JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Cancer cells are embedded in a collagen gel and then sandwiched in an acellular fibrin gel to generate a 3D culture system in which the invasiveness and formation of satellite tumors may be monitored.

Abstract

يستخدم على نطاق واسع الثقافة خلايا الثدييات في الطبقات الوحيدة لدراسة مختلف العمليات الفسيولوجية والجزيئية. ومع ذلك، فإن هذا النهج لدراسة نمو الخلايا غالبا ما يولد الآثار غير المرغوب فيها. ولذلك، زراعة الخلايا في (3D) بيئة ثلاثية الأبعاد، وغالبا ما تستخدم مكونات المصفوفة خارج الخلية، ظهرت كبديل للاهتمام بسبب التشابه الوثيق للمواليد في أنسجة الجسم الحي أو الجهاز. قمنا بتطوير نظام زراعة الخلايا 3D باستخدام اثنين من مقصورات، وهما (ط) في المقصورة المركزية التي تحتوي على الخلايا السرطانية جزءا لا يتجزأ من التمثيل جل الكولاجين وجود ورم macrospherical الزائفة الأساسي و (ب) حجرة خالية من الخلايا الطرفية المصنوعة من هلام الليفين، أي عنصر المصفوفة خارج الخلية مختلفة عن تلك المستخدمة في المركز، والتي الخلايا السرطانية يمكن ترحيل (غزو الجبهة) و / أو تشكل الأورام microspherical تمثل أورام ثانوية أو الأقمار الصناعية. تشكيل الأورام الأقمار الصناعية في المقصورة المحيطيةالمترابطة بشكل ملحوظ إلى العدوانية المعروفة أو الأصل المنتشر من الخلايا السرطانية الأم، مما يجعل هذا النظام الثقافة 3D فريدة من نوعها. قد يعتبر هذا النهج زراعة الخلايا لتقييم السرطان غزو الخلية والحركة، والتفاعلات مصفوفة الخلايا خارج الخلية وكوسيلة لتقييم خصائص للأدوية المضادة للسرطان.

Introduction

التحقيق في الخصائص الأساسية والطبية الحيوية من غزو الخلايا السرطانية / الهجرة وإنشاء ورم خبيث لاحقا هو موضوع من 1،2 أبحاث مكثفة. الانبثاث هي المرحلة النهائية من السرطان وتبقى إدارتها السريرية بعيد المنال. وهناك فهم أفضل لورم خبيث على المستويات الخلوية والجزيئية تمكن من تطوير علاجات أكثر فعالية 3.

يمكن استكشاف العديد من الخصائص من الخلايا المتنقل في المختبر 4 بما في ذلك stemness وإمكاناتهم للحصول على الحالة الانتقالية (على سبيل المثال،-شبيه الظهارة الوسيطة الانتقالية) لترحيل وغزو داخل ومن الورم الرئيسي 5. ومع ذلك، فإن التقييم في المختبر من العمليات / ورم خبيث الغزو تحديا لأنه يستثني عمليا مساهمة الدم / الدورة اللمفاوية. الثقافات عضوي النمط أن تضمين شظايا ورم في المواد الهلامية الكولاجين لها بريفيوخبيث تم استخدامها لرصد سرطان العدوانية. وعلى الرغم من الحفاظ على تعقيد الأورام (على سبيل المثال، وجود خلايا غير سرطانية)، تتعرض أجزاء الورم لنشر المتوسطة محدود، لاختلاف أخذ العينات، وإلى فرط نمو خلايا انسجة 6. يتكون طريقة بديلة في زراعة الخلايا السرطانية ضمن مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM)، الذي يحاكي ثلاثية الأبعاد (3D) بيئة الخلية. انتشار خطوط خلايا سرطان الثدي في هلام الكولاجين و / أو مصفوفة المستمدة غشاء الطابق السفلي هو من بين الأمثلة أفضل وصف للثقافة خلية 3D. باستخدام بيئات محددة ثقافة الخلية 3D، والتجمع غير منظم لوحظت في خلايا سرطان الثدي نمت في ظل ظروف قياسية يمكن عكسها إلى تشكيل عفوية من عنيبات ​​الثديية والهياكل الأنبوبية 7-10. وعلاوة على ذلك، وتشكيل الأجسام الشبه الكروية المتعددة الخلايا السرطانية المشتقة من الخلايا السرطانية غدية تجمعوا باستخدام تقنيات مختلفة (على سبيل المثال، والشنق قطرات، الكروية العائمة، أجار الغرز) يشكل الآن الأكثر شيوعا خلية 3D ثقافة الفحص 11-13. ومع ذلك، هذا الاختبار محدودة بسبب مجموعة محدودة من خطوط الخلايا السرطانية التي يمكن أن تشكل الكروية والفترة القصيرة المتاحة لدراسة الخلايا في هذه الظروف.

في هذه التقنية تصور، ونحن هنا إدخال خلية 3D فحص ثقافة متطورة حيث هي جزء لا يتجزأ الخلايا السرطانية من الفائدة في جل الكولاجين للسماح للتشكيل في المختبر وجود ورم شبه الأساسي الذي يمكن أن تطلى بدلا من ذلك مع قبو مصفوفة المشتقة من الغشاء. تشكلت مرة واحدة، ثم يتم رطة الورم شبه أساسي في مصفوفة ديكي (هلام الليفين في هذه الحالة)، والذي يسمح للخلايا السرطانية عبر واجهة بين المقصورات مصفوفة اثنين (انظر الشكل 1). ومن المثير للاهتمام، ويبدو أن هياكل تشبه الورم الثانوية الناشئة من الورم الزائفة الأساسي جنبا إلى جنب مع الخلايا السرطانية العدوانية فيهلام الليفين. يوفر هذا النظام الثقافة 3D المرونة المطلوبة للتحقيق، على سبيل المثال، الأدوية المضادة للسرطان، التعبير الجيني وخلية خلية و / أو التفاعلات خلية ECM 14-16.

figure-introduction-2886
الشكل 1: لمحة عامة عن أسلوب ملخص تخطيطي لطريقة لتوليد خلية نظام الثقافة 3D كنموذج لدراسات السرطان الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

ملاحظة: لا تنظر الأخلاق منذ الخلايا السرطانية البشرية الحيوانية وتم شراؤها أو وفرت لنا بلطف.

1. جعل الكولاجين المقابس (الزائفة الأساسي ورم)

  1. إعداد تشتت الكولاجين. النوع الأول من الكولاجين من الأوتار ذيل فأر (RTT) يمكن إما استخراج وتعقيمها كما ذكرت سابقا 17، أو شراؤها. تفريق تجميد المجفف RTT الكولاجين (3،25-3،50 ملغ / مل في 0.02 N حمض الخليك) باستخدام خلاط (الإعداد عالية السرعة، وخمسة أشواط 2 دقيقة) لخلط موحد.
  2. حصاد (التربسين-EDTA، عادة) واستخدام الأزرق الاستبعاد التريبان لحساب خلايا قابلة للحياة باستخدام عدادة الكريات. ضبط لكثافة الخلايا المطلوبة (5 × 10 4 خلايا لكل المكونات).
  3. إعداد جميع الحلول (هيدروكسيد الصوديوم، مصل بقري جنيني، DMEM 5X، NaHCO 3) بشكل منفصل (الجدول 1) تحت ظروف معقمة والحفاظ المبردة على الجليد. ملاحظة: ترتيب بالإضافة لمختلف الحلول مهم لمنع الصدمات التناضحي أو الحمضية في الخلايا.
  4. أداء تشتت الخلية (1.25 × 10 6 خلايا) في حل الكولاجين النهائي (5 مل) في أسرع وقت ممكن. تخلط جيدا (قبل pipetting صعودا وهبوطا) مع تجنب فقاعات الهواء، ثم سرعان ما توزيع 200 ميكرولتر من الحل الجاهز للاستخدام في كل بئر من لوحة 96-جيدا. ضرب بلطف لوحة متعددة جيدا على سطح منطقة عمل الخلية هود الثقافة لإزالة فقاعات الهواء ونشر حل بالتساوي داخل الآبار.
  5. بعد ملء جميع الآبار (هذه الخطوة يستغرق حوالي 15-20 دقيقة لكل لوحة 96 أيضا)، واحفظها في الحاضنة.
  6. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في الفترة من 2 ساعة ليلة وضحاها. الكولاجين دبق (أي اللييفات) تحدث في غضون 30 دقيقة. إضافة مستنبت (100 ميكرولتر / جيد) للثقافة لإجراء الحضانة بين عشية وضحاها.

2. الطبقة الأولى من الليفين جل

  1. إعداد الحل الفيبرينوجين.
    ملاحظة: ينبغي من الناحية المثالية نفس دفعة من هلام الليفين أن تستخدم لبالنتيجه أكثر استنساخهالخبر، قد تختلف تشكيل هلام كما الليفين بين دفعات مختلفة من الفيبرينوجين تجميد المجفف التجاري.
    1. دائما استخدام الحل الفيبرينوجين الطازجة. جلب الفيبرينوجين تجميد المجفف إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتح قارورة لتجنب تشكيل الكريستال الهيدرات.
    2. تدريجيا حل الفيبرينوجين في قبل حرارة (37 درجة مئوية) هانك المتوازن محلول الملح (HBSS) مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+ بتركيز عمل 3 ملغ / مل (النظر في إعداد فائض 15٪ من الحد الأدنى للحجم النهائي المطلوب : على سبيل المثال، 17.25 ملغ في 5.75 مل عن حل 5 مل).
      1. إضافة استعد قبل HBSS قطرة قطرة في البداية لإذابة شظايا الفيبرينوجين. كسر شظايا أكبر مع ملعقة في كوب. تستنهض الهمم كوب من وقت لآخر لتسهيل الخلط. لا تستخدم لوحة النمام أثناء العملية. حل مسحوق المتبقية قبل pipetting تعليق صعودا وهبوطا.
    3. حافظ على حل الفيبرينوجين فاتر بينما ستيريLIZING الحل عن طريق تمرير من خلال مرشح 0.22 ميكرون. ملاحظة: إذا كان HBSS ليس دافئا بما يكفي أو الفيبرينوجين لا حلت تماما، والحل قد يعوق التصفية. إذا كان ذلك ممكنا، استبدال الفلتر مرة أو مرتين، والذي قد يقلل من تركيز الفيبرينوجين، وصلابة وبالتالي الجلطة الفيبرين.
    4. تعليق الخلايا من الفائدة (على سبيل المثال، الخلايا البطانية) إلى حل الفيبرينوجين جاهزة للاستخدام في حين ضبط الحجم النهائي لها، وإجراء بديل.
  2. إعداد حلول الثرومبين.
    1. يعد حل الأسهم في ده 2 O (50 المعاهد الوطنية للصحة وحدة / مل)، ثم تعقيمها باستخدام فلتر 0.22 ميكرون.
    2. استخدام الفيبرينوجين نسبة / الثرومبين ≥1: 0.0075 (ت / ت) من أجل توليد هلام الليفين.
  3. توليد جل الليفين.
    1. الحفاظ على الفيبرينوجين معقمة والثرومبين الحلول الأسهم على الجليد خلال كل الخطوات المقبلة. يسمح المواد الهلامية الليفين لتشكيل في 24 لوحات جيدا.
    2. عشر تراكب فوراالسطح (ه) من كل جيدا مع الحل الفيبرينوجين (200 ميكرولتر / جيد) مع تجنب تشكيل فقاعة الهواء. معالجة 6 آبار في وقت واحد.
    3. بمجرد حل الفيبرينوجين يغطي كامل سطح الآبار، إمالة لوحة في زاوية 45 درجة وإضافة 1.5 ميكرولتر من محلول الثرومبين لأول بئر بإسقاط الثرومبين في وسط البئر، ثم دوامة بلطف لوحة أفقيا ل 1-2 ثانية.
      1. ترك لوحة في وضع مستقر تحت غطاء تدفق الصفحي (5-10 دقيقة) حتى اكتمال عملية دبق / تخثر (ملحوظة: يجب ألا تضطرب عملية البلمرة، على سبيل المثال، عن طريق نقل لوحة إلى الحاضنة).
    4. بمجرد بلمرة الآبار الستة الأولى، وتكرار نفس تسلسل (أي 3 خطوات السابقة) لآبار الستة المقبلة إلى أن يتم معالجة كافة الآبار.

3. الطبقة الثانية من الليفين جل وتقع الكولاجين التوصيل

  1. خيارج: (باستخدام الكولاجين التوصيل مباشرة).
    1. تأكد من أن الطبقة الأولى من هلام الليفين تمت بلمرة في جميع الآبار عن طريق إمالة بدقة لوحة. وضع لوحة 96-جيدا تحتوي على الجانب المقابس جل الكولاجين إلى جنب مع لوحة 24-جيدا (التي تحتوي على المواد الهلامية الليفين) لتخفيف نقل المقابس الكولاجين.
    2. إضافة قطرة واحدة من HBSS في كل بئر من لوحة تحتوي على شمعات الكولاجين.
    3. إزالة كل المكونات الكولاجين من البئر مع إبرة رقيقة شنت على حقنة (التي تستخدم كمقبض) أو باستخدام ملعقة صغيرة (انظر الفيديو). نقل كل المكونات الكولاجين على الطبقة الأولى هلام الليفين باستخدام واحد أو اثنين من ملاعق صغيرة، في حين التأكد من أن المكونات الكولاجين يتركز بشكل جيد في البئر والمحافظة على العقم أيضا.
    4. تراكب هلام الليفين شكلت سابقا مع الطبقة الثانية من الحل الفيبرينوجين (300 ميكرولتر / جيد) وإدخال الثرومبين كما هو موضح في 2.3، والحفاظ على الحد الأدنى من 1: 0.0075 نسبة وسلسلة من ستة آبار في وقت
  2. الخيار باء (طلاء والكولاجين التوصيل مع طبقة رقيقة من انخفاض عامل نمو الغشاء القاعدي (GFRBM)).
    1. بارد كل الحلول الجاهزة والأدوات مسبقا والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية أو على الجليد (على سبيل المثال، الماصات، نصائح، وأنابيب الاختبار) أثناء التعامل مع منذ قسامات المجمدة من GFRBM حساسة جدا لمعدل التسخين المفرط أثناء ذوبان (اتبع إرشادات الشركة المصنعة) .
    2. بعد إزالة من الآبار لوحة، ونقع كل المكونات الكولاجين لمدة 2 دقيقة في أنبوب الطرد المركزي 1.5 مل على الجليد تحتوي على 100 ميكرولتر من حل GRFBM النقي.
    3. نقل كل المكونات المغلفة على طبقة الفيبرين الأولى مع ضمان أنها تركزت بشكل جيد، كما هو موضح سابقا. احتضان لوحات تحتوي على المكونات عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق للسماح للGRFBM لتشكيل مادة هلامية. إضافة طبقة الفيبرين الثانية كما في الخطوة 3.1.4.

4. خلية الثقافة شروط المتوسطة

  1. ملء كل بئر مع الثقافة المتوسطة (400 ميكرولتر). وسيتم اختيار وسائل الإعلام والثقافة، والمكملات الغذائية على أساس خط الخلية والظروف التجريبية.
  2. إضافة أبروتينين، وكيل مضاد حل الفبرين، إلى مستنبت بتركيز نهائي من 100 وحدة كاليكريين المانع (الاتحاد الإسلامي الكردستاني) / مل.
    ملاحظة: تخزين لوحات في حاضنة الثقافة خلية في ظل الظروف المستخدمة في خط الخلية التي تم اختبارها.
  3. تجديد الثقافات مع المتوسط ​​الطازجة كل يوم أو وفقا للجدول الزمني التجريبي، وإضافة أبروتينين. قبل إضافة متوسطة جديدة، والميل قليلا لوحة (بزاوية 30-35 درجة) وانحدر الماصة ضد الجانب من البئر بينما شفط بعناية المتوسطة مكيفة تحت الملاحظة المستمرة.

النتائج

كما ذكر سابقا، ميزة مثيرة للاهتمام من هذا الاختبار زراعة الخلايا 3D هي أن الخلايا السرطانية لا يمكن ترحيل فقط من المكونات الكولاجين لهلام الليفين المجاور، ولكن أيضا إنشاء الأورام الثانوية (هياكل مثل الأقمار الصناعية الورم تشبه). هذا يمكن ملاحظ?...

Discussion

كما حاشية فنية مهمة، فمن الضروري أن توجد فجوة موجودة في واجهة بين الحكومة المركزية والمواد الهلامية الطرفية. خلاف ذلك، قد يقلل من قدرة الخلايا على الهجرة / غزو الجل الليفين. مسافة بين الكولاجين والمواد الهلامية الليفين قد تشكل خلال ال 24 ساعة الأولى للثقافة إذا الثروم...

Disclosures

The authors have no disclosure.

Acknowledgements

Work partially funded by Prostate Cancer Canada (grant # D2014-4 to SG and CJD) and the Canadian Institutes of Health Research (grant # MOP-111069 to SG). We would like to thank Dr. Richard Poulin for editorial assistance and Mrs. Chanel Dupont for technical assistance.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Freeze-dried collagenSigma-AldrichC7661from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14)
Fibrinogen (freeze-dried)Sigma-Aldrich F8630Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable
ThrombinEMD Chemicals Inc.605157 Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight 
Growth factor-reduced Matrigel Corning356234Previously from BD Biosciences
AprotininSigma-AldrichA6279  solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) 
 Micro-spoonsFisher Scientific2140115Fisherbrand Handi-Hold Microspatula
96 well plate, round baseSarstedt3925500
24 well plateSarstedt3922
Dulbecco's modified Eagle's MediumSigma Chemical, Co.D5546DMEM
Fetal Bovine SerumVWRCAA15-701FBS, Canadian origin.
Trypsin-EDTASigma Chemical, Co.T4049
Hank’s Balanced Salt Solution Sigma Chemical, Co.H8264HBSS

References

  1. Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).
  2. Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv Drug Deliv Rev. , (2016).
  3. Bill, R., Christofori, G. The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality. FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).
  4. Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
  5. Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
  6. Sykes, J. A., Fogh, J. Separation of Tumor Cells from Fibroblasts. Human Tumor Cells In Vitro. 1, 1-22 (1975).
  7. Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture. Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).
  8. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  9. Shaw, L. M. Tumor cell invasion assays. Methods Mol. Biol. 294, 97-105 (2005).
  10. Nelson, C. M., Bissell, M. J. Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation. Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).
  11. Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines. Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).
  12. Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery. Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).
  13. Neto, A. I., et al. A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening. Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).
  14. Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System. Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).
  15. Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity. Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).
  16. Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene. Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).
  17. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).
  18. Horie, M., et al. Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model. Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
  19. Banyard, J., et al. Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer. BMC Cancer. 30 (14), 387 (2014).
  20. Palumbo, J. S., Degen, J. L. Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis. Haemostasis. 31, 11-15 (2001).
  21. Dvorak, H. F. Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy. Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).
  22. Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability. Genome Integr. 4 (1), 5 (2013).
  23. Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening. Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).
  24. Longati, P., et al. 3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing. BMC Cancer. 13 (95), (2013).
  25. Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
  26. Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors. Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).
  27. Lang, N. R., et al. Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks. Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

114 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved