رواية استكشاف كائن باعتباره الفحص المحتملة لالعالي ترتيب المتكرر السلوك في الفئران

Summary

Higher order restricted, repetitive behaviors (RRBs) disrupt the lives of affected individuals. These behaviors are challenging to model in rodents, making basic biomedical research into potential treatments or interventions for RRBs difficult. Here we describe novel object exploration as a potential assay for higher order RRBs in mice.

Abstract

Restricted, repetitive behaviors (RRBs) are a core feature of autism spectrum disorder (ASD) and disrupt the lives of affected individuals. RRBs are commonly split into lower-order and higher-order components, with lower order RRBs consisting of motor stereotypies and higher order RRBs consisting of perseverative and sequencing behaviors. Higher order RRBs are challenging to model in mice. Current assays for RRBs in mice focus primarily on the lower order components, making basic biomedical research into potential treatments or interventions for higher-order RRBs difficult. Here we describe a new assay, novel object exploration. This assay uses a basic open-field arena with four novel objects placed around the perimeter. The test mouse is allowed to freely explore the arena and the order in which the mouse investigates the novel objects is recorded. From these data, patterned sequences of exploration can be identified, as can the most preferred object for each mouse. The representative data shared here and past results using the novel object exploration assay illustrate that inbred mouse strains do demonstrate different behavior in this assay and that strains with elevated lower order RRBs also show elevated patterned behavior. As such, the novel object exploration assay appears to possess good face validity for higher order RRBs in humans and may be a valuable assay for future studies investigating novel therapeutics for ASD.

Introduction

اضطراب طيف التوحد (ASD) هو اضطراب النمو العصبي يتكون من ثلاثة أعراض أساسية هي: ضعف الاجتماعي، صعوبة في التواصل من خلال اللغة، والسلوك المزخرفة المتكررة ^1. منذ عام 2000، زاد عدد الأفراد الذين تم تشخيص مع ASD من 1 في 150-1 في 68 في غضون عشر سنوات ^(2). على الرغم من انتشار الفوضى في تزايد مستمر، وسبب هذا الاضطراب غير معروف حتى الان. كان هناك ارتفاع في الجهود المبذولة لتحديد نماذج الماوس مناسبة للجوهر والأعراض المرتبطة بها من ASD، وهذه النماذج يمكن أن يؤدي إلى زيادة فهم الأعراض والأسباب الكامنة وراء ASD. هناك عدة سلالات الفئران الفطرية التي تظهر لعرضه السلوكيات مع وجه صلاحية الأعراض الأساسية من ASD، بما في ذلك السلوكيات المتكررة ^3.

مقيدة، والسلوكيات المتكررة (RRBs) هي أعراض الأساسية لبعض الاضطرابات النفسية مثل التوحد.يمكن RRBs زيادة مع شدة اضطراب ^4، ويمكن أن يحدث خللا جذريا في نمط حياة الأفراد المتضررين. توضع RRBs عادة إلى فئتين، النظام أقل السلوكيات المتكررة، والتي تتكون في البشر من الإجراءات مثل هزاز وجهة الخفقان؛ والعليا السلوكيات المتكررة، والتي تتكون من الالتزام الصارم روتين ومقاومة التغيير ^5-8.

وقد تم ترتيب انخفاض السلوكيات المتكررة درس على نطاق واسع في القوارض حيث أنها تظهر كما stereotypies السيارات، والتي يمكن ملاحظتها بسهولة في وضع مختبر ^9. ويبدو أن هذه السلوكيات لدينا جيدة صحة الوجه لRRBs في البشر، وصحة بناء يحتمل أن تكون قوية وكذلك ^(10). يمكن أن تكتمل اختبار لوجود انخفاض RRBs النظام من خلال رصد الفيديو من النشاط الماوس لدراسة نوبات ومدة هذه stereotypies السيارات ^11. العليا السلوكيات المتكررة تشكل تحديا لإعادة الحيوية الطبية الأساسيةبحث الاستفادة من القوارض، كما لم يتم تحديد هذه RRBs بسهولة من خلال الملاحظة البسيطة. ويرجع ذلك إلى صعوبة في تحديد هذه السلوكيات، المقايسات أنشئت أقل للالعليا تكرار السلوك موجودة. تقليديا، وقد تم قياس RRBs العليا في القوارض باستخدام نموذج المتاهة حيث يتم تدريب الحيوان اختبار للوصول إلى الكفاءة في الهرب. ثم يتم تبديل موقع الهروب ويتم تسجيل عدد من التجارب اللازمة لإعادة تعلم موقع هروب ^12. هذه المقايسات ليست مثالية لأنها تحتاج إلى فترة تدريب طويلة، وغالبا ما حمل والقلق، ويمكن أن يؤدي إلى نتائج متباينة للغاية. وقد استخدمت أيضا استكشاف حفرة مجلس لتحديد العليا RRBs ^13،14. لا يتطلب هذا النهج دورات تدريبية طويلة، ولكن لا تعتمد على التحفيز الغذاء و / أو التمييز حاسة الشم. فحوصات لأعلى RRBs أجل أن لا anxiogenic أو تتطلب أن يكون التدريب تكملة لطيفة إلى مرجع القائمة من ثقب مجلس exploratio ن والمقايسات القائم على متاهة قيد الاستخدام حاليا.

وC58 / J (C58) الفطرية سلالة الماوس مثالا قويا على مستويات عالية من السلوك النمطية المرتبطة ASD، وهي المتكررة، stereotypies محرك هدف معين ومستويات مرتفعة من الذات والاستمالة ^3،11. بالإضافة إلى ذلك، الفئران C58 عرض RRBs من خلال مستويات عالية من تربية، والعودة التقليب ويحفرون ^11،14،16. يبدأ هذه السلالة تظهر هذه السلوكيات في فترة ما بعد الولادة في وقت مبكر ويستمر عرضها طوال فترة البلوغ. سيكون من المثالي أن تكون قادرة على اختبار وجود ارتفاع العليا RRBs لاستكمال موثقة جيدا أقل RRBs أجل موجودة في هذه السلالة فضلا عن غيرها من سلالات الفئران. فحص استكشاف وجوه الرواية الموصوفة هنا يوفر الفرصة للباحثين لمراقبة النظام أقل وRRBs العليا في وقت واحد، كما أنه يعطي القدرة على قياس سلوكيات نمط وكذلك stereotypies السيارات المتكررة.

وقد وضعت e_content "> عن طريق التنقيب وجوه الرواية بمثابة فحص للالعليا السلوكيات المتكررة من قبل بيرسون وآخرون. ^(17). هذا التقييم الجديد هو امتداد لاختبار حقل مفتوح راسخة ^18-21 مع إضافة أربعة أشياء جديدة ل سمح للالفئران الساحة. التحقيق بحرية هذه الكائنات غير المألوفة وعدد وترتيب التحقيقات كائن تم تعقب ثم تم تحليل التحقيقات كائن لوجود أنماط، مع الفئران BTBR عرض أرقام مرتفعة من التحقيقات منقوشة بين الكائنات. باستخدام هذا الفحص، يمكن أن الفئران عرض أعلى من الدرجة السلوكيات المتكررة ومنقوشة في حين القضاء على الحاجة إلى تعلم السلوكيات وكذلك إزالة المثيرات التي لا داعي لها. استكشاف وجوه رواية يدفع RRBs العليا، كما أنه يسمح للفئران لخلق أنماط وتسلسل شكل من خلال استكشافهم الطبيعي وباستخدام هذا الاختبار يسمح للمحقق لتحديد وجود هذه RRBs العليا.

بيرسون وآخرون. وضعت هذا الاختبار واستخدامه لاختبار وجود المحتملة أعلى ترتيب السلوكيات المتكررة في BTBR سلالة الماوس الفطرية، وكانت النتائج مثيرة للاهتمام ^(17). لقد نشرت مؤخرا دراسة متابعة النظر في سلوكيات C58، C57BL / 6J (C57) و / نيو جيرسي (FVB) سلالات FVB، فضلا عن تحقيق أكثر تفصيلا في المتغيرات التي قد تثير اللبس الحالي في هذا الاختبار، وممكن النهج الإحصائية لتحليل البيانات ولدت ^22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وتمت الموافقة على بروتوكول الموصوفة هنا من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة ريدلاندز. كانت ولدت الفئران C58، C57، وFVB المستخدمة في هذه الدراسات في جامعة ريدلاندز الحظيرة من الأسهم التي تم الحصول عليها في الأصل من مختبر جاكسون (بار هاربور، ME). تم فحص الحراس من هذه الحظيرة كل ستة أشهر، وجدت لتكون خالية من مسببات الأمراض.

1. المعدات وغرفة اقامة

ملاحظة: استخدمنا اثنين من الساحات المختلفة للاختبار وجوه رواية: من البلاستيك واضحة قفص مستطيل (45 سم × 24 سم × 20 سم) أو قفص دائري شفاف مع قطر القاعدة 41 سم؛ ومع ذلك، يمكن استخدام أي القفص. بيرسون وآخرون تستخدم قفص مستطيل أصغر (20 سم × 30 سم × 20 سم) في رزنها. وترد تفاصيل عن هذا التصميم التجريبي محدد أدناه، ولكن نظرا لحداثة هذا الاختبار، لا توجد معايير المقبولة في مجال phenotyping السلوكية لأي من المتغيرات وصفها.

ملء اختبار الساحة مع ما يقرب من نصف في الفراش الذرة قطعة خبز.
1. حدد أربعة أشياء جديدة مختلفة. حدد أربعة الأشياء التي هي تقريبا نفس الحجم، مصنوعة من البلاستيك عالية الكثافة لتسهيل عملية التنظيف ومقاومة مضغ وتختلف عن بعضها البعض في شكل ولون. الأهم من ذلك، ضمان عدم تعرض أن الفئران اختبار لهذه الكائنات حتى يتم تشغيلها في الفحص.
   ملاحظة: على سبيل المثال، استخدمت لعبة الطوب الوردي، قرد أحمر، البلاط الأبيض مع الكتابة الزرقاء ويموت الأبيض القياسية هنا.
2. في الساحة المستطيلة، ضع هذه الكائنات حوالي 3 سم من الزوايا. في الساحة المستديرة، ووضع الأشياء مثل أن تكون على مسافات متساوية من بعضها البعض، وحوالي 10 سم من الجانبين. تسجيل وضع كل كائن كرقم مختلفة، 1-4 (الشكل 1). ضمان أن يتم وضع الكائنات في ترتيب عشوائي أو مواجهته طوال الاختبار.
3. وضع الكاميرا مباشرة فوق اختبارالساحة لتسجيل الساحة بأكملها خلال التأقلم واختبار فترات.
   ملاحظة: وجود محققين في نفس الغرفة مع الفئران يمكن أن تؤثر يحتمل أن تكون مستويات النشاط والاستكشاف خلال الاختبار.

2. كائن رواية استكشاف اختبار

1. اختبار في بداية دورة الخفيفة في غرفة مضاءة مع الإضاءة الفلورسنت في ما يقرب من 100 لوكس. تأكد من أن الإضاءة موحدة عبر اختبار الساحة لتوحيد مظهر أثناء تسجيل الفيديو.
2. وضع notecard من الأبعاد المعروفة في الجزء السفلي من اختبار الساحة والبدء في تسجيل الفيديو.
3. نقل الماوس الاختبار إلى الاختبار الساحة فارغة لمدة 10 دقيقة لتكون بمثابة فترة تأقلم. تسجيل الفيديو من فترة تأقلم.
4. بعد فترة التأقلم، وترك الماوس في الساحة، بسرعة إضافة الكائنات الجديدة أربعة إلى الساحة اختبار وتسجيل سلوك الماوس لمدة 10 دقيقة إضافية.
5. مرة واحدة في 20 دقيقة التأقلم كاملة / المؤسسة العامة الاختبارانقضت هذه الشبكة، وعودة الماوس اختبار لفي قفص المنزل ونظيفة تماما ويجف الكائنات الجديدة واختبار الساحة مع صحن الصابون نسكينتيد والمياه.

3. فيديو التهديف

1. استكمال جميع السلوك التهديف استخدام الفيديو لتسهيل الموثوقية.
   ملاحظة: تم استخدام برنامج تسجيل السلوكي Noldus المراقب لتنفيذ الخطوات ²² كما هو موضح هنا، ولكن برنامج متخصص وليس من الضروري:
   1. قبل وسجل أول شريط فيديو، وإعداد مشروع نظام الترميز في برنامج تسجيل السلوكي عن طريق إنشاء مشروع جديد أو عن طريق تحرير، مشروع مماثل القائمة.
      1. داخل مربع إعداد مشروع، تعيين الحصول على البيانات إلى "مراقبة غير متصل". ضمن سلوك الترميز مربع، برنامج "الخربشة"، "حفر"، "تربية"، "الاستمالة" و "شم كائن 1 و 2 و 3 و 4" ب "أحداث الدولة". برنامج "القفز" على أنه "الحدث نقطة. ملاحظة: تعريفموصوفة الصورة لهذه التصرفات بالتفصيل في مكان آخر ^(11).
         ملاحظة: الدولة الفعاليات لها بداية ووقف الوقت، في حين أن نقطة أحداث ببساطة جمع بيانات العد. يتم إنشاء المفاتيح لكل سلوك منفصلة من قبل البرنامج ومبرمجة هذه المفاتيح المقابلة في لوحة المفاتيح الثانوي (الخطوة 3.1.2).
      2. لبرمجة لوحة المفاتيح الثانوي، فتح البرنامج لوحة المفاتيح، انقر على الزر المناسب الثانوي لوحة المفاتيح المعروضة على الشاشة، اكتب في مجموعة المفاتيح المناسبة، ثم انقر فوق موافق. مرة واحدة وتمت برمجته لوحة المفاتيح الثانوي، أغلق البرنامج كبرنامج سوف تعمل في الخلفية للكمبيوتر.
   2. مرة واحدة وقد تم تعيين المشروع وحتى، واستخدام برنامج تسجيل السلوكي ليسجل عدد ومدة المؤخرات (كما هو موضح على حد سواء الكفوف الأمامية التي وضعت على جدار الساحة)، يحفر (كما هو موضح اثنين من الجبهة الكفوف من الفأرة تختبئ في الفراش من الساحة)، العرسان الذاتي (كما هو موضح م[أوس] لعق أي منطقة من الجسم الخاص بهم و / أو الماوس لمس أي جزء من الوجه مع الكفوف الأمامية)، ويقفز (كما هو موضح في تربية الماوس ومن ثم القفز بحيث كل أربعة أقدام هي من الأرض في وقت واحد).
      1. ليسجل الفيديو، انتقل إلى ملف> فتح المشروع ثم لاحظ> المراقبة> جديد. يطالبك البرنامج لاسم الملف. مرة واحدة عن اسمه، حدد ملف وسائط الفيديو المناسب.
      2. بدء التسجيل عن طريق النقر على زر بدء المراقبة.
         ملاحظة: عندما احرز الماوس تكرار السلوك، كل دولة أحداث تتطلب اثنين من ضربات المفاتيح، وأول الموافق الشروع في السلوك والثانية المقابلة لنهاية السلوك. تتطلب نقطة أحداث فقط ضغطة واحدة.
   3. تسجيل عدد المرات الماوس مشموم كل كائن. يتم تعريف الشمة كما أي وقت الماوس يتحرك أنفها تقع ضمن نطاق 0.5 سم من كائن. قياس مدة شم باستخدام برنامج تسجيل السلوكي في بنفس الطريقة التي repetتم قياس فترات السلوك مكنته (الخطوة 3.1.2).
      1. في كل مرة الماوس الشمة كائن، وتسجيل عدد موقف المقابلة، الأمر الذي سيؤدي إلى سلسلة من الأرقام قبل نهاية فترة الاختبار 10 دقيقة (على سبيل المثال 1243421 ...). يدويا تسجيل هذه البيانات.
         ملاحظة: لتسهيل الكفاءة والاتساق في حين سجل أشرطة الفيديو، الأرقام تتوافق دائما لموقف معين، وليس الاعتراض.
      2. إذا كان الماوس الشمة كائن، يبدو بعيدا، ثم الشمة الكائن مرة أخرى، عد هذا العدد مرتين.
      3. مرة واحدة وقد سجل الكامل الفيديو 10 دقيقة، تصور البيانات من خلال النقر على تحليل> تحليل السلوك> جديد. بمجرد ظهور البيانات على الشاشة أو تصدير أو نسخ ولصق في جدول منفصل.
   4. وتسجيل المسافة الإجمالية سافر الماوس داخل الساحة خلال الاختبار.
      ملاحظة: تتبع البرامج فيديو، معايرة لتتبع الماوس اختبار وتسجيل المسافة الإجمالية انتقل في سم، وقد استخدملتنفيذ هذه الخطوة. كان جميع مقاطع الفيديو التي سجلها برنامج تتبع الفيديو notecard من الأبعاد المعروفة وضعت في الساحة في بداية الفيديو.
      1. استخدام notecard لمعايرة كل الفيديو داخل البرنامج عن طريق تحديد خط معايرة طول كل نهاية notecard وإدخال الطول المناسب داخل شاشة المعايرة الخاصة بالبرنامج. مرة واحدة يتم رسم خطوط، وإدخال طول المعروفة وعرض notecard التي تتوافق مع كل سطر.
      2. داخل الساحة إعدادات، حدد الساحة بأكملها.
         ملاحظة: يمكن التفريق بين مناطق منفصلة من الساحة في البرنامج إذا، على سبيل المثال، كانت حركة الماوس على طول الجدران مقابل من خلال مركز الاهتمام.
      3. ضمن إعدادات التحكم الابتدائية، حدد مدة عشر دقائق. في إعدادات الكشف، واختيار وجوه الظلام على ضوء الخلفية.
         ملاحظة: يحتاج هذا إلى أن تتغير إذا كانت تستخدم الفئران البيضاء أو إذا كان الخلفية أغمق.
      4. مرة واحدة الإعداداتتم برمجتها، يسجل الفيديو. انقر اكتساب> فتح الاستحواذ. في مربع التحكم اكتساب، انقر محاكمة جديدة ومن ثم بدء المحاكمة. بعد عشر دقائق قد انقضت، يتوقف البرنامج ويمكن تصور البيانات.
      5. انقر فوق تحليل> حساب الاحصائيات. بمجرد ظهور البيانات على الشاشة أو تصدير أو نسخ ولصق في جدول منفصل.

4. التحليلات الإحصائية، تسلسل

1. ضمن سلسلة من الأرقام المقابلة للاعتراض التحقيقات التي تولدها كل فأر، وتحديد العدد الإجمالي للجميع التوليفات 3 أرقام ممكنة بدون أرقام تكرار (مثل 121، 123، 124 ولكن ليس 112 أو 122).
   ملاحظة: تم استخدام برنامج مكتوب في لغة البرمجة بايثون لتحديد عدد المرات التي يظهر فيها كل تسلسل ممكن في سلسلة من الأرقام. وليس من الضروري استخدام برنامج خارجي، ويمكن أن تكتمل هذه الخطوة العديد من الطرق المختلفة (على سبيل المثال باستخدام والبحث عن وظيفة في مايكروسوفت وورد أو إكسل).
2. تسجيل عدد المرات التي يحدث كل تسلسل وتحديد تسلسل الثلاثة الأكثر كثيرا ما تتكرر لكل الماوس.
   ملاحظة: تختلف تسلسل الفردية عن طريق الماوس والتسلسل الفعلي هو من مصلحة أقل من عدد المرات التي تم تكرار تسلسل (أي التزام لنمط أكثر أهمية من النمط نفسه).
3. لأن العدد الإجمالي للتسلسل ويكرر الماوس سوف ترتبط بشكل إيجابي في مستوى النشاط، تصحيح هذه القيم من خلال تقسيم كمية من أنماط الأكثر شيوعا من قبل عدد من أنماط لكل فأر الفردية. هذا وسوف تسفر عن مؤشر تكرار تسلسل التي هي مستقلة عن النشاط العام.
4. مقارنة عدد مرات لكل الماوس يعيد تسلسل الأكثر شيوعا في (تصحيح لمستوى النشاط) بين المجموعات باستخدام أنوفا المناسب، إجراء مقارنة متعددة (اختبار Dunnett، على سبيل المثال) واختبارات بعد خاص.

> 5. التحليلات الإحصائية، الأفضلية كائن

1. باستخدام نفس سلسلة من الأرقام ولدت فوق (الخطوة 3.1.3.1)، وتحديد تفضيل الكائن رواية من كل الماوس عن طريق حساب عدد المرات التي تم التحقيق فيها كل كائن، أو بعبارة أخرى، عد عدد 1 ثانية، 2 ثانية ، 3 ثانية، و 4 ثانية في سلسلة من البيانات. الصحيح لمستوى النشاط ومقارنة عبر أنوفا كما هو موضح أعلاه (الخطوات 4،3-4،4).
   ملاحظة: هذه الأساليب نشرت من قبل مختبرنا ²² و وصفت هنا تستند بشكل كبير على بيرسون وآخرون ^(17).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

البيانات التمثيلية ²² تبين أن C58 الإناث / J الفئران عرض عدد أكبر من أنماط متسلسلة من السلالات الأخرى في الساحة المستديرة (الشكل 2، لوحة أ)، ولكن ليس في الساحة المستطيلة (الشكل 2، لوحة C). أيا من السلالات الثلاث الذكور تختلف عن بعضه...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

هنا، نقدم فحص وضعت مؤخرا والتي قد تكون مفيدة لقياس السلوكيات الفأر مع الوجه صحة لأعلى ترتيب السلوكيات المتكررة في البشر. وخلافا لفحوصات أكثر رسوخا مثل بارنز أو تي المتاهة، هذه الرواية فحص استكشاف كائن لا يتطلب أي تدريب الماوس ولا هو ولا سيما القلق استفزاز. بالإضافة إ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Standard Polycarbonate Rodent Cage (45 cm x 24 cm x 20 cm)			Multiple cages are desirable to facilitate testing of multiple mice
Plastic Opaque Circular Testing Arena (41 cm base diameter)	United States Plastic Corp.	13931	Multiple arenas are desirable to facilitate testing of multiple mice
Standard Corn-Cob Rodent Bedding
Novel Object - red monkey	Hasbro, Pawtucket RI		from Barrel of Monkeys
Novel Object - rectangular 2 x 4 LEGO
Novel Object - tile	Thinkfun Inc., Alexandria VA		from Toot and Otto
Novel Object - standard white die
Video Camera
Behavioral Logging Software - The Observer	Noldus, Wageningen, The Netherlands	other programs may be used
Video Tracking Software - EthoVision	Noldus, Wageningen, The Netherlands	other programs may be used
X-Keys input keyboard	P.I. Engineering, Williamstown MI	829484
MacroWorks II	P.I. Engineering, Williamstown MI