلال إعادة استخدام أنبوب جمع. المقبل، إضافة 700 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ لعمود الدوران، الطرد المركزي لمدة 15 ثانية في ≥8،000 x ج وتجاهل أنبوب جمع مع التدفق من خلال.
  7. ضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل، فتح غطاء عمود الدوران، وأجهزة الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق. تجاهل أنبوب جمع مع التدفق من خلال.
  8. ضع عمود الدوران في أنبوب جديد 1.5 مل جمع وإضافة 25 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه ساخنة (50 درجة مئوية). احتضان عمود وأنبوب عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في أقصى سرعة، إضافة 25 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه (RT) إلى العمود واحتضان ل1 دقيقة في RT.
  9. الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في سرعة قصوى (21130 x ج)، والحصاد من خلال تدفق تحتوي على الحمض النووي الجيني (حوالي 50 ميكرولتر من الحمض النووي في المجموع). تخزين العمود في -20 درجة مئوية (في حال طلب شطف أخرى في وقت لاحق).

النتائج

ويمثل هذا البروتوكول طريقة الأمثل لاستعادة الحمض النووي والحمض النووي الريبي من النوى الأنسجة، وذلك باستخدام إدخال تعديلات على نظام الاستخراج التجاري مصممة للأقسام الأنسجة. وشمل التحسين إدخال التجانس الأنسجة، واستخدام أكثر فعالية بروتين كاف لاستخراج الحمض النووي، وتمديد الوقت الهضم الأنسجة. شملت الرسوم البيانية والتحليلات الإحصائية 2-طريقة أنوفا، الانحدار الخطي والارتباط.

أمثل من بروتين الهضم
وتشمل هذه المجموعة التجارية في درجة حرارة الغرفة حل مستقر بروتين K الذي تم استبداله مع بروتين أكثر قوة K، مما أدى إلى ارتفاع العائد الحمض النووي (الشكل 2A). لزيادة غلة الحمض النووي، تم تمديد الهضم 2-24 ساعة. لم تشاهد فروق ذات دلالة إحصائية بين نقاط مرتين، ولكن يبدو أن عملية الهضم 24 ساعة لتوفير عوائد أكثر اتساقا عبر ساmples. ومع ذلك، المزيد من الحضانة إلى 48 ساعة لم مواصلة تحسين الانتعاش الحمض النووي (الشكل 2B؛ ع = 0.74).

نموذجي استعادة الحمض النووي من عينات الأنسجة FFPE سرطان البروستاتا

باستخدام بروتوكول الأمثل، وكانت RNA والحمض النووي المشارك المستخرجة من 333 البروستاتا عينات سرطان FFPET تتراوح من 3 إلى 14 سنوات في عمر العينة. من كل عينة، واستخدمت 3 النوى الأنسجة (متوسط ​​حجم أنسجة الكلي 0.95 ± 0.13 ملم 3) كإدخال. في حين أن هناك على أساس أساليب هلام الكهربائي ميكروفلويديك الأخرى التي يمكن تقدير تركيز وتوفير تقييمات لتوزيع حجم جزيئات الأحماض النووية، وهذه الأساليب لا توفر استنساخه الأحماض النووية الكمي، ولا يمكن التمييز بين الحمض النووي الريبي والحمض النووي كما المقايسات مقرها flourometrically-القيام به. 22 ولأن ميكروفلويديك القائمة على النتائج هلام الكهربائي لا يمكن التعويل عليها للمجزأةالأحماض النووية المستمدة من FFPET، تم قياس 23 غلة الحمض النووي fluorometrically (انظر قائمة كاشف لمزيد من التفاصيل). وكان متوسط ​​العائد 2270 نانوغرام من الحمض النووي الريبي و 820 نانوغرام من الحمض النووي (الشكل 3A). ما يقرب من 90٪ من جميع العينات التي تم تحليلها في FFPET هذه الدراسة أسفرت ≥100 نانوغرام من الحمض النووي و 500 ≥ نانوغرام من الحمض النووي الريبي. ومن المثير للاهتمام، لم يكن هناك ارتباط كبير بين عمر عينة FFPET والانتعاش الحمض النووي (الشكل 3B). وعموما، كانت مرتبطة الحمض النووي الريبي والحمض النووي العوائد عبر عينات (R 2 = 0.39؛ ف <0.0001)، على الرغم من أن أكثر من ضعفي RNA من الحمض النووي وقد تعافى من كل عينة (الشكل 3C).

كما تم تنفيذ الطيار وتحسين العمل على أنسجة البروستاتا، وكانت الخطوة التالية للتحقيق في أداء هذا البروتوكول على عدد قليل من أنواع إضافية من الأنسجة الأرشيفية. بدءا من ازالتها جراحيا وعينات التشريح FFPET تمثل يكونالكبد nign (1 عينة من 1 الحالة)، سرطان الدماغ (8 عينات من 1 حالة) والمثانة البولية (2 عينات من 2 الحالات)، وسرطان الثدي (3 عينات من 3 حالات)، أسفرت عن البروتوكول> 100 نانوغرام من الحمض النووي والحمض النووي الريبي من 90٪ من عينات (الشكل 3D). في حين كانت عوائد الحمض النووي أقل في الأنسجة التشريح مما كانت عليه في أنسجة الجراحية، وتشير نتائج ممثل أن البروتوكول تنتج عوائد مماثلة في أنحاء السرطان المستمدة من مواقع مختلفة.

تقييم من الحمض النووي الريبي والحمض النووي النزاهة والأداء التمثيلي في تحليل المصب

تم إجراء تحليل الحمض النووي الريبي التعبير من 47 جينات في 8 عينات سرطان البروستاتا FFPET المحدد والطازجة PC-3 عينة خط الخلايا السرطانية في البروستاتا (كما تحكم إيجابية) باستخدام منصة التعبير multianalyte الجينات التجارية التي يتم أمثل لFFPET. وكانت التهم مرنا في PC3 عادة أعلى من تلك التي من FFPET ساmples الشكل (4A). ومع ذلك، مقارنة التعبير النسبي لجميع الجينات، أظهرت FFPET عينات سرطان البروستاتا ملامح التعبير مماثلة إلى PC-3 RNA، مشيرا إلى أن كل من المصادر من الحمض النووي الريبي هي مناسبة لتحديد ملامح التعبير الحمض النووي الريبي.

لإظهار أداء الحمض النووي الجيني استخراج مع هذا البروتوكول، تم تضخيم بيسلفيت تحويل مقتطفات من الحمض النووي من عينات FFPET بواسطة مثيلة PCR محددة (MSP). 24 تحليل MSP من ALU العناصر المتكررة، مناطق مثيلة للغاية موجودة في ملايين النسخ في الجينوم البشري، تم استخدام 25 كعنصر تحكم مثيلة الجينومية، ويتوقع أن يظهر الحد الأدنى من الاختلافات بين العينات. كما هو مبين في الشكل 4B، كان هناك القليل لعدم وجود اختلاف بين ينظر عينات مختلفة في مستويات الحامض ALU MSP. وعلاوة على ذلك، المقايسات MSP على أساس GSTP1، وهو الجين المعروف أن hypermethylated في سرطان البروستاتا ولكن ليس في عينات حميدة، 26 لم تظهر أي amplif كشفهاications في الحمض النووي من عينات حميدة. وكما كان متوقعا، تم الكشف عن أقل QPCR دورة القيم الحدية في الحمض النووي من الأنسجة السرطانية، مشيرا إلى تخصيب النسخ GSTP1 ميثليته. تم اختبار الأداة المساعدة من الأحماض النووية تعافى من هذا البروتوكول زيادة في المقايسات المصب النموذجية، وذلك باستخدام الأحماض النووية تعافى من الكبد حميدة ومن الدماغ (بعد الوفاة) واثنين من عينات سرطان الثدي جراحيا. أداء كلا RT-QPCR التعبير القائمة على وزارة الصحة العامة فحوصات جيدا على سرطان الثدي وFFPET الكبد، لكنه فشل في فحص RT-PCR لتضخيم مرنا أعرب غاية من بعد الوفاة عينة ورم في المخ (الشكل 4C)، مما يشير إلى أن الحمض النووي الريبي قد تدهورت، على الأرجح بسبب تأخر تثبيت الأنسجة.

figure-results-5790
الشكل 1: لمحة عامة عن إجراء استخراج عينات لFFPET يوضح الشكل كيف مساحة من الاهتمام فييتم تعيين كتلة الأنسجة استنادا إلى التحديد النسيجية من شريحة المجهر. ثم يتم الحصول على ثلاثة محاور الأنسجة 0.6 ملم من كل منطقة الأنسجة باستخدام اللكمات الخزعة المتجانسة معا وبعد ذلك تعرض لاستخراج كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6454
الشكل 2: الأحماض النووية (DNA و RNA) الغلة في نانوغرام / مم 3 من FFPET من اثنين من بروتين K (درجة الحرارة مستقرة وعالية الفعالية إنزيمات)، واختبار عبر مجموعة من الحضانة تايمز لهذا الأخير (A) أداء بروتين كاف. من مختلف الموردين. أجريت عمليات الاستخراج الحمض النووي على عينة تمثيلية FFPET درجة الحرارة باستخدام انزيم مستقرة المرفقة مع كذلك مقابل انزيم أكثر قوة من مصنع آخر. (ب) تحديد الأمثل بروتين كاف فترة حضانة لتعظيم العائد الحمض النووي. تم تقييم أداء تركيز عال بروتين كاف الهضم في ثلاث فترات الحضانة المختلفة باستخدام 3 عينات FFPET. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7495
الرقم 3: الأحماض النووية (DNA و RNA) الغلة في نانوغرام / مم 3 من FFPET في إجمالي، عبر سنوات نماذج وأنواع الأنسجة التمثيلية (A) إجمالي استرداد الأحماض النووية من الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين الثابتة الفورمالين. وتستند كميات الأحماض النووية المقدمة على الاستخراج من 333 عينات FFPET شغناء بروتوكول الأمثل. (ب) قطعة الارتباط بين مجموع الحمض النووي والحمض النووي الريبي تعافى وعمر عينات FFPET. وقد تم الحصول على عينات FFPET استخراج المستخدمة من عامي 2000 إلى 2012. (ج) العلاقة بين العوائد من الحمض النووي المستخرج وقت واحد والحمض النووي الريبي من 333 عينات البروستاتا. هناك علاقة طردية بين DNA و RNA العوائد. (D) مظاهرة للبروتوكول باستخدام أنواع الأنسجة الأرشيفية إضافية. تم استخدام بروتوكول الأمثل لاستخراج الأحماض النووية من 14 السرطان (الثدي والمثانة والمخ) وطبيعية (الكبد) العينات. أشرطة الخطأ تمثل SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8781
الشكل 4: الأداء من الحمض النووي الريبي والحمض النووي المشارك المستخرج من TISSUالنوى الإلكترونية في تطبيقات المصب. (A) مرنا تعول على أنسجة سرطان البروستات FFPE والطازجة PC-3 مراقبة خط الخلية. وتمثل كل نقطة في المتوسط ​​من 3 مكررات التقنية المستخرجة بشكل منفصل. موضحة القيم RNA الطازجة PC-3 خط الخلية عن طريق أشرطة صفراء والقيم الأنسجة FFPET يتم تمثيل النقاط الملونة. (ب) مثلأيشن المقايسات PCR محددة على الحمض النووي من عينات FFPET سرطان البروستاتا. تم الحصول على القيم عتبة دورة لمدة 10 عينات تنفيذ كما هو متوقع باستخدام 50 نانوغرام / رد فعل من الحمض النووي تحويل بيسلفيت. كان ALU المقايسات MSP من جميع العينات FFPET القيم عتبة دورة مماثلة (P> 0.67). وأظهرت فحوصات GSTP1 MSP أعلى مثيلة (أقل عتبة دورة) مستويات في سرطان البروستاتا مما كانت عليه في البروستات الحميدة. (ج) تقييم الحمض النووي والحمض النووي الريبي الجودة من أنواع الأنسجة الإضافية. أجريت التعبير الجيني HPRT1 والجينات الو فحوصات الحامض على الأحماض النووية (RNA والحمض النووي على التوالي) المستخرجة من ولاالقانون النموذجي للتحكيم الكبد (التشريح)، والدماغ (التشريح) وسرطان الثدي (جميع FFPET). وتظهر النتائج من البروستاتا للمقارنة. ملاحظة: لوحظت نتائج مماثلة من كل نوع الأنسجة، باستثناء فشل التضخيم مرنا من عينة التشريح واحد. كل نقطة أو شريط تمثل عينة، وأشرطة الخطأ تمثل SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النوى الأنسجة
الأنسجة الإدخال (MM3) المستخلصة والأحماض النووية التحقق من صحة فحص الجودة: الحمض النووي فحص الجودة: RNA
(# العينات) العمر من عينة (سنوات) إجمالي العائد (نغ) حجم جزء (بي بي) PCR إجمالي العائد (نغ) حجم جزء (بي بي) PCR NanoString
Pikor وآخرون. 43-129 الحمض النووي لايوجد بيانات لايوجد بيانات لايوجد بيانات لايوجد بيانات
منتصر-Kouhsari وآخرون. 18-29،5 RNA 763 0-25 843 لايوجد بيانات
هذه الورقة 1.71 DNA و RNA > 350 3-12 820 100-500 figure-results-11525 2270 100-500 figure-results-11640/ftp_upload/54299/check_mark.jpg "/>
أقسام الأنسجة
الأنسجة الإدخال المستخلصة والأحماض النووية التحقق من صحة فحص الجودة: الحمض النووي فحص الجودة: RNA
(# العينات) العمر من عينة (سنوات) إجمالي العائد (نغ) حجم جزء (بي بي) PCR إجمالي العائد (نغ) حجم جزء (بي بي) PCR NanoString
هيكل وآخرون. 5 × 5 ميكرون الحمض النووي 12 7-22 88-300 103-351 figure-results-12424
تشونغ وآخرون. 1 × 20 أم RNA 9 > 5 16،000- 23،000 100-200 figure-results-12714
انتيكا وآخرون. 2 × 4 ميكرون RNA 18 لايوجد بيانات غير معروف (621 نانوغرام / ميكرولتر) 80-202 + figure-results-13014
غاتاك وآخرون. 5 × 5 ميكرون DNA و RNA 5 1 14 256 <1030 figure-results-13247 16 000 109-400 + figure-results-13366
هينينج وآخرون. 1 × 10 ميكرون DNA و RNA 210 1-25 لايوجد بيانات لايوجد بيانات figure-results-13621 لايوجد بيانات لايوجد بيانات figure-results-13751
ملقط ليزر
الأنسجة الإدخال (MM2) المستخلصة والأحماض النووية التحقق من صحة فحص الجودة: الحمض النووي فحص الجودة: RNA
(# العينات) العمر من عينة (سنوات) إجمالي العائد (نغ) حجم جزء (بي بي) PCR إجمالي العائد (نغ) حجم جزء (بي بي) PCR NanoString
سنو وآخرون. 1-2 الحمض النووي 110 0-2 430 لايوجد بيانات figure-results-14494

الجدول 1: مقارنة بين البروتوكولات الحمض النووي واستخراج الحمض النووي الريبي تنشر لالنوى الأنسجة والأقسام وmicrodissections القبض على الليزر كما يوجد أيضا العديد من تقييم النهاية الجزيئية لهذه الطرق باستخدام PCR وNanostring المقايسات.

Discussion

لاستخراج ناجحة من الحمض النووي والحمض النووي الريبي من مناطق الأنسجة من الاهتمام والحفارات دقيق أمر بالغ الأهمية. يصف هذا البروتوكول استخدام لكمة الأنسجة لعزل 0.6 ملم النوى قطر والخطوط العريضة لعملية نقل الرموز من الشرائح المجهر لكتل ​​FFPET المقابلة. هناك حاجة إلى إدخال تعديلات على بروتوكول الشركة المصنعة لاستخراج بكفاءة الأحماض النووية من النوى، والتي هي تقريبا سمكا 50 مرة من أقسام مشراح التي كان القصد هو أن البروتوكول. منذ النوى قد تحتوي على المزيد من شمع البارافين نسبة إلى أقسام الأنسجة، deparaffinization فعالة من النوى من خلال تكرار زيلين والعلاج الايثانول الخطوات التي المطلوبة. نجاح الخطوات بعد deparaffinization يعتمد على الصحيح الميكانيكية التجانس النوى الأنسجة وبروتين فعال K الهضم. مزيد من التحسين من بروتين K الهضم لا يمكن أن يؤديها.

ومن الجدير بالذكر أن هذا الأسلوب هوية منذالمناطق ذات الاستثمار الاجنبى من الفائدة على سطح الكتلة، على النحو المحدد في الشرائح التشريح المرضي المقابلة. كما الأنسجة المحاصيل الأساسية التي قد تكون 3 أو 4 ملم عميق، مستخدمي هذا البروتوكول قد تكون قلقة بشأن ما الخلايا أو الأنسجة تكمن تحت سطح كتلة. في حين أن هذا هو مصدر قلق صحيح، وقد أثبتت دراسات متعددة (إعادة النظر في المرجع 27) أن النوى الأنسجة تمثل بصدق نسيجية والخصائص الجزيئية للكتل الأنسجة المرضية، وخاصة عندما يتم أخذ عينات مكررة أو ثلاث نسخ النوى من منطقة الفائدة.

كما عدة استخراج التجارية المعدلة المعتمدة في هذا البروتوكول يتيح استخراج المتزامنة من كل من الحمض النووي والحمض النووي الريبي من الأنسجة نفسها، وبروتوكول يوفر المواد البيولوجية الثمينة ويسمح للمقارنة مباشرة بين البلدين مما أدى الأحماض النووية من نفس العينة. استخراج المتزامنة من الحمض النووي الريبي والحمض النووي خفضت نضوب العمل والأنسجة بمقدار النصف، ويمكن تحليل متكامل الدقيق للEXPR الجينession، فضلا عن ميزات جينية وراثية وجدت في الحمض النووي. منذ غلة كل من الحمض النووي الريبي والحمض النووي من هذه النوى الأنسجة تمثيلية يتجاوز عادة 600 و 300 نانوغرام، على التوالي، ولأن معظم تطبيقات PCR والقادم تسلسل الجيل الحالي يتطلب عادة 10-100 نانوغرام، معظم العينات تنقيته من هذا البروتوكول يجب تقديم ما يكفي من المواد لعدة فحوصات المصب. وقد تبين أن هذا البروتوكول أن استنساخه في المختبرات المستقلة (Selvarajah وآخرون، وفي الإعدادية). والحمض النووي الريبي من هذا البروتوكول من نوعية كافية لتحليل التعبير الجيني باستخدام RT-PCR أو منصة multianalyte الشعبية، ويقوم الحمض النووي بشكل جيد في مثيلة المقايسات PCR محددة. هناك ما يبرر الدراسات المستقبلية التي تهدف إلى تقييم مدى فائدة الأحماض النووية تعافى في تسلسل الجيل القادم.

وهكذا، قدمت عدة تعديلات على بروتوكول متوفرة تجاريا، مصممة للأقسام FFPET رقيقة، مما يجعلها مناسبة FOص شارك في استخراج الحمض النووي الريبي والحمض النووي من عينات FFPET 0.6 مم. أظهر بروتوكول عوائد عالية على الدوام في لفيف كبير من عينات سرطان البروستاتا وفي مجموعة محدودة من عينات من سرطانات الثدي والمخ والمثانة. عموما، يجب أن البروتوكول تمكين المستخدمين من تنفيذ المستهدفة التحليلات القائمة على الجينات في مجموعات الأنسجة كبيرة مشروحة بشكل جيد. وجدير بالذكر أن بروتوكول يتيح أخذ العينات فعالة مركزة من المناطق ذات الاهتمام في FFPET، صغيرة نسبيا اليدين في الوقت المحدد، وعوائد عالية بما فيه الكفاية بالنسبة لمعظم التطبيقات المصب.

Disclosures

The authors declare no competing financial interests.

Acknowledgements

This research was supported by a team grant from Movember/Prostate Cancer Canada to JMSB, DMB, PCP, and JL, and by the Ontario Institute of Cancer Research (JMSB, DMB, and PCP) and Motorcycle Ride for Dad Kingston/University Hospitals Kingston Foundation/Kingston General Hospital (DMB, PCP).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'"Bemis RK-06720-40Any generic paraffin film will work as a substitute
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach"Likewise53-2879-2Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact.
Molecular biology grade absolute ethanolFisher BioReagentsBP2818-500Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute
Molecular Grade H2OG-Biosciences786-293Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O
0.6 mm Punch Set for Beecher Instruments EstigenMPO6[Yellow]Make sure to use the red receiver punch from the set
Fine point permanent markerSharpie10365796SUsing the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required
FFPE tissue block
Stained tissue slide corresponding to FFPE block
1.5 ml Micro-Centrifuge TubesFisher BioReagents05-408-137
2.0 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)Eppendorf22431048
1.5 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes)Eppendorf22431021
Histology XyleneVWRCA 95057-822Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute
Molecular Biology Grade 2-PropanolSigmaI9516
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit Qiagen80234Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solutionQiagen80234Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21
Temperature stable proteinase KQiagen80234
High potency proteinase KInvitrogen25530-049Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY)Molecular BioProducts7003
RNaseA 100 mg/mlQiagen19101
BD Integra Syringe 3 ml 21G x 1/2BD 305274
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor)Qiagen 9001271Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute
-20 °C and -80 °C Laboratory Freezer  
Micro-Centrifuge with rotor for 2 ml tubes
Digital Vortex Mixer
Pipettes and filter tips
Heating blocks or water baths
Tris Hydrochloride Amresco0234
Sodium Chloride Amresco0241
Anhydrous Magnesium ChlorideSigmaM8266
Sodium Dodecyl SulfateSigmaL4509
Acrodisc 25 mm syring filters with 0.45 µm Supor membranePallPN 4614
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3 mlBD Integra305274
Hydrochloric AcidBDH3026
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform)Nanostring nCounter platform, Nanostring
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit)Invitrogen

References

  1. Kern, S. E. Why your new cancer biomarker may never work: recurrent patterns and remarkable diversity in biomarker failures. Cancer Res. 72 (23), 6097-6101 (2012).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T. A., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26 (6), 797-810 (2011).
  3. Beltran, H., et al. Targeted Next-generation Sequencing of Advanced Prostate Cancer Identifies Potential Therapeutic Targets and Disease Heterogeneity. Eur. Urol. 63 (5), 920-926 (2013).
  4. Hoppin, J. A., Tolbert, P. E., Taylor, J. A., Schroeder, J. C., Holly, E. A. Potential for selection bias with tumor tissue retrieval in molecular epidemiology studies. Ann. Epidemiol. 12 (1), 1-6 (2002).
  5. von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA quality from FFPE samples. PLOS ONE. 2 (12), e1261 (2007).
  6. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
  7. Pikor, L. A., Enfield, K. S. S., Cameron, H., Lam, W. L. DNA extraction from paraffin embedded material for genetic and epigenetic analyses. J. Vis. Exp. (49), (2011).
  8. Turashvili, G., et al. Nucleic acid quantity and quality from paraffin blocks: defining optimal fixation, processing and DNA/RNA extraction techniques. Exp. Mol. Pathol. 92 (1), 33-43 (2012).
  9. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat. Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).
  10. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Methods Mol. Biol. 884, 289-304 (2012).
  11. Bonin, S., Stanta, G. Nucleic acid extraction methods from fixed and paraffin-embedded tissues in cancer diagnostics. Expert Rev. Mol. Diagn. 13 (3), 271-282 (2013).
  12. Bonin, S., et al. Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues. Virchows Archiv. 457 (3), 309-317 (2010).
  13. Montaser-Kouhsari, L., et al. Image-guided Coring for Large-scale Studies in Molecular Pathology. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. , (2015).
  14. van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis. Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 121-125 (2013).
  15. Ghatak, S., Sanga, Z., Pautu, J. L., Kumar, N. S. Coextraction and PCR Based Analysis of Nucleic Acids From Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Specimens. J. Clin. Lab. Anal. , (2014).
  16. Hennig, G., et al. Automated extraction of DNA and RNA from a single formalin-fixed paraffin-embedded tissue section for analysis of both single-nucleotide polymorphisms and mRNA expression. Clin. Chem. 56 (12), 1845-1853 (2010).
  17. Snow, A. N., Stence, A. A., Pruessner, J. A., Bossler, A. D., Ma, D. A simple and cost-effective method of DNA extraction from small formalin-fixed paraffin-embedded tissue for molecular oncologic testing. BMC Clin. Pathol. 14 (1), 30 (2014).
  18. Torrente, M. C., et al. DNA extraction from formalin-fixed laryngeal biopsies: Comparison of techniques. Acta Otolaryngol. 131 (3), 330-333 (2011).
  19. Okello, J. B. A., et al. Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues. Anal. Bochem. 400 (1), 110-117 (2010).
  20. Abramovitz, M., et al. Optimization of RNA extraction from FFPE tissues for expression profiling in the DASL assay. BioTechniques. 44 (3), 417-423 (2008).
  21. . . AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook. , (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. Journal of Extracell. Vesicles. 4, (2015).
  23. . Methods of RNA Quality Assessment Available from: https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment (2012)
  24. Herman, J. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (18), 9821-9826 (1996).
  25. Weisenberger, D. J., Campan, M., et al. Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight. Nucleic acids research. 33 (21), 6823-6836 (2005).
  26. Yegnasubramanian, S. Hypermethylation of CpG Islands in Primary and Metastatic Human Prostate Cancer. Cancer Res. 64 (6), 1975-1986 (2004).
  27. Parsons, M., Grabsch, H. How to make tissue microarrays. Diagn. Histopathol. 15 (3), 142-150 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

114 FFPE DNA RNA Deparaffinization

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved