JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This protocol describes customizable surface functionalization of the desthiobiotin, streptavidin, and APTES system in order to isolate specific cell types of interest. In addition, this manuscript covers the applications, optimization, and verification of this process.

Abstract

One of the limiting factors to the adoption and advancement of personalized medicine is the inability to develop diagnostic tools to probe individual nuances in expression from patient to patient. Current methodologies that try to separate cells to fill this niche result in disruption of physiological expression, making the separation technique useless as a diagnostic tool. In this protocol, we describe the functionalization and optimization of a surface for the cellular capture and release. This functionalized surface integrates biotinylated antibodies with a glass surface functionalized with an aminosilane (APTES), desthiobiotin and streptavidin. Cell release is facilitated through the introduction of biotin, allowing the recollection and purification of cells captured by the surface. This release is done through the targeting of the secondary moiety desthiobiotin, which results in a much more gentle release paradigm. This reduction in harsh reagents and shear forces reduces changes in cellular expression. The functionalized surface captures up to 80% of cells in a single cell mixture and has demonstrated 50% capture in a dual-cell mixture. Applications of this technology to xenografts and cancer separation studies are investigated. Quantification techniques for surface verification such as plate reader and ImageJ analyses are described as well.

Introduction

مقعد بين كبار نهج فصل الخلية الحالية (على سبيل المثال، مضان خلية تنشيط الفرز 1، القبض على الليزر الجزئي تشريح 2، المناعية المغناطيسي حبة الفصل 1) يمكن أن يستغرق عدة ساعات من التحضير والفرز. ويمكن لهذه جداول زمنية كبيرة تؤثر على مستويات الاستجابة والتعبير الفسيولوجية، مما أدى إلى التحليلات التي لا تمثل الاستجابة الفسيولوجية 3. هناك حاجة إلى الأنظمة التي يمكن أن بسرعة وكفاءة عزل أنواع معينة من الخلايا دون تعطيل سطح الخلية مستقبلات المستويات من أجل تحسين العزلة خلية وإثراء للتطبيقات الطبية الحيوية. ولذلك، فإن الأساس المنطقي لنهجنا هو وضع نهج لطيف لعزل الخلايا.

في "مختبر على رقاقة" مفهوم يقدم الوعد أوامر من حجم أسرع العزلة الخلية (ساعات إلى دقائق)، وغالبا ينطوي التقاط الخلايا على سطح والإفراج عن الخلايا أو الخلايا كونتياليلة من خلال البدني 4،5 أو الطرق الكيميائية 6. على الرغم من أن هذه المناهج تقدم بعض المزايا مثل تحديد تعبير البروتين 7،8، وتحديد الحمض النووي الريبي التعبير 9-11، أو حتى توفير خلايا للثقافة في المختبر 12،13، وكثير من هذه التقنيات لا يمكن ترجمتها إلى التشخيص مثل التنميط مستقبلات الخلايا المقرر مع بيئاتها غير الفسيولوجية. وكلاء رفع الأنزيمية مثل collagenases يمكن أن تؤثر أيضا هذه الكميات مستقبلات 14،15، وهذا يعني تقنيات مستقبلات الخلية الكمي التي تستخدم هذه العوامل رفع لن توليد البيانات الفسيولوجية دقيقة. تحلل الخلايا يمنع التمايز بين مستقبلات سطح الأم، وتلك التي تم المنضوية سابقا 16. يصف هذا البروتوكول نهج سريع ولطيف لعزل الخلايا.

Protocol

1. تنظيف سطح الزجاج وإعداد الكواشف

  1. وضع سطح الزجاج في جهاز البلازما الأكسجين لمدة 5 دقائق في السلطة 50٪ لتنظيفه.
  2. إعداد المعاد (3-أمينو) triethoxysilane (APTES) حل 2.5 مل 2٪، وذلك بإضافة 50 ميكرولتر من APTES و 2.45 مل من الايثانول في أنبوب مخروطي الشكل.

