إجمالي الحجم الأمثل في Microwells لالقائم على تعليق القلب تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية

Summary

الأساليب التقليدية لبدء التمايز القلب تعليق مجموع المباراتين على أساس من المحفزة الإنسان ينبع الخلايا (hPSCs) تعاني مع عدم تجانس الثقافة فيما يتعلق حجم الكلي والشكل. هنا، نحن تصف طريقة قوية للتمايز القلب توظيف microwells لتوليد تسيطر عليها حجم hPSC المجاميع مثقف في ظل الظروف التي تشجع القلب.

Abstract

Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.

Introduction

في زراعة الخلايا في المختبر يمكن أن يؤديها في إطار عدد من الطرائق، ولكن يتم عادة إما في ظروف ملتصقة ثنائية الأبعاد أو في ظروف تعليق ثلاثية الأبعاد أن ألخص بشكل كامل في أنظمة الجسم الحي. ونتيجة لذلك هناك اتجاه متزايد في العديد من مجالات البحوث لتطوير طرق فعالة لتوليد بنيات الأنسجة ثلاثية الأبعاد. في سيناريوهات حيث تتطلب أنواع وعمليات الخلية الداعمة المصفوفة خارج الخلية (ECM) السطحية والتصاق الإشارات، ويمكن تطبيق ثلاثي الأبعاد الثقافة عبر بنيات scaffolded، حيث الخلايا مثقف أو في خارجية المنشأ دعم مصفوفة ^1. ويمكن إجراء الخلايا والعمليات التي لا تتطلب الانضمام إلى مصفوفة داعمة في تعليق كأنظمة unscaffolded تتألف أساسا أو حصرا من الخلايا (التي قد ثم المضي قدما لتوليد مصفوفات الذاتية الخاصة بهم) ^2،3. هنا، نقدم بروتوكول للالقلب التمايز سالخلايا الجذعية المحفزة الإنسان و (hPSCs - الخلايا الجذعية قادرة على أن تصبح أي نوع من الخلايا في الجسم، سواء كانت من مصادر الجنينية أو غيرها) في والزي الرسمي، وحدات unscaffolded التي تسيطر عليها الحجم.

وتشهد التفريق بين hPSCs كما المجاميع التعليق من الاختلافات الكبيرة في حجم الكلي سواء داخل تشغيل وبين أشواط. هذا التباين هو نتيجة للطريقة وعادة ما تستخدم لتوليد هذه المجاميع، والذي ينطوي على التفكك الميكانيكي للمستعمرات الخلايا. للحد من هذه التقلبات، وقد تم استخدام عدد من الأساليب للسيطرة على عدد من الخلايا في مجموع المباراتين وكذلك القطر الكلي والتوحيد. ومن الأمثلة على ذلك تشكيل المجاميع في أنابيب microcentrifuge ⁴ أو كما شنقا قطرات ^5، micropatterning تعريف ثنائية الأبعاد المستعمرات hPSC ⁶ ومن ثم يمكن نقلها إلى تعليق، أو الطرد المركزي من الخلايا في U- أو لوحات-V أسفل متعددة جيدا ^{7،8، 9.} ومع ذلك، كل هذه apprتقتصر oaches من الإنتاجية المنخفضة على توليد الكلي. النظم القائمة جيدا تستخدم نهجا مماثلا لأنظمة لوحة-V أسفل، ولكن حجم أصغر من microwells (في هذا البروتوكول كل وجود عرض من 400 ميكرون) يمكن توليد أعداد أكبر من المجاميع موحدة من ثقافة لوحة واحدة بشكل جيد (القطر القياسي لل~ 15.5 ملم تحتوي على ~ 1200 microwells) من شأنه أن تتولد من-V السفلي كلها لوحة ^10. وقد استخدم تشكيل الكلي مقرها أيضا في عدد من الإعدادات بما في ذلك التفريق بين hPSCs إلى الأدمة ^11، الأديم الباطن ^12، أرومية متوسطة ¹³ و ¹⁴ خارج الجنين مصائر. تكون الغضروف من خلايا الجذعية الوسيطة ^15؛ جيل من ركائز موحدة لفحص السمية ^16؛ والتحقيق في ميكانيكا الأحياء ^17.

واحد تحديا كبيرا في تطوير بروتوكولات صناعة قوية لإنتاج cardiom المستمدة hPSC-وقد yocytes عدم وجود استنساخ في كفاءة التمايز القلب بين أشواط. أثبتنا سابقا أن هذا التغير يمكن أن يعزى إلى عدم التجانس في السكان hPSC ابتداء، والتي تضم كل من خلايا hPSCs والتفريق تجديد الذات التي تعبر عن الجينات المرتبطة الأديم الباطن والعصبية التمايز ^6،18. الإشارات التي يفرزها هذه الخلايا التفريق تؤثر تحريض القلب. على وجه التحديد، الأديم خارج الجنين يعزز تحريض القلب، في حين تمنع الأسلاف العصبية تحريض القلب. على hPSC التجميع، الخلايا داخل يفرق الكلي وتنظيم بحيث تحيط hPSCs غير متمايزة طبقة من خلايا الأديم خارج الجنين التي تضع على السطح الكلي ^13. من خلال التحكم في حجم الكلي، ونحن يمكن أن تعدل نسبة الخلايا الأديم الباطن الذي يحفز القلب على hPSCs غير متمايزة (مساحة السطح إلى نسبة الحجم) وتحسين هذه النسبة لأقصى قدر من الحث القلب ^13.

Protocol

1. إعداد مكونات المتوسطة

1. إعداد غسل المتوسطة. لكل 100 مل من DMEM / F12، إضافة 1 مل من 100X البنسلين / الستربتوميسين (القلم / بكتيريا)، 1 مل من 100X L-الجلوتامين، و 5 مل من استبدال المصل.
2. إعداد يعرف كيميائيا بصل قلب الحث المتوسطة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
3. تحضير الكواشف الأوراق المالية التالية لوسائل الإعلام التي سيتم استخدامها في هذا البروتوكول.
   1. L-حمض الأسكوربيك: إعداد محلول المخزون من 5 ملغم لكل لتر في 4 درجات مئوية، عقيم الماء المقطر نقي للغاية في أنبوب مخروطي الشكل.
      1. ترك هذا الحل على الجليد ودوامة أنبوب بشكل دوري حتى يتم حل المذاب تماما. تصفية تعقيم الحل حمض الاسكوربيك باستخدام فلتر حقنة 0.22 ميكرون.
      2. إعداد 1 مل aliquots من الحل حمض الاسكوربيك وتخزين هذه aliquots في -20 درجة مئوية. استخدام قسامة إذابة طازجة يتم إعداد كل المتوسطة الوقت.
   2. في يوم من إعداد المتوسط، وتمييع 13 ميكرولتر من monothioglycerol (MTG) في 1 مل من بصل قلب الحث المتوسطة. تجاهل غير المستخدمة، MTG المخفف.
   3. إعداد 1 مل aliquots من ترانسفيرين (30 ملغ / مل) لتخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية. متجر إذابة aliquots في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.
   4. إعداد 4 ملم حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) التي تحتوي على 0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA). في غطاء الدخان، إضافة 30 ميكرولتر من 6.0 حل N حمض الهيدروكلوريك إلى 50 مل من الماء المقطر نقي للغاية. تصفية تعقيم الحل باستخدام فلتر حقنة 0.22 ميكرون. إضافة 2 مل من 25٪ حل جيش صرب البوسنة في حل حمض الهيدروكلوريك 50 مل.
   5. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 0.1٪ BSA. إضافة 20 ميكرولتر من 25٪ حل جيش صرب البوسنة في مل برنامج تلفزيوني.
   6. إعداد الإنسان مخلق العظام البروتين 4 (BMP-4) حل سهم (10 نانوغرام / ميكرولتر). حل 10 ميكروغرام مجفف بالتجميد BMP-4 في 1 مل من حمض الهيدروكلوريك 4 ملي حل العازلة التي تحتوي على 0.1٪ BSA. إعداد 50 ميكرولتر قسامات لتخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
   7. إعداد الإنسان الخلايا الليفية عامل النمو 2 (bFGF) حل سهم(10 نانوغرام / ميكرولتر). حل 10 ميكروغرام مجفف بالتجميد bFGF في 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 0.1٪ BSA. إعداد 50 ميكرولتر قسامات لتخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
   8. إعداد الأوعية الدموية غشائي عامل نمو الإنسان (VEGF) حل سهم (5 نانوغرام / ميكرولتر). حل 5 ميكروغرام VEGF مجفف بالتجميد في 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ BSA. إعداد 50 ميكرولتر قسامات لتخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
   9. إعداد Activin حل سهم (10 نانوغرام / ميكرولتر). حل 10 ميكروغرام مجفف بالتجميد Activin ألف في 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA). إعداد 50 ميكرولتر قسامات لتخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
   10. إعداد المانع من WNT الإنتاج-2 (IWP-2) حل سهم (10 ملم). حل 2 ملغ IWP-2 في 429 ميكرولتر ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). إعداد 10 ميكرولتر قسامات لتخزين في -80 درجة مئوية.
4. إعداد الكامل للقلب الحث المتوسطة. 100 مل من بصل قلب الحث المتوسطة، إضافة 1 مل من 100X القلم / بكتيريا، 1 مل من 100X L-الجلوتامين، 500 ميكرولتر من ترانسفيرين (1)،مل من حمض الاسكوربيك إذابة حديثا، و 300 ميكرولتر من MTG. تجاهل المتوسطة غير المستخدمة.

2. إعداد لوحة Microwell

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية.

1. إضافة 0.5 مل شطف الحل (مكون عدة) إلى كل بئر التي سيتم استخدامها على لوحة. لضمان أن الاتصالات حل كامل السطح داخل كل microwell، الطرد المركزي لوحة في 840 x ج لمدة 2 دقيقة.
2. احتضان لوحة لمدة 30 إلى 60 دقيقة في RT.
3. نضح الحل الشطف من الآبار. يغسل كل مرتين جيدا كما يلي: إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني على كل جانب، الطرد المركزي لوحة في 840 x ج لمدة 2 دقيقة، ثم نضح برنامج تلفزيوني.

3. تشكيل hPSC المجاميع في لوحة Microwell

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات في خزانة السلامة البيولوجية.

1. ضع غسل المتوسطة في 37 ° C حمام الماء.
   ملاحظة: حجم المطلوب = 1 مل × عدد الآبار من HPSC التي سيتم فصلها.
2. فصل hPSCs إلى الخلايا وحيدة
   توضح هذه الخطوات تفكك الخلايا المستزرعة على 6 لوحات جيدا - يمكن تحجيم كميات كاشف نسبيا لصيغ ثقافة مختلفة: ملاحظة.
   1. نضح مستنبت من كل ثقافة hPSC جيدا للتفكك. شطف كل جيدا مع 1 مل من انزيم التفكك، ثم نضح على الفور انزيم تفارق من كل جانب.
      ملاحظة: يجب أن تكون انزيم تفارق المتبقية كافية لفصل الخلايا.
   2. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
   3. إضافة 1 مل من غسل المتوسطة إلى كل بئر وميكانيكيا فصل الخلايا من سطح زراعة الأنسجة من قبل pipetting وغسل المتوسطة مع micropipettor P1000 على سطح زراعة الأنسجة. إذا كان التفكك على ما يبدو لا تزال غير مكتملة كتل والخلية، وتمرير تعليق من خلال مصفاة في هذه المرحلة.
   4. نقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل وتخزينهاالأنبوب في الحاضنة في حين يتم تنفيذ عدد خلايا في الخطوة التالية.
   5. إجراء تعداد خلايا:
      1. أخذ عينة 10 ميكرولتر من تعليق الخلية التي تم جمعها في الخطوة السابقة. إضافة 30 ميكرولتر من التريبان الأزرق وخلط تعليق جيد من قبل pipetting.
      2. نقل 10 ميكرولتر من الخلايا الملون الأزرق التريبان لكل غرفة من عدادة الكريات وتصور تحت المجهر المقلوب مع الهدف 10X. عد الخلايا.
   6. من نتائج الفرز الخلية، وحساب عدد الآبار يمكن المصنف عند 1.2 × 10 ⁶ خلايا لكل بئر من لوحة microwell. حساب التجميع المتوسطة المطلوبة لبذور الخلايا في 1 مل لكل بئر.
   7. إعداد المتوسطة التجميع. لكل 10 مل من استكمال القلب الحث المتوسطة، إضافة 0.5 ميكرولتر من BMP4 حل سهم (تركيز النهائي = 0.5 نانوغرام / مل)، وY-27632 ROCK المانع (تركيز النهائي = 10 ميكرومتر).
   8. إزالة أنبوب مخروطي يحتوي على hPSCs من الحاضنة وcentrifuجنرال الكتريك الأنبوب في 200 x ج لمدة 5 دقائق. نضح المتوسطة غسل و resuspend الخلايا في المتوسط تجميع في مناطق ذات كثافة من 1.2 × 10 ⁶ خلايا لكل مل.
   9. نضح الحل غسل برنامج تلفزيوني من كل بئر من لوحة microwell. باستخدام micropipettor P1000، توزع بالتساوي والبذور 1 مل من خلية إلى تعليق كل بئر على لوحة microwell. البذور وعدد كبير من الآبار، دوامة دوري تعليق الخلية لمنع الترسيب.
   10. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 200 x ج لمدة 5 دقائق. مراقبة لوحة تحت المجهر للتأكد من خلايا ونسج على الجزء السفلي من كل microwell.
   11. احتضان لوحة لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO _2، 5٪ O ₂ (ميتة) الحاضنة.

4. قلب الحث المرحلة 1

1. بعد يوم واحد التجميع (يوم 1)، وإعداد حجم المطلوب من المرحلة 1 الحث المتوسطة (للحصول على 24 لوحة جيدا، وحجم = 1 مل × عدد الآبار). ل1 مل من كاملالقلب المتوسطة التعريفي، إضافة 1 ميكرولتر من BMP4 حل سهم (تركيز النهائي = 10 نانوغرام / مل)، و 0.5 ميكرولتر من محلول المخزون bFGF (نهائي تركيز = 5 نانوغرام / مل)، و 0.6 ميكرولتر من Activin ألف (تركيز النهائي = 6 نانوغرام / مل). ضع المتوسطة في 37 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة على الأقل.
2. إزالة لوحة microwell من الحاضنة. تفقد المجاميع تحت المجهر. مقارنة الفور تجميع ما بعد الطرد المركزي، وينبغي أن تظهر سليمة مع حواف ناعمة (للمزيد من جولة وأقل مربع من اليوم السابق).
3. إزالة طاف من دون إزعاج المجاميع داخل microwells:
   1. عقد لوحة microwell أفقيا مستوى (أي، لا إمالة ذلك). لكل بئر على لوحة microwell، ضع غيض من micropipettor P1000 على سطح مستنبت وعلى حافة البئر.
   2. ببطء وإزالة المتوسطة، والحرص على عدم تعكير صفو المجاميع في الجزء السفلي من microwells. بعد تخفيض ركان مستوى المتوسط ​​إلى حوالي 1-2 مم من سطح microwell محكم، إمالة ببطء لوحة لجمع المتوسطة في جانب واحد من البئر (مرة واحدة حجم منخفض بما فيه الكفاية، يتم تقليل السائل الحركة إلى حد كبير، وأنه من الأسهل لتجنب المجاميع الحصول على رفع من microwells الفردية). ماصة ببطء وسيلة المتبقية في البئر.
4. لإضافة جديدة المرحلة 1 الحث المتوسطة مع ضمان تبقى المجاميع في microwells الفردية: رسم 1 مل من المرحلة 1 الحث المتوسطة مع micropipettor P1000. عقد غيض ماصة على حافة داخل البئر والاستغناء ببطء شديد والمتوسطة ضد الجدار داخل البئر. كرر الآبار المتبقية.
5. العودة إلى لوحة الحاضنة تحت ظروف نقص الأوكسجين لمدة 3 أيام.

5. القلب الحث المرحلة 2

1. في يوم 4، مكان غسل المتوسطة (حجم = عدد من الآبار × 2 مل) في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
2. إعداد حجم ضروري من المرحلة 2 الحث المتوسطة (حجم = عدد من الآبار × 1 مل): لكل مل من استكمال القلب الحث المتوسطة، إضافة 2 ميكرولتر من محلول المخزون VEGF (تركيز النهائي = 10 نانوغرام / مل) و 0.5 ميكرولتر IWP-2 حل سهم (نهائي تركيز = 5 ميكرومتر). وضع استعداد المرحلة 2 الحث المتوسطة في 37 ° C حمام الماء لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
3. باستخدام ماصة 5 مل المصلية، حصاد المجاميع من كل بئر من لوحة microwell وجمع تعليق الكلي في 15 مل أنبوب مخروطي (جمع ما يصل إلى 10 بئرا في 15 مل أنبوب).
4. السماح للمجاميع ليستقر لمدة 15 دقيقة في حاضنة ميتة.
   ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لفصل الخلايا وحيدة والحطام الخلوي من المجاميع سليمة.
5. نضح طاف بعناية و resuspend المجاميع في 10 مل من قبل حرارة غسل المتوسطة لإزالة السيتوكينات حثي المتبقية (على سبيل المثال، Activin (أ) هو جزيء إشارة قوية حتى في التعاون منخفض جداncentrations).
6. أجهزة الطرد المركزي المجاميع في 50 x ج لمدة 2 دقيقة. نضح طاف. Resuspend والمجاميع مكعبات في الحث 2 متوسط ​​درجة حرارة مسبقا.
7. نقل تعليق الكلي إلى 24 لوحة جيدا مرفق منخفضة للغاية (ULA) في 1 مل لكل بئر. مراقبة المجاميع تحت المجهر كما موحدة، مجموعات الخلايا ضيقة. احتضان تحت ظروف نقص الأوكسجين حتى يوم 6.

6. القلب الحث المرحلة 3

1. في يوم 6، وإعداد حجم ضروري من المرحلة 3 الحث المتوسطة (حجم = عدد من الآبار × 1 مل). ل1 مل من استكمال القلب الحث المتوسطة، إضافة 2 ميكرولتر حل الأسهم VEGF (تركيز النهائي = 10 نانوغرام / مل)، و 0.5 ميكرولتر من محلول المخزون bFGF (تركيز النهائي = 5 نانوغرام / مل). ضع إعداد المرحلة 3 متوسطة الاستقراء في 37 ° C حمام الماء لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
2. استخدام ماصة 5 مل المصلية لنقل الركام الى 15 مل أنابيب مخروطية، وتجميع ما يصل إلى 10 مل من الركامالصورة في أنبوب.
3. سماح 10 دقيقة وحدات لليستقر. نضح طاف و resuspend المجاميع في درجة حرارة ما قبل المرحلة 3 الحث المتوسطة. باستخدام ماصة 5 مل المصلية أو إعادة توزيع المجاميع في 24 لوحة جيدا ULA في 1 مل لكل بئر.
4. في يوم 10، وإعداد حجم ضروري من المرحلة 3 الحث المتوسطة (حجم = عدد من الآبار × 1 مل) كما في الخطوة 6.1.
5. استخدام ماصة 5 مل المصلية لنقل الركام الى 15 مل أنابيب مخروطية، وتجميع ما يصل إلى 10 مل من المجاميع في أنبوب.
6. سماح 10 دقيقة وحدات لليستقر. نضح طاف و resuspend المجاميع في المرحلة 3 الحث المتوسطة. باستخدام ماصة 5 مل المصلية أو إعادة توزيع المجاميع في 24 لوحة جيدا ULA في 1 مل لكل بئر.
7. احتضان تحت ظروف نقص الأوكسجين لمدة يومين. في يوم 12، وتبدأ احتضان الخلايا في مستويات الأوكسجين normoxic للفترة المتبقية من الفترة الثقافة (37 درجة مئوية، و 20٪ O _2، 5٪ CO _2).
   ملاحظة:بعد هذه النقطة مرة، والخلايا لم تعد مثقف تحت ظروف نقص الأوكسجين.
8. كرر هذا التبادل المتوسطة كاملة (الخطوات 6.2 و 6.3) كل 4 أيام، ابتداء من يوم 14 حتى الحصاد خلية (عادة، لوحظ تركيز cardiomyocyte الذروة بعد 14 يوما من التمايز).

7. تحليل التدفق الخلوي من القلب تروبونين تي (cTnT) تردد التعبير من الناتج Microwell الثقافة

1. فصل المجاميع على النحو التالي:
   1. استخدام ماصة 5 مل المصلية لنقل 1 جيدا من الركام إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. أجهزة الطرد المركزي المجاميع في 50 x ج لمدة 2 دقيقة، ونضح بعناية طاف.
   2. إضافة 1 مل من حل الطازجة حل 1 ملغ / مل كولاجيناز النوع الثاني من الركام. نقل تعليق الكلي لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل. احتضان المجاميع في كولاجيناز من النوع الثاني بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
   3. في اليوم التالي، واستخدام micropipettor P1000 لفصل بلطف المجاميعفي تعليق خلية واحدة متجانسة. إذا المجاميع لا تنأى بسهولة، وتسوية المجاميع، ونضح طاف، واحتضان المجاميع في 700 ميكرولتر من انزيم تفارق ل1-2 دقيقة في RT. ماصة بلطف المجاميع 1-2 مرات مع micropipettor P1000 للفصل.
   4. تمييع انزيم تفارق: إضافة 700 ميكرولتر من غسل المتوسطة التي تحتوي على 14 ميكرولتر من 1 ملغ / مل محلول المخزون الدناز. أخذ عينة 10 ميكرولتر لإجراء تعداد خلايا، وأجهزة الطرد المركزي تعليق المتبقية باستخدام microcentrifuge لمقعد بين كبار في 300 x ج لمدة 2 دقيقة.
2. إجراء تعداد خلايا: وصمة عار في العد عينة 10 ميكرولتر مع حجم مساو من التريبان الأزرق والعد باستخدام عدادة الكريات.
3. إزالة أنبوب 1.5 مل microcentrifuge تحتوي الخلايا المتبقية من microcentrifuge ل. نضح في وطاف resuspend الخلايا، بتركيز 200،000 إلى 500،000 خلية لكل ميكرولتر 100، في هانكس المتوازن محلول الملح التي تحتوي على2٪ مصل بقري جنيني (HF).
4. لكل حالة، ونقل 100 ميكرولتر من تعليق خلية لكل بئر إلى 2 آبار لوحة 96-جيدا (لن تكون ملطخة بئر واحدة مع الأجسام المضادة cTnT والآخر سيكون تحكم الأجسام المضادة الثانوية).
5. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف مع micropipettor الأقنية.
6. إصلاح الخلايا: إضافة 200 ميكرولتر من التثبيت الحل (مكون عدة) لكل بئر واحتضان لوحة لمدة 15 دقيقة في RT.
7. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300 x ج لمدة 2 دقيقة. استخدام micropipettor متعددة القنوات لسحب بعناية طاف من الآبار. التخلص من طاف في حاوية النفايات امتصاص العرق.
8. غسل الخلايا الثابتة مرتين: إضافة 200 ميكرولتر من HF إلى كل بئر. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300 x ج لمدة 2 دقيقة. نضح طاف، وكرر الخطوة غسل مرة أخرى. خلايا ثابتة يمكن تخزينها لمدة تصل إلى أسبوع واحد في HF في 4 درجات مئوية.
9. Permeabilize الخلايا:
   1. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300x ج لمدة 2 دقيقة.
   2. إضافة 100 ميكرولتر من Permeabilization الحل (مكون عدة) إلى كل بئر واحتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
   3. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 300 x ج لمدة 2 دقيقة، ونضح طاف.
10. إعداد مزيج الرئيسي لمكافحة cTnT في HF في تركيز الأمثل لعدد الكثير معينة (يجب تحديد تخفيف الأمثل من قبل المعايرة ويتراوح عادة من 1: 500-1: 2000).
11. لكل حالة (2 الآبار في حالة)، إضافة 100 ميكرولتر من مزيج الرئيسي إلى جانب واحد (عينة الملون) و 100 ميكرولتر من HF عادي إلى البئر الأخرى (مراقبة الأجسام المضادة الثانوية). احتضان الخلايا عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
12. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 2 دقيقة. نضح طاف وإضافة 200 ميكرولتر من HF لكل بئر. كرر هذه الخطوة يغسل مرة أخرى.
13. إعداد مزيج الرئيسي من الأجسام المضادة الثانوية. نقل حجم HF الذي يتوافق مع 100 ميكرولتر لكل بئر (مراقبة الأجسام المضادة الثانوية وcTnT-الملون) يتلقون العلاج. إضافة 1 ميكرولتر من الماعز المضادة للماوس-APC الأجسام المضادة الثانوية في 200 ميكرولتر من HF (1: 200 تمييع).
14. وصمة عار على العينات. إضافة 100 ميكرولتر من حل تلطيخ على كل بئر (كل من السيطرة الأجسام المضادة الثانوية والآبار ملطخة مكافحة cTnT). احتضان خلايا في الظلام في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (الحفاظ على لوحة مغطاة أو في الظلام بعد إضافة الضد الثانوية الفلورسنت لتجنب photobleaching من).
15. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 2 دقيقة. نضح طاف وإضافة 200 ميكرولتر من HF لكل بئر. كرر هذه الخطوة يغسل مرة أخرى.
16. نقل العينات إلى 5 مل تدفق جولة أسفل الكريات أنابيب تحليل وأداء التدفق الخلوي للإشارة في قناة APC باستخدام البروتوكولات القياسية للصك ^19.

النتائج

على نحو فعال المجاميع التي تسيطر عليها حجم hPSCs سيتم تشكيلها باستخدام نظام microwell، تعتمد فقط على تركيز الخلايا ومساحة microwell. بعد الطرد المركزي قصيرة، يتم إحضارها الأعداد المناسبة من الخلايا (1000 في هذا البروتوكول) معا في كل microwell (الشكل 1A). الأهم من ذلك، هذه الخلايا تأسيس اتصالات بين الخلايا خلال 24 ساعة، ويجب أن لم يعد ملء البئر، ولكن يبدو كما المجاميع التعاقد مع حواف ناعمة (الشكل 1B). وتوفر هذه المجاميع على المواد الأولية لمزيد من التمايز نحو مصير القلب. إذا فشلت الخلايا لتشكيل مجموعات ضيقة، وهذا يشير إلى احتمال موت الخلية التالية التفكك وإعادة تجميع، ومدى ملاءمة الركض الخلية ومثبط ROCK تركيزات واحدة للحصول على خط خلية معينة ينبغي أن تدرس. الأيام الثلاثة التالية في microwells تظهر تغيرا طفيفا في مورفو الكلي بليد الحركة، على الرغم من أن بعض النمو هو واضح. عند إزالتها من microwells، يجب أن المجاميع الحفاظ على الجولة، مورفولوجيا معبأة بإحكام وتكون ذات حجم مماثل لبعضها البعض (الشكل 1C). والثقافة في ULA 24 لوحات جيدا تسمح مزيد من التوسع الخلايا والنمو.

يوم 8، بعد تعرض الأول لActivin الإشارات، وتثبيط WNT، وسوف تبدأ المجاميع لتبدو وكأنها المجاميع أكبر وأكثر إشراقا (1D الشكل). خلال هذه الفترة، والحطام الخلوي كبير يكون واضحا في الجزء السفلي من كل جانب، ويجب أن يتم التوقف عن السماح المجاميع ليستقر قبل إزالة وسائل الإعلام. في بعض الأحيان، فإن العديد من المجاميع تلتحم مع بعضها. هذا لن تحول دون التفريق بين المجاميع الأخرى في البئر، على الرغم من أن هذه "المجاميع سوبر" لا تميل إلى إظهار التغيرات المورفولوجية رأينا مع مجاميع أصغر وأقل عرضة للخضوع التمايز الكامل.

"jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> استمرار النتائج التمايز في التغيرات المورفولوجية ملحوظا في المجاميع مع زيادة حجم ومظهر المناطق الليفية المنظمة. يوم 12، وحدات التعاقد يمكن ملاحظتها. وسوف يكون دائما تتكون هذه الخلايا كبيرة وشفافة وغالبا ما تشمل المصفوفة خارج الخلية واسعة خارج مجموع المباراتين (الشكل 2). في حين تقلصات واسعة الإجمالية، تشير إلى وجود تمايز ناجحة والتعبير علامة القلب ويمكن أيضا أن تراعى في المجاميع التي لا تظهر للتعاقد. وبعد تفكك وحدات العمل وimmunolabeling، فإن الغالبية العظمى من الخلايا تكون إيجابية لcTnT cardiomyocyte علامة التدفق الخلوي (الشكل 3). التعبير عن هذه العلامة هو مستقر في الخلايا ويمكن ملاحظة في المجاميع في وقت متأخر من يوم 19 من التمايز.

1.JPG "/>
الشكل 1: الجدول الزمني للhPSC متباينة نحو مصير القلب مباشرة بعد تجميع الخلايا ملء ما يقرب من كل microwell (A). في وقت لاحق يوم واحد، يبدو المجاميع مكثف وسلس (B). استمر هذا التشكل حتى عندما تتم إزالة الركام من microwells ومطلي في لوحات جيدة (C). يوم 8، تبدأ المجاميع لتوسيع ويبدو أخف في اللون (D). شريط مقياس: 250 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: المجاميع تبدأ المتعاقدة التي كتبها يوم 12 من التمايز بعد، لوحظت تقلصات على نطاق مجموع قوية ستة أيام في قلب الحث المرحلة 3 متوسط (أعلى لوحة: الاسترخاءأوجه والمتوسطة لوحة: انكماش). مشتق لوحة أقل من طرح لوحات العليا والمتوسطة، مع معظم اختلافات كبيرة كما تظهر سوداء أو بيضاء (السهام). شريط مقياس: 250 ميكرون الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 3: Immunolabeling عن القلب تروبونين تي في المتباينة hPSCs في يوم 17، ومعظم الخلايا إيجابية لتي تروبونين القلب عن طريق التدفق الخلوي (شغل في الرسم البياني). كما هو مبين خلايا ملطخة الضد الثانوية وحدها (الرسم البياني شاغرة). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

وقد لوحظ أن التمايز القلب كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة هي عملية شديدة التباين. وفي حين أنه ليس من المستغرب أن خطوط مختلفة من الخلايا يحمل نزعات مختلفة للقدرة التمايز إلى أنواع معينة من الخلايا، فقد لوحظ أن كفاءة التمايز القلب يتقلب بشكل كبير بين تكرار يدير باستخدام نفس خط ⁶ خلايا. بروتوكول الموصوفة هنا يتناول مصدر رئيسي واحد من هذا التغير عن طريق التحكم مباشرة في عدد الخلايا مساهمة في مجموع المباراتين. لمزيد من خفض التباين بين أشواط، فمن المستحسن أن خطوط hPSC تكييفها لالركض خلية واحدة تستخدم، حيث إن هذا النوع من توسعة وصيانة النتائج hPSC في السكان المحفزة أكثر اتساقا مع الاحترام لترددات التعبير عن علامات تعدد القدرات (على سبيل المثال، Oct4، NANOG، هيئة تنظيم الاتصالات-1-60، الخ.).

البروتوكول كما هو مكتوب هنا يحدد حجم الكلي من 1000 الخلايا للسالحث القلب ptimal من الجنينية خط الخلايا الجذعية HES-2. لتطبيق هذا البروتوكول على خطوط مختلفة من الخلايا، فمن الأهمية بمكان أن يتم إجراء شاشة الأولية حجم الكلي لتحديد الحجم الأمثل الكلي خلية خط معين. في حين أنها لا تؤثر بشكل مباشر على الإجراءات الواجب اتباعها هنا، أن نذكر القارئ أن التغيرات في حجم الكلي وكثافة الخلايا الشاملة من المتوقع أن تؤثر على تسليم الأكسجين. قد يصبح هذا عاملا مهما في التطبيقات المصب. بالإضافة إلى ذلك، أفكارك موت الخلية هو مصدر قلق خلال تفكك hPSCs إلى الخلايا وحيدة. لذا، فمن الأهمية بمكان لضمان المانع ROCK موجودا خلال تجميع خلية القسري في microwells. وأخيرا، فمن الأهمية بمكان أن يوم 4 من التمايز المجاميع يتم غسلها جيدا لإزالة أثر Activin A، موجودة في متوسط ​​التعريفي 1، قبل إعادة تعليق في الحث 2 متوسط. بعد يوم 4 من التمايز، Activin ويعزز الأديم التمايز على حساب المتوسطديرم تحريض ^20.

التطبيق الرئيسي من هذه التقنية هو لفحص الأحجام الإجمالية التي تعزز التفرقة القلب كفاءة. ومع ذلك، واحدة من القيود المفروضة على تقنية الحالية هو أنه يمثل تحديا لتوسيع نطاق إنتاج القلب إلى المستويات ذات الصلة سريريا باستخدام لوحات microwell. ويتم على نطاق وتتكون من التمايز القلب عادة في ظروف ثقافة السائبة في المفاعلات الحيوية تعليق أثار ^21. لذلك، مرة واحدة تم استخدام نظام microwell لتحديد نطاقات مقبولة من حجم الكلي لتحريض القلب كفاءة، فإن الخطوة التالية لزيادة هي تحديد سرعات مفاعل حيوي المكره التي يمكن أن تولد المطلوب حجم الخلية مجموع المباراتين.

أحد الفروق الهامة لهذه التقنية فيما يتعلق بأساليب أخرى للتمايز القلب مقرها الكلي، غير أنه يمكن التحقيقات المباشرة في تحوير آثار إشارات الذاتية في المجاميع وكذلكالثقافة المشتركة من أنواع الأنسجة الاستقرائي / المثبطة مع hPSCs في الكلي ^13. هذه الأنواع من التحقيقات يمكن أن تبلغ تطوير عملية الإنتاج القلب على نطاق واسع.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biological safety cabinet
Pipette aid
Serological pipettes (5 to 25 ml)
Aspirator
Aspirator or Pasteur pipettes
15 and 50 ml conical tubes
Fume hood
0.22 µm syringe filter
5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator			Hypoxic (low oxygen) incubator
5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator
Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder
P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips
Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives
Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates	Corning/Costar	3473
1.5 ml microcentrifuge tubes
Bench-top microcentrifuge
L-Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4403
Sterile Ultrapure distilled water	Sigma-Aldrich	W3500
Vortex
Ice
-20 °C freezer
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 °C for up to 3 months, -20 °C is recommended for long-term storage.
StemPro-34 Medium	Thermo Fisher Scientific	10639-011	Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 °C and the basal medium at 4 °C.
Transferrin	Roche	10652202001
BMP-4	R&D Technologies	314-BP
bFGF	R&D Technologies	233-FB
VEGF	R&D Technologies	293-VE
Activin A	R&D Technologies	338-AC
IWP-2	Reagents Direct	57-G89
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	14190
Bovine Serum Albumin (BSA)	Thermo Fisher Scientific	15561
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	258148	Corrosive
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12660
100x Penicillin/Streptomycin	Thermo Fisher Scientific	15140
100x L-glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030
Knockout Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
TrypLE Select	Thermo Fisher Scientific	12563	Dissociation enzyme
Hemocytometer
Trypan Blue
Aggrewell 400 plates	StemCell Technologies	27845	Microwell Plates
Aggrewell Rinsing Solution	StemCell Technologies	7010	Microwell Rinsing Solution
Y-27632 ROCK Inhibitor	Tocris	1254
Collagenase Type II	Sigma-Aldrich	C6885
Hank's Balanced Salt Solution	Thermo Fisher Scientific	14025092
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	12483
96 well plate (for FACS staining)
Intraprep Permeabilization Reagent	Beckman Coulter	IM2389	Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic
cTnT antibody	Neomarkers	MS-295
goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher	Molecular Probes	A865
5 ml round bottom flow cytometry tubes	FACS machine dependent