المتعدد الوسائط الكمي المرحلة التصوير مع الرقمي المجسم المجهر يقيم بدقة شفاء المعوية والتهاب الجرح طلائي

Summary

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

Abstract

الإصابة بأمراض الأمعاء الالتهابية، أي مرض كرون والتهاب القولون التقرحي، وزادت بشكل كبير خلال العقد الماضي. مسببات مرض التهاب الأمعاء لا يزال غير معروف، وتستند الاستراتيجيات العلاجية الحالية بشأن قمع غير محدد من الجهاز المناعي. تطوير العلاجات التي تستهدف على وجه التحديد التهاب الأمعاء والتئام الجروح الظهارية يمكن أن يحسن بشكل ملحوظ إدارة مرض التهاب الأمعاء، ولكن هذا يتطلب كشف دقيق للتغيرات التهابية. حاليا، يتم عادة تقييم المرشحين المحتملين المخدرات باستخدام النماذج الحيوانية في الجسم الحي أو مع التقنيات التي تعتمد زراعة الخلايا في المختبر. وعادة ما يتطلب الفحص النسيجي لخلايا أو أنسجة من مصلحة لتكون ملطخة، الأمر الذي قد يغير خصائص العينة وعلاوة على ذلك، فإن تفسير النتائج يمكن أن تختلف من الخبرة محقق. المجهر الثلاثية الأبعاد الرقمية (DHM)، استنادا إلى الكشف عن بصري مسار تأخير طول، يسمحخالية من وصمة عار مرحلة الكمية النقيض من التصوير. وهذا يسمح النتائج إلى أن تكون مرتبطة مباشرة مع المعلمات الفيزيائية الحيوية المطلقة. نحن لشرح كيفية قياس التغيرات في كثافة الأنسجة مع DHM، استنادا إلى قياس معامل الانكسار، ويمكن تحديد حجم التغيرات الالتهابية، دون تلطيخ، في طبقات مختلفة من العينات انسجة القولون من الفئران والبشر يعانون من التهاب القولون. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر مراقبة التسمية خالية المتعدد الوسائط المستمر لالتئام الجروح الظهارية في المختبر، من الممكن استخدام DHM من خلال تحديد الآلية بسيطة من منطقة الجرحى وتحديد وقت واحد من المعلمات المورفولوجية مثل الكتلة الجافة وسمك طبقة من الخلايا المهاجرة. في الختام، DHM يمثل قيمة والرواية وأداة الكمية لتقييم التهاب الأمعاء مع القيم المطلقة للمعلمات الممكنة، وتحديد مبسط لالتئام الجروح الظهارية في المختبر، وبالتالي لديها امكانات عالية لأجلك التشخيص متعديةحد ذاتها.

Introduction

مرض التهاب الأمعاء (IBD)، أي التهاب القولون التقرحي (UC) ومرض كرون (CD) والاضطرابات الالتهابية مجهول السبب من الجهاز الهضمي ^1. البحث في الفيزيولوجيا المرضية الكامنة وراء مرض التهاب الأمعاء وتقييم الأدوية الجديدة المحتملة أو نهج التشخيص الرواية بشكل خاص من حيث الأهمية. في كل من البحوث الأساسية والتدبير السريري للمرضى مرض التهاب الأمعاء، وأصبح الغشاء المخاطي في الأمعاء محط اهتمام ^2،3. يمثل الغشاء المخاطي على الحدود التشريحية، التي التفاعل بين البكتيريا المتعايشة، الخلايا الظهارية والمكونات الخلوية المختلفة للنظام المناعة المعوية تنسق الأمعاء التوازن ^4،5. ومع ذلك، في المرضى الذين يعانون مرض التهاب الأمعاء، غير المنضبط واستمرار التهاب الأمعاء يؤدي إلى المخاطية الضرر، كشفها كما تقرحات أو تضيق، والتي يمكن أن تتوج في النهاية في انهيار وظيفة حاجز الظهارية، والذي في حد ذاته يزيد من تفاقم التهاب المحلي ^6.

طلائي التئام الجروح وبالتالي حاسما لتجديد الظهارية التالية التهاب وإنما هو أيضا شرط الأساسية لشفاء قرحة المعدة والأمعاء أو تسرب تفاغري بعد جراحة الجهاز الهضمي ^7. الجرح الظهارية الشفاء يمكن محاكاة في المختبر في التئام الجروح المقايسات وفي نماذج الفئران من التهاب الأمعاء ^8،9. على حد سواء في التجارب المختبرية والحية النهج على مساوئ، التي تحد من دقة التقييم التجريبي وفي فحوصات المختبر، مثل فحوصات الصفر الكلاسيكية، تتطلب إجراءات تلطيخ مطولة أو ترنسفكأيشن مع حاملات الفلورسنت. غالبا ما تكون محدودة من قبل مراقبة متقطع على تكاثر الخلايا والهجرة التي لا يمكن أن يكون آليا ^(10). وفي النماذج الحية، مثل كبريتات ديكستران الصوديوم (DSS) والتهاب القولون -induced، وكثيرا ما تفتقر قوية للقراءة الرافضة، ويرجع ذلك جزئيا إلى تفاوت كبير ينظر في علامات المختبر، يا أماهملك هذه علامات غير ملائمة لتقييم التهاب القولون شدة ^11،12. تحليل النسيجي من الغشاء المخاطي الملتهبة لا يزال حاليا الأكثر ملائمة لتحديد التهاب القولون شدة ولكن هذا، كما هو الحال في المختبر التئام الجروح المقايسات الظهارية، يتطلب تلطيخ ويعتمد على الخبرات المحقق ^13.

وقد تم تحديد المجهر الثلاثية الأبعاد الرقمية مؤخرا (DHM)، وهو البديل من الكمية المرحلة المجهري ^14، كأداة مفيدة لتقييم الظهارية التئام الجروح في التجارب المختبرية والحية ^15. يسمح DHM تقييم كثافة الأنسجة عن طريق قياس مسار بصري طول تأخير (العيادات الخارجية) ، الذي تشخيص احتمالات سرطان رواية ^16-18 وتقدير من التهاب ذات الصلة التعديلات الأنسجة ^19. بالإضافة إلى ذلك، DHM يسمح رصد ديناميات خلية التشكل من خلال تحديد سمك خلية، خلية غطت مساحة السطح وداخل الخلايا (البروتين) كمية المحتوى ^{15،20. في فحوصات في المختبر، كما يتيح DHM تحليل العمليات الفيزيولوجية، على سبيل المثال، نفاذية المياه الخلوية من خلال تقييم التغيرات في حجم الخلية وسمك 21،22. وعلاوة على ذلك، والقياسات DHM يمكن أن يكون آليا والذي يمنع المرتبطة محقق عينة التحيز.}

هنا، ونحن لشرح استخدام DHM في نموذج الفئران من التهاب الأمعاء، وأيضا تطبيق DHM لتحليل عينات الأنسجة البشرية الرصد الكمي من التئام الجروح كما في الفحص المختبري خالية من التسمية. أولا، نحن تقييم التغيرات الالتهابية المختلفة القولون الجدار متعدد الطبقات في الفئران colitic وأقسام الأنسجة من البشر مع مرض التهاب الأمعاء. بعد أن وصف مرحلة الكمية إجراء التصوير DHM، ونحن نقدم تعليمات مفصلة لاستخدام مكونات المجهر، وإعداد أقسام الأنسجة، وكذلك وصف تقييم الصور المرحلة الكمية المكتسبة.

بعد ذلك، وتبين لنا أن DHM يمكن أن يكون التهاب المسالك البوليةlized لرصد المتعدد الوسائط المستمر للالظهارية التئام الجروح في المختبر، ووصف تحليل الخصائص الخلوية مثل سمك طبقة الخلايا والكتلة الجافة وحجم الخلوي يعطي نظرة ثاقبة المخدرات التي يسببها وخلية الفسيولوجية التعديلات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة الإقليمية الأخلاق (وLandesamt FÜR الناطور، UMWELT اوند Verbraucherschutz، LANUV، ألمانيا) وفقا لقانون حماية الحيوان الألمانية. وافقت لجنة الاخلاق المحلية للجامعة مونستر استخدام الأنسجة البشرية للتحليل النسيجي والمجهر.

1. الحيوانات والمواد

1. استخدام النساء أو ذكور الفئران من سلالة DSS عرضة المطلوبة التي تزن 20 إلى 25 غرام، والمنزل، وفقا للتشريعات الرعاية للحيوانات المحلية. تقديم طعام خاص للقوارض وتعقيمها شرب المياه libitum الإعلانية.
2. حمل التهاب القولون الحاد مفاجآت صيف دبي التي تدير 3٪ ث / ت ديكستران سلفات الصوديوم (DSS، الوزن الجزيئي: 36،000-50،000 دا) في مياه الحنفية تعقيمها لمدة 5 أيام.
   ملاحظة: قوة من مفاجآت صيف دبي هي اختلافا كبيرا تبعا الصانع ودفعة واحدة. اختبر معلوماتك المقدمة المورد مفاجآت صيف دبي لأول مرة لتحريض نشاط المرض، والتي داإيلي وزن الجسم هو مؤشر موثوق به وموضوعي.
3. لتقييم النسيجي لعينات أنسجة القولون، الموت ببطء الفئران عن طريق CO ₂ نفخ (أو كما هو محدد من قبل الإرشادات الوطنية والمؤسسية) في نهاية التجربة.

2. إعداد تجريبي لDSS-التهاب القولون وفي المختبر الجروح فحوصات

1. زراعة الخلايا وإنشاء فحص التئام الجروح.
   1. تنمو كاتشو-2 الخلايا في الرطوبة 95٪ و 5٪ CO ₂ بيئة عند 37 درجة مئوية. استخدام RPMI المتوسطة مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
   2. البذور كاتشو-2 الخلايا في كثافة 4 × 10 ⁵ خلية / سم ² على 35 مم أطباق بتري مع ارتفاع ثقافة إدراج (انظر الشكل 4A).
      ملاحظة: إدراج يولد منطقتين الخلية مغطاة التي يتم فصلها مع مساحة حرة خلية محددة تمثل منطقة الجرحى ليتم تحليلها.
   3. تغيير المتوسطة بعد يومين من seedinز. أداء بواسطة الشفط أولا المتوسطة المتبقية مع الحطام الخلية باستخدام ماصة أوتوماتيكية، وشطف مع 100 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وإضافة جديدة RPMI المتوسطة أو المتوسطة حرم المصل.
   4. ثقافة الخلايا لمدة 24 ساعة في المتوسط ​​حرمان المصل (0.1٪ FBS) تستكمل مع 20 نانوغرام EGF / المصل مل أو 2 ميكروغرام ميتوميسين ج / المصل مل للكشف عن تغيرات في السلوك الجرح الشفاء. إضافة المتوسطة RPMI الطبيعي للسيطرة على الخلايا لمدة 24 ساعة.
   5. بعد 24 ساعة من الثقافة، وإزالة وتجاهل إدراج الثقافة كما هو موضح في الخطوة 3.4 وأداء DHM.
2. تحريض التهاب القولون الحاد مفاجآت صيف دبي
   1. حل 3 غرام من مفاجآت صيف دبي في 100 مل من الماء تعقيمها للحصول على 3٪ (ث / ت) حل مفاجآت صيف دبي. توفير هذا الحل في مكان المياه الصالحة للشرب لالفئران بالمال وبالشهرة أيضا الإعلان لمدة 7 أيام. احسب 5 مل من DSS-حل في الماوس / يوم. توفير المياه تعقيمها دون مفاجآت صيف دبي للالسيطرة على الفئران libitum الإعلانية.
3. إعداد أقسام cryostatic من الفئران والقولون البشري
   1. الموت ببطء الفئران عن طريق CO ₂ نفخ في نهاية التجربة.
   2. تشريح البطن الحيوانات عن طريق فتح البطن ^23. إزالة القولون كله بعناية باستخدام الملقط وقطع في نهاية اللفائفية والمستقيم باستخدام مقص جراحي. قطع القولون مع مقص طوليا من أعوري إلى نهاية المستقيم وفتح القولون. إزالة جميع البراز من العينة باستخدام الملقط تليها الغسيل مع برنامج تلفزيوني ^(24).
   3. إعداد القوائم السويسرية تشمير القولون كله مع القطن برعم طوليا من أعوري إلى نهاية المستقيم مع الغشاء المخاطي منحنية إلى الداخل. تضمين عينات القولون في أفضل درجة حرارة القطع (أكتوبر) مركب وأظل في المجمد -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
   4. تضمين انسجة القولون الإنسان من عينة جراحية في قطع الأمثل درجة حرارة أكتوبر المجمع وأظل في المجمد -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
   5. أقسام قطع من 7 ميكرون سمك العينات جزءا لا يتجزأ من أكتوبر-مجمع مع مساعدة من cryotoلي فقط قبل الفحص.
      ملاحظة: سمك العينة الأمثل يعتمد على المثابرة وخصائص نثر من نوع النسيج تحت التحقيق. لوصف التجارب باستخدام أنسجة القولون، شريحة سمك> 10 ميكرون سبب زيادة كبيرة في الضوضاء بسبب تشتت الضوء في الكمية على النقيض من الصور المرحلة DHM، بينما عينات من سمك <5 ميكرون تظهر أكثر عرضة للضرر الناجم عن القطع الأثرية من عملية التقطيع البرد.
   6. نقل المقاطع إلى شريحة زجاجية وجوه الناقل.

3. المعدات التقنية، والبرمجيات وإجراءات اقتناء وتقييم الصور المجسمة الرقمية

1. المجهر المجسم الرقمي للخلية الكمية والتصوير الأنسجة
   1. استخدام ماخ زيندر الرقمية نظام المجهر الثلاثية الأبعاد المحور خارج ليعيش خلية التصوير ^25، كما هو مبين في الشكل 1. تأكد من أن يتم تجهيز المجهر مع10X عدسة المجهر، مرحلة المجهر مع حامل لالشرائح الناقل جسم زجاجي وأطباق بتري التي يبلغ قطرها 35 ملم، وغرفة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الفسيولوجية عند 37 درجة مئوية وبرامج للمرحلة الكمية التصوير ^25.
      ملاحظة: على سبيل المثال، كما هو موضح في كمبر وآخرون ²⁶ و Langehanenberg وآخرون ^(27)..
      ملاحظة: بدلا من ذلك، استخدام نظام مماثل قادر على أداء مشرق المجهري الميدان والكمي مرحلة التصوير من الخلايا الحية والشرائح تشريح الأنسجة.
   2. عدسة المجهر نظيفة والمكثف مع ورقة تنظيف العدسة وعامل تنظيف (على سبيل المثال، والإيثانول) على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة للمجهر لإزالة الغبار أو التلوث الأخرى.
   3. بدء برنامج الحصول على صورة المجهر DHM، حدد "مشرق الميدان" واسطة التصوير والتبديل "على" إضاءة الضوء الأبيض. ضمان كولر illuminأوجه من العينة على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة المجهر مع مراعاة العينة في نافذة التصوير المباشر لبرنامج الحصول على الصور (بدلا من برنامج الحصول على الصور القياسية يمكن أن تستخدم في هذه الخطوة).
      ملاحظة: يجب توزيع كثافة صورة متجانس في مجال الرؤية، وينبغي وضع العينة لا تتحرك خلال إعادة تركيز بصري مع محرك تركيز المجهر.
   4. حدد "DHM" وضع التصوير، وتحويل "قبالة" إضاءة الضوء الأبيض والتبديل "على" ضوء الليزر. تأكد من أن الإضاءة مع ضوء الليزر متجانسة (أي أن شدة الضوء وتوزع متجانس في إطار التصوير المباشر لبرنامج الحصول على التصوير المجهر DHM) ونلاحظ أن خارج المحور الناقل نمط التداخل هامش يبدو مع تباين كاف في الصور التي تم التقاطها (الصور المجسمة الرقمية).
2. إعداد المقاطع ناظم البرد للتصويرمع DHM
   1. خذ (قسم ناظم البرد على الناقل جسم زجاجي، سمك: 7 ميكرون، كما هو موضح في 2.3) عينة من الثلاجة. تذويب العينة لمدة 5 دقائق على RT والغلاف الجوي العادي.
   2. إضافة 50-100 ميكرولتر الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، وتضمين المتوسطة على قسم الأنسجة باستخدام ماصة حتى يتم تغطيتها بالكامل مع العازلة. تغطية عينة مع كوب نظيف انزلاق الغطاء (سمك الزجاج 170 ميكرون).
      ملاحظة: الإفراط في تجفيف يمكن أن تحدث تغييرات كبيرة في معامل الانكسار وخصائص نثر من العينة.
   3. تأكد من أن الجزء السفلي من الناقل الزجاج وانزلاق الغطاء يتم تنظيف من الغبار والتلوث الأخرى التي ربما تتسبب في تشتت الضوء. العينة مستعدة للتحقيق مع المجهر مشرق الميدان وDHM.
3. مرحلة التصوير الكمي للأقسام الأنسجة مع DHM
   1. التبديل على المجهر المجسم الرقمي، واختيار عدسة المجهر 10X للتصوير. بدء طبرنامج الحصول على بركه المجهر DHM وتحديد وضع التصوير ملف مشرق.
   2. ضع الشريحة الأنسجة كما هو موضح في 2) في حامل المجهر الشريحة، مع انزلاق الغطاء تواجه الهدف المجهر.
   3. التبديل "على" إضاءة حقل مشرق من المجهر DHM. ضع عينة مع المرحلة المجهر والتأكد من أن منطقة الأنسجة من الاهتمام مرئيا في إطار المراقبة الحية. تحسين حدة الصورة باستخدام محرك تركيز المجهر.
      ملاحظة: بالإضافة إلى مجال الاهتمام، كما ينبغي أن تكون مساحة الشريحة دون الأنسجة الموجودة في مجال الرؤية.
   4. التقاط صورة حقل مشرق من العينة التي تركز بشدة باستخدام برنامج الحصول على الصور.
   5. حدد "DHM" وضع التصوير، وتحويل "قبالة" إضاءة الضوء الأبيض وتحويل "على" إضاءة ضوء الليزر. حدد "وقت التعرض" لتسجيل ثلاثية الأبعاد أقل من 3 ميللي ثانية، نلاحظ أن holographic خارج المحور تظهر هامش تدخل مع تباين كاف في نافذة التصوير المباشر لبرنامج الحصول على التصوير والتقاط صورة ثلاثية الأبعاد الرقمية.
   6. كرر الخطوات من 3.3.3 - 3.3.5 حتى تم تسجيل عدد كاف من الصور الحقل مشرق والصور ثلاثية الأبعاد الرقمية المناطق عينة مختلفة. اكتساب صورة ثلاثية الأبعاد اكتمال الآن.
4. إعداد المقايسات التئام الجروح للتصوير DHM
   1. التبديل على بيتري غرفة طبق التدفئة المجهر DHM حول 1-3 ساعة قبل بدء التجربة لضمان ظروف درجة حرارة ثابتة خلال القياسات DHM.
   2. إعداد طاولة العمل مع المعدات المطلوبة (طبق بيتري لالتئام الجروح الفحص الموضح في 2.3): الماصات، ملاقط، غطاء زجاجي لطبق بيتري، 4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) مخزنة مستنبت الخلية مع الفسيولوجية درجة الحرارة (37 درجة مئوية) لإعداد العينات في بيئة معقمة.
      ملاحظة: يتكون Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) بنسبة 10٪ تشعب مصل الجنين (FCS)، 20 ملي HEPES (4- (2-هيدروكسي) حامض -1-piperazineethanesulfonic)، و 850 ملغم / لتر NaHCO _3.
   3. إزالة الغطاء البلاستيكي من طبق بيتري وإزالة مستنبت الخلية مع ماصة. إزالة إدراج من طبق بيتري أسفل باستخدام الملقط.
   4. تغسل العينة 1-2 مرات مع 1 مل HEPES مخزنة خلية مستنبت لإزالة الخلايا الميتة وتبقى المكونات الخلوية (على سبيل المثال، المصل) في منطقة الجرح. إضافة 2 مل HEPES مخزنة مستنبت الخلية وسقف طبق بيتري مع غطاء زجاجي.
   5. تأكد من أن غطاء زجاجي وطبق بيتري أسفل تم تنظيفها من الغبار والتلوث الأخرى. عينة جاهز للوقت رصد مرور مع DHM.
5. مراقبة المتعدد الوسائط المستمر لالتئام الجروح في المختبر مع DHM
   1. التبديل على بيتري غرفة طبق التدفئة المجهر DHM حوالي 1 - 3 ساعات قبلبدء التجربة لضمان ظروف درجة حرارة ثابتة خلال القياسات DHM.
   2. التبديل "على" المجهر المجسم الرقمي، حدد عدسة 10X المجهر للتصوير. بدء برنامج الحصول على صورة المجهر DHM وحدد "مشرق الميدان" وضع التصوير. تأكد من أن غرفة التدفئة للطبق بتري يعمل درجة حرارة الفسيولوجية (37 درجة مئوية).
   3. وضع طبق بتري مع التئام الجروح الفحص، أعد كما هو موضح في 4)، في غرفة التدفئة المجهر DHM.
   4. تحديد وضع التصوير مشرق الميدان ووضع عينة مع مرحلة المجهر مع مراعاة أنه في إطار الرصد المباشر لبرنامج الحصول على صورة المجهر DHM. نلاحظ أن المنطقة المرغوبة من العينة يبدو ركز بشدة تحت إضاءة الضوء الأبيض.
   5. التقط صورا مشرقة مجال من المجالات المختلفة للعينة (منطقة الجرح والمناطق المحيطة بها مع خلايا متكدسة) تحت أبيضالإضاءة الخفيفة مع البرنامج الحصول على صورة وثيقة المظهر، وكثافة الخلايا والتجانس.
   6. حدد "مشرق الميدان" واسطة التصوير المجهر DHM. اختيار منطقة الجرح مناسبة تحت إضاءة الضوء الأبيض في إطار مراقبة حية مع برنامج الحصول على صورة المجهر DHM. ضمان منطقة الجرح خالية من الخلايا الميتة وبقايا أي مصل، وضمان أن تشمل كلا الجانبين على طبقة الخلايا متجانسة واحدة، ويفضل مع الحدود على التوالي.
   7. التقاط صورة الضوء الأبيض من منطقة الجرح الأولية في مشرق وضع التصوير الميدان مع البرنامج الحصول على صورة المجهر DHM.
   8. تحويل "قبالة" الضوء الأبيض الإضاءة، وحدد "DHM" الوضع والتحول "على" إضاءة الليزر. تحديد وقت التعرض لأقل من 3 مللي ثانية للصورة ثلاثية الأبعاد تسجيل (نلاحظ أن المجسم خارج المحور تظهر هامش تدخل مع تباين كاف في نافذة التصوير المباشر لبرنامج الحصول على صورة رانه DHM المجهر) والتقاط صورة ثلاثية الأبعاد الرقمية.
   9. التقاط صورة ثلاثية الأبعاد العينة في وضع DHM مع البرنامج الحصول على الصور وإعادة بناء صورة المرحلة الكمية مع برنامج اعادة اعمار المجهر DHM من أجل التحقق من جودة الصورة.
   10. حدد وقتا تأخير مناسبة (على سبيل المثال، 3-5 دقيقة) عن الوقت الفاصل بين الهولوغرام الحيازة مع برنامج الحصول على صورة المجهر DHM.
   11. تحديد وضع اكتساب الوقت الفاصل بين البرنامج الحصول على الصور التي مضاءة العينة فقط مع ضوء الليزر خلال اكتساب صورة ثلاثية الأبعاد.
   12. بدء مراقبة DHM الوقت الفاصل بين الفحص التئام الجروح.
   13. وقف شراء الوقت الفاصل بعد وقت المقصود، تحديد وضع التصوير مشرق الميدان وتوثيق ظهور النهائي للعينة تحت التصوير الضوء الأبيض.
6. إعادة بناء الصور المجسمة الرقمية من أنسجة تشريح وتحديد متوسط ​​معامل الانكسار كمعلمة لتحديدكثافة الأنسجة
   1. إعادة بناء الصور المرحلة كمية من الصور المجسمة الرقمية الأنسجة تشريح مع برنامج المجهر DHM، على سبيل المثال، كما هو موضح في كمبر وآخرون. ²⁶ وLangehanenberg وآخرون. ^27.
   2. تحديد متوسط ​​النقيض من المرحلة Δφ في طبقات الأنسجة المختلفة (ظهارة، تحت المخاطية، سدى) في المناطق المختارة بشكل مناسب المصالح (رويس) ^19.
   3. تحديد معامل الانكسار للوسط تضمين باستخدام الإنكسار أو بدلا من ذلك باستخدام قيمة مناسبة من الأدب. (قيم معامل الانكسار وسائل الإعلام نموذجي التضمين: ن _الماء = 1.334 ^28، ن _{الفوسفات المالحة (PBS)} = 1.337 ^29، ن _{مستنبت الخلية} = 1،337-1،339 ^29،30).
   4. حساب مؤشرات الانكسار من طبقات الأنسجة المختلفة من متوسط ​​النقيض من المرحلة قيم ¹⁹
      (1)
      ملاحظة: في المعادلة. 1 λ هو الطول الموجي للضوء الليزر (هنا: λ = 532 نانومتر)، د سمك الأنسجة تشريح (هنا: 7 ميكرون)، ون _{المتوسطة} هو مؤشر الانكسار من الوسط تضمينها (هنا: ن _{المتوسطة} = ن _{برنامج تلفزيوني} = 1.337، تحدده آبي-الانكسار).
7. إعادة بناء وتقييم الصور المجسمة الرقمية من الوقت الفاصل بين التئام الجروح الملاحظة سلسلة
   1. إعادة بناء الصور المرحلة كمية من الوقت سلسلة انقضاء صورة ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها خلال الملاحظة التئام الجروح مع البرنامج المجهر DHM ^26،27.
   2. تطبيع كل سلسلة من الصور المرحلة الكمية إلى صورة مع أقصى النقيض من المرحلة.
   3. تحديد منطقة S _ج التي يتم تغطيتها من قبل الخلايا في كمية الصور المرحلة DHM التي كتبها تجزئة الصور، التي يمكن أن تكون فيشكلت باستخدام البرمجيات الحرة خلية التعريف (www.cellprofiler.org ^31).
   4. حساب متوسط ​​النقيض من المرحلة الخلايا _خلية Δφ في منطقة S _ج.
   5. استرداد الخلوي DM كتلة جافة من _الخلية Δφ متوسط ​​مرحلة التباين في منطقة S _ج ¹⁵
      (2)
      ملاحظة: في المعادلة 2 DM يدل على وزن جاف الخلوية، تقدم S _ج المنطقة التي تحتلها الخلايا وα = 0.002 م ² / كجم.
   6. تحديد يتجزأ الخلوية الانكسار _خلية مؤشر ن ومعامل الانكسار للزراعة الخلايا المتوسطة ن _{المتوسطة.} تحديد _خلية ن منفصل تجريبيا من الخلايا مع وقف التنفيذ كما هو موضح في ³⁰ و قياس _{المتوسطة} ن مع الإنكسار. ألترنانسبيا استخدام قيم الأدب لن _الخلية ³⁰ و ن _{المتوسط ^{​​29،30.}}
   7. حساب متوسط ​​سمك خلية د _خلية من λ، _خلية Δφ، ن _الخلية ون _{المتوسط} ^​​26،32
      (3)
      ملاحظة: في المعادلة. 3 _الخلية المعلمة د هو متوسط ​​سمك خلية، λ يدل على الطول الموجي ضوء ضوء الليزر، _خلية Δφ يدل على متوسط ​​المرحلة النقيض من ذلك، ون _الخلية ون _{المتوسطة} هي معامل الانكسار الخلوي لا يتجزأ ومعامل الانكسار من الوسط المحيط.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

إعداد نموذجي لDHM التصوير لالرقمي المجسم المجهري (DHM)

لإجراء التصوير مشرق الميدان والكمي DHM التصوير مرحلة النقيض من ذلك، طبقنا مجهر مقلوب كما هو مبين في الشكل 1 ب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

علينا أن نبرهن على DHM يوفر تقييم دقيق للأضرار النسيجي في نماذج الفئران التهاب القولون وعينات انسجة القولون الإنسان خارج الحي. وعلاوة على ذلك، نحن مبين DHM يمكن رصد مستمر التئام الجروح الظهارية في حين نفس الوقت توفير المعلومات متعددة الوسائط حول التعديلات الخلوية...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Azoxymethane (AOM)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	A5486
Cell Culture Flask	Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany	658170
Costar Stripette	Corning Inc., New York, USA	4488
Dextran sulphate sodium (DSS)	TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden	DB001
DMEM/Ham's F12	PAA Laboratories - Pasching - Austria	E15-813
EGF	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	SPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	E 9884
Falcon Tube 50 ml	BD Biosciences, Erembodegem, Belgium	352070
Isopentane (2-Methylbutane)	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	M32631-1L
Methylene blue	Merck, Darmstadt, Germany	1159430025
Mitomycin C	Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany	M4287
Microscope Slides	G. Menzel, Braunschweig, Germany	J1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound	Sakura, Zoeterwonde, Netherlands	4583
Pen/Strep/Amphotericin B	Lonza, Verviers, Belgium	1558
Phosphate buffered saline, PBS	Lonza, Verviers, Belgium	4629
RPMI 1640	Lonza, Verviers, Belgium	3626
Sodium Chloride 0.9%	Braun, Melsungen, Germany	5/12211095/0411
Standard diet	Altromin, Lage, Germany	1320
Tissue-Tek Cryomold	Sakura, Leiden, Netherlands	4566
Trypsin EDTA	Lonza, Verviers, Belgium	7815
Vitro – Clud	R. Langenbrinck, Teningen, Germany	04-0002
µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, high	ibidi GmbH, Munich, Germany	81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insert	ibidi GmbH, Munich, Germany	80050
Equipment
MICROM HM550	Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA	46320
Digital holographic microscope
Component	Model	Company
Inverted Microscope	iMIC	Till Photonics, Graefelfing, Germany
Laser	Compass 315M	Coherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lens	Zeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3	Zeiss, Goettingen, Germany
CCD camera	DMK 41BF02	The Imaging Source, Bremen, Germany