2. APTES وجهاز تسوية المنازعات Functionalization

  1. إضافة حل APTES إلى السطوح. ماصة 150 ميكرولتر لكل بئر لمدة 8 لوحات جيدا. ماصة 100 ميكرولتر لكل بئر لمدة 24 لوحات جيدة. ماصة 1.1 مل لأطباق زجاجية 60 × 15 مم. تغطية الأسطح لمنع التبخر والتوزيع غير المتكافئ للحل APTES. وضع الأسطح على شاكر منصة لمدة 50 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، مما يخلق حتى توزيع طبقة APTES.
    ملاحظة: APTES هو aminosilane التي تشكل الطبقة الأولى من السطح. في حالة استخدام سطح مختلفة، وتحديد تجريبيا حجم الحل اللازم لتغطية السطح.
  2. تحديد درجة الحرارة للفرن، في حين أن الأسطح وعلى شاكر: الحرارة إلى 55 درجة مئوية لمدة 2 ساعة ل8 لوحات جيدة و 24 لوحات جيدة. الزجاج الحرارة أطباق فقط إلى 90 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
  3. شطف الأسطح مع الايثانول.
    1. إدارة كمية الإيثانول المطلوبة من قبل المراجع على أساس السطح المستخدمة. إضافة 150 ميكرولتر الإيثانول إلى كل بئر لمدة 8 لوحات جيدا. إضافة 125 ميكرولتر الإيثانول إلى كل بئر لمدة 24 لوحات جيدة. إضافة 1.1 مل ايثانول لأطباق الزجاج.
    2. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح. شطف مرتين أكثر باستخدام الايثانول.
      ملاحظة: إذا كان أي من الزجاج لوحات جيدا أسفل لديك أي البلاستيك في نفوسهم، لا تسخن لها فوق 65 درجة مئوية، كما ستبدأ البلاستيكية الى الذوبان والاعوجاج.
  4. الجافة مع غاز النيتروجين 100٪ الاستغناء من دبابة. وضع الأسطح في سفين.
  5. إعداد 2.5 مل من د-desthiobiotin (DSB) حل عن طريق الجمع بين 1.5 ملغ / مل جهاز تسوية المنازعات 37.5 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، و 5 ملغ / مل 1-إيثيل-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) في 2462،5 ميكرولتر من (MES) (الرقم الهيدروجيني 6) عازلة 0.1 M 4-morpholinoethanesulfonic هيدرات حمض. ثم الجمع بين كل الحلول.
  6. إضافة 1 ميكرولتر من المركابتويثانول 2-β، بعد 15 دقيقة، إلى حل لإرواء التفاعل بين جهاز تسوية المنازعات وتنمية الصادرات. إزالة APTES الساخنة functionalized الواجهات الزجاجية من الفرن. الانتظار 5-10 دقيقة عن الواجهات الزجاجية لتبرد.
  7. إضافة MES العازلة السطح لشطف، وذلك باستخدام كميات تستند على السطح. إضافة 150 ميكرولتر MES عازلة على كل جانب لمدة 8 لوحات جيدا. إضافة 125 ميكرولتر MES عازلة على كل جانب لمدة 24 لوحات جيدة. إضافة 1.1 مل MES عازلة للأطباق الزجاج.
  8. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرةإلى السطح. شطف مرتين أكثر مع العازلة زارة التربية والعلم.
  9. تطبيق حل جهاز تسوية المنازعات إلى السطوح للسماح لهم لاحتضان. إضافة 150 حل جهاز تسوية المنازعات ميكرولتر لكل بئر لمدة 8 لوحات جيدا. إضافة 100 حل جهاز تسوية المنازعات ميكرولتر لكل بئر لمدة 24 لوحات جيدة. إضافة 1.1 مل حل الزجاج أطباق جهاز تسوية المنازعات.
  10. ضع الواجهات الزجاجية جهاز تسوية المنازعات غطت على منشفة ورقية رطبة داخل طبق بتري. تغطية واحتضان في 4 درجات مئوية البراد لمدة 18-24 ساعة.

3. Streptavidin Functionalization

  1. شطف كل سطح الزجاج ثلاث مرات مع 1 مل من 1.0X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح. تمييع الحل streptavidin (SAV) الأسهم إلى 0.4 ملغ / مل (مستحسن).
    ملاحظة: برنامج تلفزيوني غير متساوي التوتر لذلك يمكن استخدامها كوسيلة لتخفيف والشطف. يستخدم برنامج تلفزيوني كمذيب لSAالخامس، وبالتالي، لن تؤثر على قدرة SAV الربط إلى السطح.
  2. تطبيق 0.4 ملغ / مل من محلول SAV بالتساوي على الأسطح بحيث طبقة رقيقة من الأشكال في الجزء السفلي من الزجاج، وتحديد مقدار حل يقوم على السطح. لمدة 8 لوحات جيدا، إضافة 150 ميكرولتر 0.4 ملغ / مل حل SAV لكل بئر. 24 لوحات جيدا، إضافة 100 ميكرولتر 0.4 ملغ / مل حل SAV لكل بئر. لأطباق الزجاج، إضافة 1.1 مل 0.4 ملغ / مل حل SAV.
  3. تغطية ونقل لوحات إلى 14 سم طبق بتري على الاحتفاظ بالرطوبة. احتضان طبق بيتري في الثلاجة لمدة 18-24 ساعة.
    ملاحظة: من الضروري الاستفادة من كميات ثابتة من APTES، جهاز تسوية المنازعات، والسيارات الرياضية متعددة الاستخدامات على كل سطح.
  4. شطف كل سطح الزجاج ثلاث مرات مع 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لإزالة السيارات الرياضية متعددة الاستخدامات. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح.
  5. الرطب منشفة ورقية ثإيث المياه غير المتأينة ووضع منشفة ورقية مسطحة في 14 سم طبق بتري المحيطة لوحات على الاحتفاظ بالرطوبة في الآبار. تغطية طبق بتري تحتوي على الآبار. احتضان طبق بيتري في الثلاجة 4 درجات مئوية السلامة الأحيائية المستوى 1 (BSL-1) لحين الحاجة إليها.

4. القبض على خلية والإصدار

  1. تبدأ مع قارورة T175 (ق) من خلايا المعدة للتجربة. نضح في وسائل الاعلام من قارورة (ق). تغسل وسائل الإعلام المتبقية مع 5 مل من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. نضح في برنامج تلفزيوني من القارورة (ق).
  2. إضافة 10 مل من وكيل رفع غير الأنزيمية، مثل خلية تفارق الحل، إلى قارورة T-175 من الخلايا. وضع القارورة في الحاضنة لمدة 6 دقائق للسماح للرفع من الخلايا من القارورة.
  3. بعد 6 دقائق، إضافة 10 مل من محلول الملح الباردة هانك المتوازن (HBSS، انظر قائمة من المواد) لتعطيل وكيل رفع. إخراج 20 ميكرولتر من الخلايا لحساب عدد الخلايا في حل باستخدام عدادة الكريات.
    ملاحظة: اعتمادا على وظائفهاtionalized الأسطح المستخدمة في التجربة القبض، وعدد من الخلايا اللازمة يختلف. لfunctionalized 8 لوحات جيدا، استخدام 300،000 الخلايا لكل بئر. لأطباق الزجاج functionalized، استخدم 1.1 مليون الخلايا. لfunctionalized 24 لوحات جيدة، ينصح 125،000 الخلايا. تم العثور على مزيد من المعلومات حول عد الخلايا في الملحق.
  4. كرر الخطوات من 4.1- 4.3 لقارورة أخرى من الخلايا، إذا أقل من الخلايا موجودة من اللازم للتجربة. الجمع بين الايقاف الخلية والخلايا إعادة فرز الأصوات للحصول على العدد الكلي للخلايا في الحل.
  5. تدور باستمرار تعليق خلية في جهاز للطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية للحصول على بيليه الخلايا المركزة. العثور على كمية مناسبة من HBSS إضافة إلى تعليق خلية للحصول على تركيز 1 × 10 6 خلايا لكل مل، ثم نضح طاف من الخلايا نسج أسفل، وإضافة كمية محسوبة. ويمكن حساب هذا الصوت باستخدام المعادلات في الملحق.
  6. ماصة صعودا وهبوطا (يسحن) ل resuspend عشرخلايا الإلكترونية في حل والحد من تراكمها الخلوي في الحل الذي قد يقلل من الأجسام المضادة ملزمة. تقسيم حل الخلوي إلى تحكم منفصلة والحلول التجريبية. عرض ملف إضافي لمكونات والحسابات.
  7. إضافة الأجسام المضادة المعقدة البيروكسيديز إلى حلول خلية منها كما هو موضح في ملف إضافي. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية على نهاية الإفراط في نهاية خلاط.
    ملاحظة: للحصول على خلايا MCF7GFP، 0.5 ملغ / مل hIgG أو 0.5 ملغ الأجسام المضادة / مل HLA-ABC الموصى بها. لالضامة الخام، ينصح 1 ملغ / مل mCD11b في نصف حجم لحساب الفروق التخفيف. لخلايا الحبل السري الإنسان الوريد غشائي (HUVECs)، و 0.5 ملغ / مل ينصح hCD31.
  8. غسل سطح الزجاج functionalized مع HBSS. لهذه التجربة، وينصح لوحة 8 جيدا.
    1. إضافة 150 ميكرولتر HBSS إلى كل بئر لمدة 8 لوحات جيدا. شطف مرتين أكثر باستخدام HBSS. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر.عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح. الحفاظ على البارد في 4 درجات مئوية.
  9. إضافة حلول الخلية إلى الآبار وانتظر 45 دقيقة للخلايا لاحتضان على الجليد على شاكر. جعل حل البيوتين في العقيمة HBSS باستخدام وحدات التخزين المحسوبة على النحو المبين في الملحق.
  10. إزالة حل الخلية من الآبار الزجاج باستخدام HBSS.
    1. ماصة بلطف 150 ميكرولتر HBSS في كل بئر. ثم ماصة خارج HBSS. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح.
    2. كرر مرتين أخريين. بعد الغسيل، إضافة HBSS إلى الآبار للحفاظ على الخلايا رطبة.
  11. إضافة 150 ميكرولتر من 20 ملي حل البيوتين إلى كل إصدار منها بشكل جيد، ومن ثم الانتظار 20 دقيقة للسماح للرد فعل.
  12. يتذكر خلية غير ملزمة على وجه التحديدالصورة عن طريق الغسيل مع HBSS كما ذكر أعلاه، ومن ثم إذا باستخدام خلايا fluorescently المسمى، انتقل إلى مضان صورة الخلايا. أيضا صورة الخلايا الحية في قارورة (كعنصر تحكم، لمقارنة مع الخلايا في البئر). في حالة استخدام الخضراء بروتين فلوري (GFP) خلايا transfected، فإن الإثارة ستكون 470 نانومتر، وسوف يكون انبعاث 515 نانومتر.

5. الضد الأمثل: الأضداد المعايرة

  1. تبدأ برفع الخلايا من T75 أو T175 قارورة كما هو موضح في الخطوة 4.1- 4.3.
    ملاحظة: يتم معايرة هذه الكميات لمدة 24 لوحات جيدة، ولكن يمكن تغييرها لتتناسب مع أي الواجهات الزجاجية functionalized من خلال اختبار الكشف عن مجريات الأمور. ويرد المعايرة الأجسام المضادة ممثل في الشكل 1.
  2. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، ثم تدور إلى أسفل حل الخلية في أنبوب مخروطي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إعادة الخلايا إلى 1 مليون خلية لكل مليلتر، وذلك باستخدام الحسابات الموضحة في الملحق.
  3. تقسيم م 1خلايا illion في حل مل إلى ستة حلول مختلفة من 500 ميكرولتر في أنابيب الطرد المركزي المختلفة للأجسام المضادة (أ ب) الحلول.
    1. تمييع الحل الأسهم الأجسام المضادة إلى 10 ميكروغرام / مل، 1 ميكروغرام / مل، 100 نانوغرام / مل، 10 نانوغرام / مل، 1 نانوغرام / مل. إنشاء عناصر التحكم باستخدام 100 ميكرولتر من وصمة عار العازلة (PBS + 1٪ أزيد الصوديوم + 1٪ BSA)، و 500 ميكرولتر من الخلايا للسيطرة مع عدم وجود أب في ذلك. من أجل السيطرة فارغة (لا أب ولا خلايا)، واستخدام محلول من 300 ميكرولتر برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: تنبيه: أزيد الصوديوم هو شديد السمية، المتفجرة، ويجب توخي الحذر الشديد عند استخدامه. يرجى الاطلاع على ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) واستخدام معدات السلامة المناسبة.
  4. الجمع بين واحتضان الحلول أب مع حلول الخلية في نهاية الإفراط في نهاية خلاط عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. شطف functionalized 24 لوحات جيدة مع HBSS ثلاث مرات. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد بيpette في ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح.
  5. قسامة 125 ميكرولتر من كل عينة حل في APTES المناسبة، جهاز تسوية المنازعات، والسيارات الرياضية متعددة الاستخدامات functionalized بشكل جيد. احتضان عند 4 درجات مئوية أو على الجليد لمدة 45 دقيقة على سطح الزجاج. شطف السطح مع HBSS ثلاث مرات لإزالة الخلايا المرفقة غير وجه التحديد. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح. لا شطف الصف السفلي، وتلك هي الضوابط.
  6. إضافة 150 ميكرولتر من HBSS لكل غسلها جيدا، ووضع 24 لوحات جيدة على الجليد، ومن ثم استخدام قارئ لوحة لقياس مضان من الخلايا GFP (الإثارة 485 نانومتر / الانبعاث 528 نانومتر).

6. خلية الأمثل: المعايرة خلية

  1. رفع الخلايا كما هو مذكور في الخطوات 4.1 -4.3.
  2. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. تدور باستمرار الخلية بحيثlution في أنبوب مخروطي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إعادة الخلايا إلى 1 مليون خلية لكل مليلتر.
    ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات حول استخدام عدادة الكريات في الملحق: ملاحظة.
  3. ماصة 1.6 مل من محلول خلية للسهم 1.6 مليون خلية وضعها في أنبوب مخروطي الشكل. ماصة 800 ميكرولتر من الخلايا من حل الخلية للسهم 800،000 الخلايا ومكان في أنبوب مخروطي الشكل. ماصة 80 ميكرولتر من الأسهم خلية للسهم 80،000 الخلايا ومكان في أنبوب مخروطي الشكل. ماصة 8 ميكرولتر من الأسهم خلية للسهم 8000 الخلايا ومكان في أنبوب مخروطي الشكل.
    تعطى التركزات في 8 قياسات لوحة جيدا، وتكرار حسب الحاجة: ملاحظة. ويرد مثال عن الإخراج لوحة في الشكل 2.
  4. اتخاذ الحلول الأسهم الأربعة، وتدور في أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. اعادة تعليق جميع الحلول الأسهم في 400 ميكرولتر من HBSS.
  5. إضافة 1.6 ميكرولتر من 100 نانوغرام / مل الأجسام المضادة إلى المخزون 1.6 مليون خلية، 0.8 μل إلى المخزون 800000 خلية، و 0.5 ميكرولتر لجميع أسهم أخرى. احتضان الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة في نهاية الإفراط في نهاية خلاط لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية. غسل سطح الزجاج functionalized مع HBSS ثلاث مرات.
    ملاحظة: ينصح لوحة جيدا functionalized 8 لتقدير المجهري، في حين ينصح functionalized 24 لوحة جيدا لوحة القارئ الكمي. لم تخفض تركيز الأجسام المضادة ل8000 الأسهم خلية للسماح للعامل يحد من السطح القبض على أن لا يكون عدم وجود الأجسام المضادة في الحل، بل خصائص التقاط من السطح.
  6. تطبيق 150 ميكرولتر من الحلول العينة إلى كل بئر. تطبيق الأوراق المالية 1.6 مليون خلية في العمود الأول من الآبار على اليسار. تطبيق الاسهم 800،000 الخلية إلى العمود الثاني من اليسار. تطبيق الأوراق المالية 80،000 الخلية إلى العمود الثالث من اليسار. وأخيرا تطبيق الاسهم 8000 خلية إلى العمود الأخير. احتضان لمدة 45 دقيقة في 4 درجات مئوية على شاكر.
    ملاحظة: 1600000يخدم الأسهم الخلية مثل أعلى تركيز لفحصها، وهو ضعف كمية الخلايا التي تستخدم عادة في التجارب فصل الخلية (600000 خلايا لكل بئر) يقدم الاسهم 800000 خلية حيث السيطرة للتجربة كما هو تركيز الخلوي نموذجي التي يتم استخدامها في التجارب فصل الخلية (3،000،000 خلايا لكل بئر). يقدم الأوراق المالية 80،000 خلية كونها انتقاصا عشرة أضعاف لاختبار تركيز أقل لالتقاط الخلوي (30000 خلايا لكل بئر). يقدم الاسهم 8000 خلية كما مائة تخفيف أضعاف لاستخدام بمثابة اختبار للتحقق الحد الأدنى من الفصل الخلوي (3000 خلايا لكل بئر).
  7. شطف مع HBSS ثلاث مرات. شطف السطح من خلال التفريغ ورسم السائل من نقطة ثابتة مثل زاوية البئر. عقد ماصة على ما يقرب من 70 درجة زاوية بحيث لا يتم أشار غيض مباشرة إلى السطح. جمع كل يغسل.
  8. صورة الخلايا على المجهر مضان، إذا كان استخدام 8 لوحات جيدا، والتقاط صور من كل سورالوجه، وتطبيق 150 ميكرولتر البيوتين على كل سطح لمدة ساعة واحدة على 4 درجات مئوية على شاكر. بعد ساعة واحدة، وشطف الآبار الإفراج البيوتين مع HBSS 3 مرات كما كان من قبل. جمع كل يغسل من الآبار لحساب مع عدادة الكريات وصورة الآبار الافراج عنهم.
  9. تطبيق 150 ميكرولتر من 20 ملي حل البيوتين الزائدة المناسبة الآبار الإفراج البيوتين لمدة 1 ساعة، إذا كان استخدام 24 لوحات جيدا، ثم شطف تلك الآبار 3 مرات مع HBSS. Quantitate 24 لوحات جيدا باستخدام قارئ لوحة. استخدام عدادة الكريات لحساب الخلايا من جميع يغسل جيدا جمعها.

تحليل 7. صورة

ملاحظة: ينصح حزمة البرامج فيجي (http://fiji.sc/Fiji) لتحليل الصور. في البداية، تم تحويل الصور إلى صورة رمادية، وبعد ذلك تم تغيير السطوع / التباين لاخراج الخلايا.

  1. تصل حمولة الصورة، وتحويله إلى الرمادي بالنقر فوق علامة التبويب صورة ثم التمرير لأسفل إلى "نوع" ثم النقر فوق4؛ 8 بت ".
  2. زيادة على النقيض من الصورة عن طريق النقر فوق علامة التبويب صورة ثم التمرير الى "ضبط". انقر على "السطوع والتباين"، ومن ثم استخدام أشرطة التمرير لجعل خلايا تبرز. في حالة استخدام الصور مضان، عكس الصور لجعل الخلايا أكثر تحديدا.
  3. تحميل البرنامج المساعد على طالب يماغيج ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) لتحليل الصور.
  4. فتح ITCN. عندما يظهر مربع الحوار الذي يطالب المستخدم مع العديد من المعلمات لتقدير حجم الخلية، تعيين الحد الأدنى للعرض الخلية من الفائدة لأول مرة. انقر فوق الخيار "كشف الظلام قمم" إذا كانت الصورة الفلورية وغطت الخلايا.
  5. تعيين قيمة العتبة في 2 في البداية، ومن ثم الضغط على زر "العد". وهناك نسخة عد حديثا من الصورة تظهر مع النقط الحمراء ترسيم حيث تم فرز الخلايا.
  6. ضبط العتبة وعرض المعلمة للحصول على البيانات الخلوية أكثر دقة definiنانوغرام حجم "خلية". ملاحظة: عدد الخلايا عدها سوف تكون في مربع الحوار على اليمين. سوف المعلمات تغيير تعطي عدد مختلف من الخلايا فرزها.
  7. الاستمرار في تكرار خلال المعلمات عتبة والعرض حتى يتم التوصل إلى تقدير جيد لعدد من الخلايا.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول نظهر القبض على خلية (الشكل 3A) والافراج عن خلية (الشكل 3C) من خلايا MCF7GFP وكذلك الضوابط الخلية الحية (الشكل 4). نحن كميا القبض على خلية كما تم الإفراج عن 60٪ و 80٪ (الشكل 3C). كان عندما مددنا هذا النه?...

Discussion

تحسينات في تقنيات عزل الخلايا تعزز في الدراسات العلمية في العلاقات هيكل الوظائف في علم الأعصاب 18، وقف برمجة الخلايا في علم الأحياء التجديدي، ويشير عائية في البيولوجيا الوعائية 19. في الواقع، ثقافة الخلية الأولية 20 (على سبيل المثال، HUVECs) في علم ا...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank the American Cancer Society, Illinois Division (282802) and the National Science Foundation CBET (1512598) for funding support. We also would like to thank Dr. Dianwen Zhang from the University of Illinois Beckman Institute for microscopy training. Finally, we would like to thank Jared Weddell, Stacie Chen, and Spencer Mamer for insightful discussions.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES)Acros Organics919-30-2Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner PicoDienerModel 1Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB)SigmaD20655Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. 
dimethyl sulfoxide (DMSO)British Drug Houses (BDH)BDH1115-1LPDissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC)Thermo-Scientific5g: 22980
25g: 22981		Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slideBD FalconCase of 24: 354118
Case of 96: 354108		Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well platesMatTekP24G-0-13-FUsed in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
MercaptoethanolScience Lab60-24-2Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate
(MES Hydrate 99%)		Fisher ScientificAC172590250Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision OvenThermo Scientific11-475-153Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 ShakerHeidolph13-889-420Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg]Proteo Chem9013-20-1Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass DishFisher Scientific08748AUsed in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with CoverSigma-AldrichZ717231Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cellsCell BiolabsAKR211Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophagesATCCTIB-71Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLELife Technologies12605036Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle mediumCell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC50003PCSupplier: Corning
Nonessential amino acidsCell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC25-025-CIAlready added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraperFisher Scientific12-565-58Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation SolutionCorningMT-25-056CIUsed to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
HemacytometerHausser02-671-54Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
BiotinAmresco58-85-5Used to release cells from surface.
HBSSCreated from RecipeN/AUsed to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC AntibodyBioLegend311402Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG AntibodyBioLegendHP6017Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cellsCell BiolabsAKR-211Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted ConicalsThermo-Scientific15mL: 12-565-26850/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer)Fisher Scientific05-450-127Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope)ZeissN/AZeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columnsThermo-ScientificPI-87770Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation KitThermo- ScientificUsed to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate ReaderBioTekSynergy HTX Multimode ReaderUsed to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.

References

  1. Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
  2. De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
  3. Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
  4. Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
  5. Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
  6. Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
  7. Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
  8. Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
  9. Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
  10. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
  11. Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  12. Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
  13. Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
  14. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
  15. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791 (2012).
  16. Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
  17. Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
  18. Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  19. Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
  20. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  21. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
  22. BD Biosciences. . CD Marker Handbook: Human and Mouse. , (2010).
  23. Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
  24. Perritt, D., Wong, P., Macpherson, J. L., Henrichsen, K., Symonds, G., Pond, S. . Processing Blood. , (2014).
  25. Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
  26. dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
  27. Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
  28. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  29. Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
  30. Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
  31. Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
  32. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
  33. Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
  34. Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434 (2013).
  35. Hornes, E., Korsnes, L. . Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. , (1996).
  36. Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
  37. Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115 desthiobiotin SAV functionalization APTES MCF7 GFP 264 7

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved