JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

المقايسات الكيميائي البصرية ضرورية لفهم أفضل لكيفية الخلايا حقيقية النواة التحكم بوساطة جاذب كيميائي الاتجاه الهجرة الخلية. هنا، نحن تصف الأساليب التفصيلية ل: 1) في الوقت الحقيقي، وارتفاع القرار، رصد المقايسات الكيميائي متعددة، و2) تصور في وقت واحد التدرج جاذب كيميائي وديناميات الزمانية المكانية من الإشارات الأحداث في الخلايا HL60 مثل العدلات.

Abstract

Eukaryotic cells sense and move towards a chemoattractant gradient, a cellular process referred as chemotaxis. Chemotaxis plays critical roles in many physiological processes, such as embryogenesis, neuron patterning, metastasis of cancer cells, recruitment of neutrophils to sites of inflammation, and the development of the model organism Dictyostelium discoideum. Eukaryotic cells sense chemo-attractants using G protein-coupled receptors. Visual chemotaxis assays are essential for a better understanding of how eukaryotic cells control chemoattractant-mediated directional cell migration. Here, we describe detailed methods for: 1) real-time, high-resolution monitoring of multiple chemotaxis assays, and 2) simultaneously visualizing the chemoattractant gradient and the spatiotemporal dynamics of signaling events in neutrophil-like HL60 cells.

Introduction

الخلايا حقيقية النواة بمعنى والتحرك نحو التركيز العالي في التدرج جاذب كيميائي، المشار عملية الخلوية كما الكيميائي. يلعب الكيميائي أدوارا حاسمة في العديد من العمليات الفسيولوجية، مثل التطور الجنيني 1، الخلايا العصبية الزخرفة 2، ورم خبيث من الخلايا السرطانية 3، تجنيد العدلات إلى مواضع الالتهابات 4، وتطوير نموذج حي Dictyostelium discoideum 5. بشكل عام، والخلايا حقيقية النواة بمعنى chemoattractants باستخدام G البروتين يقترن مستقبلات 5. إشراك chemoattractants مع هذه المستقبلات يعزز تفكك البروتينات G heterotrimeric Gα وGβγ، والتي بدورها تفعيل المصب مسارات نقل الإشارة التي تنظم في نهاية المطاف تنظيم الزمانية المكانية من الهيكل الخلوي الأكتين لقيادة خلية الهجرة 5-9.

تم البيولوجيا الخلوية تطوير وتحسين chemotaxغير المقايسات لدراسة كيف وجهت مجموعة مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) يشير يتوسط الهجرة الخلية. تم تطوير بويدن غرفة أو الهجرة transwell فحص في عام 1960 من قبل بويدن 10. الفحص يعمل عن طريق إنشاء التدرج من المركبات جاذب كيميائي بين اثنين من الآبار التي يتم فصلها بواسطة غشاء الصغيرة التي يسهل اختراقها. بساطته وسهولة الاستخدام جعله الأكثر استخداما على نطاق واسع الكيميائي فحص حتى الآن. ومع ذلك، فإن الفحص لا تمكن عملية الهجرة من الخلايا أن تصور. غرفة زيجموند هو أول جهاز ميكروفلويديك البصرية التي تتيح التصوير واضح للهجرة الخلايا على ساترة عبر انقباض الضيق نحو جاذب كيميائي مصدر 11. دان 12 وInsall 13 معدلة ومحسنة عالية الدقة والقدرة على التصوير على المدى الطويل من زيجموند الكيميائي غرفة الفحص. بسبب خصائص يمكن التنبؤ بها للغاية،-نشر المهيمن تدفق السوائل، وكان على microfluidics توفير حلول للالمقبل من الجيلعلى المقايسات الكيميائي مثل EZ-TAXIScan (جهاز تحليل حركية الخلية).

مع استقرار التدرج ضمان، يسمح الجهاز ستة الكيميائي المقايسات التي يتعين القيام بها في وقت واحد (الشكل 1A). وعلى النقيض من التدرجات الثابتة إتجاهي ولدت في مختلف المقايسات غرفة أعلاه، الإبرة أو micropipette مقايسة التي وضعتها جونتر Gerisch يولد التدرج مع مصدر متحرك 14. في الفحص، يتم تحريرها جاذب كيميائي من micropipette المنقولة لتوليد التدرج مستقرة. مع هذا الاختبار إبرة، وجد الباحثون أن خلايا مختلفة تولد pseudopods مع خصائص مختلفة جذريا. تطبيق المجهر الفلورسنت، كنا قادرين على تصور التدرج لتسهيل قياس الكمي في جميع أنحاء 15. في هذه الدراسة، ونحن تصف الأساليب التفصيلية لإعداد HL60 الكيميائي (اللوكيميا البشري) خلايا، ورصد في وقت واحد عدة أسا الكيميائييس مع جهاز تحليل حركية الخلية، وتصور ديناميات الزمانية المكانية بوساطة هذه العملية من الجزيئات يشير مثل بروتين كيناز D1 في الخلايا الحية واحدة ردا على مرئية، منبهات جاذب كيميائي يمكن السيطرة عليها spatiotemporally. يمكن تطبيقها لدينا طرق التصوير المتقدمة للدراسات الكيميائي العامة، وهي مناسبة خاصة بالنسبة للأنظمة خلايا الثدييات.

Protocol

1. الثقافة وتمايز الإنسان العدلات تشبه خلايا HL60

  1. إعداد RPMI (روزويل معهد الحديقة التذكارية) 1640 مستنبت الذي يحتوي على RPMI 1640 المتوسطة، و 10٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني (FBS)، 0.1 ملي البيروفات الصوديوم، و 25 ملي HEPES (4- (2-هيدروكسي) -1 حمض -piperazineethanesulfonic). تدفئة مستنبت RPMI 1640-37 درجة مئوية.
  2. باستخدام عدادة الكريات تحديد كثافة خلية من خلايا HL60 للتأكد من أن الخلايا في مرحلة النمو السجل المرحلة.
    ملاحظة: خلايا وعادة ما تكون في مرحلة سجل في اليوم الثالث بعد الركض. كثافة خلايا السجل المرحلة عادة 6-8 × 10 5 خلية / مل. كثافة الخلية المطلوبة لبدء ثقافة جديدة هي حوالي 1.5 × 10 5 خلية / مل.
    ملاحظة: على سبيل المثال، 10 مل ثقافة جديدة في قارورة مسطحة T-75، إذا كانت كثافة خلية من خلايا السجل المرحلة هي 6 × 10 5 خلية / مل، ثم 2.5 مل من خلايا سجل في المرحلة (6 × 10 5 ) والمخفف إلى 1.5 × 10 5 خلية / مل في 10 مل ثقافة جديدة. لجعل الحجم النهائي من 10 ثقافة مل، 7.5 مل من RPMI 1640 مستنبت يضاف.
  3. ضع حجم المحسوبة دافئ المتوسط ​​1640 RPMI الثقافة في قارورة مسطحة. من أجل ثقافة قارورة مسطحة T-75، الحجم الكلي للثقافة الخلية هو 10 مل.
  4. إضافة حجم المحسوبة لخلايا HL60 سجل-طور النمو في قارورة مسطحة للوصول إلى كثافة الخلايا 1.5 × 10 5 خلية / مل.
  5. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2.
    ملاحظة: المرة مضاعفة HL60 هو ما يقرب من 24 ساعة.
  6. مرور الخلايا مع RPMI 1640 مستنبت كل 2-3 أيام. من المهم أن كثافة خلية من خلايا HL60 أبدا يتجاوز 1.5 × 10 6 خلية / مل ومرور خلية يستمر مدة لا تزيد على 2 أشهر.
  7. تمييز الخلايا HL60 5 أيام قبل التجارب.
    ملاحظة: RPMI 1640 التمايز المتوسطة يحتوي المتوسط ​​1640 RPMI، 10٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني (FBS)، 0.1 ملي البيروفات الصوديوم، 25 مم HEPES، و 1.3٪ سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]). وبعبارة أخرى، من 1.3٪ DMSO في المتوسط ​​1640 RPMI الثقافة.
    1. لتمييز الخلايا HL60، قبل تدفئة مستنبت RPMI 1640-37 درجة مئوية. إضافة الدافئة RPMI 1640 مستنبت في قارورة مسطحة.
    2. ل10 مل ثقافة HL60 التمايز النهائي، إضافة 130 المجاهدين DMSO مباشرة إلى مستنبت RPMI 1640 في قارورة مسطحة في حين يحوم قارورة بحيث يتم تخفيفه DMSO بسرعة عن طريق مستنبت RPMI 1640.
    3. إضافة خلايا HL60 تسجيل المرحلة إلى كثافة الخلية النهائية من 1.5 × 10 5 خلية / مل في 10 مل RPMI 1640 التمايز المتوسطة النهائي. ثقافة الخلايا HL60 في RPMI 1640 التمايز المتوسطة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطيب مع 5٪ CO 2 لمدة 5 أيام.

2. طلاء سطح الغطاء الزجاجي لغرفة 4well

  1. خذ زجاجة من 2٪ محلول المخزون الجيلاتين من الثلاجة، وتنظيفه مع 70٪ من الإيثانول، ووضعه في غطاء محرك السيارة. تأك 1 مل 2٪ محلول المخزون الجيلاتين والعودة الحل الأسهم الجيلاتين المتبقي في الثلاجة فورا.
  2. السماح للحل الجيلاتين لتسييل تماما عند 37 درجة مئوية وماصة جيدا. تمييع 2٪ محلول المخزون الجيلاتين مع محلول ملحي متوازن 9 مل قبل تحسنت 1X هانكس "(HBSS) العازلة إلى تركيز النهائي من 0.2٪ الجيلاتين.
  3. إضافة 0.5 مل أو الجيلاتين 2 مل 0.2٪ في HBSS لاثنين من الآبار المتوسطة من غرفة 4-جيدا أو غرفة 1-جيدا مع غطاء زجاجي في القاع، على التوالي. إمالة لوحات في عدة اتجاهات بحيث يغطي السائل المساحة بأكملها.
  4. وضع لوحات في الحاضنة 37 درجة مئوية. ولوحات ستكون جاهزة للاستخدام في 1 ساعة. ويمكن استخدامها لمدة تصل إلى 5 أيام. قبل البذر الخلايا، وإزالة حل الجيلاتين من 4 جيدا أو 1-جيدا غرف.

3. الكيميائي الفحص عن طريق خلية تحليل التنقل الجهاز

  1. إعداد ودافئة RPMI 1640 تجويع المتوسطة، وهو RPMIمتوسطة تحتوي على 0.1 ملي البيروفات الصوديوم (اختياري) و 25 ملي HEPES.
  2. إعداد 100 ميكرولتر من 100 نانومتر fMLP (N-formylmethionyl-لوسيل-ألانين) في RPMI 1640 تجويع المتوسطة.
  3. إعداد 3 مل من 1٪ زلال المصل البقري (BSA) / المتوسط ​​1640 RPMI التي تحتوي على 1٪ BSA في RPMI 1640 تجويع المتوسطة و 10 مل من 0.1٪ BSA / المتوسط ​​1640 RPMI.
  4. معطف ساترة مربع 22 ملم و 5 ميكرون التنقل خلية رقاقة جهاز تحليل مع الطازجة 1٪ BSA / المتوسط ​​1640 RPMI لمدة 1 ساعة على RT.
  5. تجميع حامل باستخدام الإجراء التالي:
    1. وضع قاعدة حامل مع العتلات في الوضع الرأسي بحيث العتلات يمكن إمالة نحو المستخدم. تطبيق 70٪ من محلول الإيثانول على سطح الزجاج 41 ملم. بعناية مسح الأسطح مع القضاء، مع الحرص على عدم خدش لهم.
    2. إدراج الزجاج 41 ملم في قاعدة حامل. وضع المغلفة BSA-22 مم ساترة مربع في الجزء العلوي من الزجاج 41 ملم في قاعدة حامل.
      ملاحظة: المغلفة مربع جoverslip بين الزجاج 41 مم وشرائح يسمح الكيميائي للتحدث عن التحتية لسطح الطلاء.
    3. إدراج يا الدائري (صغيرة) في الجزء السفلي من السكن ويفر، وجبل السكن رقاقة في قاعدة حامل مع ثقب بيضاوي الشكل في الجزء الخلفي. سحب المستوى الداخلي للقاعدة حامل قدما إلى الوضع الأفقي لتأمين السكن ويفر في الموقف.
    4. أي ضربة الغبار من داخل السكن رقاقة مع منفضة الهواء. إضافة 4 مل من 0.1٪ BSA / المتوسط ​​1640 RPMI في السكن رقاقة.
    5. جبل تنقل خلية رقاقة جهاز تحليل المغلفة جيش صرب البوسنة في وسط المساكن رقاقة مع الوجه الهيكلي للأسفل في اتصال مع الزجاج.
      ملاحظة: هذا رقاقة يحتاج إلى ستدرج لاحقا مع علامة لتحديد المواقع (ثقب في الجزء العلوي من رقاقة) في الجزء الخلفي.
    6. يلصق على المطاط طوقا على الجزء السفلي من الشبك رقاقة عن طريق تركيب نتوءات اثنين على المطاط طوقا في الثقوب.
    7. جبل يا الدائري (كبير) علىالجزء العلوي من السكن رقاقة. جبل المشبك رقاقة مع فتحة الاستشعار في العمق. سحب رافعة الخارجية للقاعدة السكن قدما إلى الوضع الأفقي إلى قفل المشبك رقاقة في المكان.
    8. بعد تجميع حامل، وضع الجزء السفلي من حامل على ضوء مربع للتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في الآبار. إذا تم الكشف عن فقاعات الهواء، وإزالتها باستخدام حقنة بلاستيكية قدم مزودة طرف عينة التحميل.
    9. إزالة الغطاء ووضع التجميع على لوحة على رأس وحدة جهاز تحليل حركية الخلية. تعلق الكتلة استشعار لحاملها.
  6. إعداد خلايا HL60 لالانجذاب الكيميائي الفحص:
    1. حساب كثافة خلية من خلايا HL60 متباينة مع عدادة الكريات. بعد 5 أيام من التمايز، وكثافة خلية حوالي 1.0 × 10 6 خلية / مل.
    2. حساب الحجم النهائي من HL60 الخلايا في مناطق ذات كثافة الخلية النهائية من 2 × 10 6 خلية / مل. على سبيل المثال، إذا كانت كثافة خلية منخلايا HL60 المتباينة هي 1.0 × 10 6 خلية / مل، ثم سيتم معلق 10 مل من خلايا HL60 متباينة مع 5 مل من 0.1٪ BSA / المتوسط ​​1640 RPMI لتصل إلى 2 × 10 6 خلية / مل.
    3. الطرد المركزي متباينة HL60 الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT. إزالة طاف و resuspend الخلايا مع حجم المحسوبة 0.1٪ BSA / المتوسط ​​1640 RPMI في خطوة 3.6.2) إلى كثافة الخلية النهائية من 2 × 10 6 خلية / مل.
  7. بدء وحدة جهاز تحليل التنقل المحمولة وأجهزة الكمبيوتر لالتقاط صور. قم بتوصيل وحدة لأجهزة الكمبيوتر الشخصية. بدوره على جهاز تحليل حركية الخلية. بدوره على جهاز الكمبيوتر.
  8. بدء خلية التحليل التنقل البرمجيات الأجهزة.
    1. نلاحظ 5 لوحات التحكم: صور الكاميرا، سخان، وإطلاق النار، مذكرة، والكاميرا.
    2. في لوحة التحكم صورة الكاميرا، استخدم "خط أفقي" أو "خط عمودي" لضبط الموقف حامل / عرض في الوقت الحقيقي لتوسيط الكاميرا في لوحة صورة الكاميرا.
    3. في لوحة التحكم الكاميرا، حدد CH1 لCH6 لتحريك الكاميرا إلى القناة المحددة. لتوسيط المجالات نظرا للقناة، انقر فوق "نقل L" أو "نقل R" لضبط X-تنسيق من الكاميرا وتركز وضع الكاميرا أفقيا.
    4. ضبط Y-تنسيق الكاميرا من خلال تحويل مقبض الباب موقف على اللوحة الأمامية وحدة جهاز تحليل التنقل خلية لضبط عموديا الصورة لتوسيط الشاشة.
    5. في لوحة التحكم سخان، تعيين "مؤقت حامل" إلى 37.0 درجة مئوية و "لوحة مؤقت" إلى 39 درجة مئوية. انقر على "الحرارة" لبدء التدفئة. أيضا النقر فوق "حامل" للسيطرة على درجة الحرارة باستخدام الاستشعار الحراري متصلا حامل.
    6. على لوحة اطلاق النار، أدخل "15 ثانية" في "الفاصل الزمني" و "30 دقيقة" على "تايم" لفترات ومدة الفحص الكيميائي. تحقق "سخان قبالة في نهاية اطلاق النار" لأسباب تتعلق بالسلامة. تعيين ديstination للصور المخزنة.
    7. على لوحة المذكرة، إدخال تفاصيل التجارب، مثل خط الخلية المستخدمة، أم لا تم تطبيق العلاج، وتركيز الكيماوي جاذبة تطبيقها.
    8. تأكيد موقف وسط من كل القنوات التي سيتم استخدامها في التجارب، وكرر التكيف لجميع القنوات إذا لزم الأمر.
  9. حقن ومحاذاة الخلايا على النحو التالي:
    1. إزالة المنطقة العازلة من صاحب، وإخراج 8 ميكرولتر من العازلة من ثلث جيدا من أعلى لكل قناة.
    2. استخدام حقنة لحقن 2 ميكرولتر من الخلايا في البئر الثانية في نفس القناة في حين رصد الشاشة في الوقت الحقيقي للسيطرة على عدد الخلايا وتتدفق خلال الحقن. بعد يتم محاذاة الخلايا بشكل جيد، وعلى الفور إضافة 8 ميكرولتر من العازلة الظهر. كرر نفس الإجراء لقنوات أخرى (الشكل 1B).
  10. إضافة 2 مل العازلة إلى حامل، وإضافة 1 ميكرولتر 100 نانومتر FMليرة لبنانية إلى البئر الثالث من الأعلى. بدء الحصول على الصور وحفظ البيانات. تحليل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام صورة تتبع البرمجيات 9 (الشكل 2).

4. ترنسفكأيشن مع Electroporation لل

  1. تمييز الخلايا HL60 5 أيام قبل التجربة كما هو موضح في القسم 1. معطف 4 جيدا أو 1-جيدا الدوائر وفقا للتعليمات في القسم 2.
  2. إعداد ودافئة المتوسط ​​1640 RPMI الانتعاش Electroporation لل، الذي يحتوي على RPMI 1640 المتوسطة، و 20٪ (ت / ت) FBS، 0.1 ملي البيروفات الصوديوم، و 25 ملي HEPES، إلى 37 درجة مئوية.
  3. الحق قبل بدء التجربة ترنسفكأيشن، إضافة إما 300 ميكرولتر أو 3 مل RPMI 1640 مستنبت في الآبار من 4 جيدا أو 1-جيدا غرف قبل المغلفة، على التوالي.
  4. احتضان غرف في ترطيب 37 درجة مئوية مع حاضنة 5٪ CO 2. استخدام هذه الغرف مباشرة أو تخزينها في الحاضنة لاستخدامها في المستقبل (أسبوعين).
  5. عد كثافة خلية من HL6 متباينة0 الخلايا مع عدادة الكريات.
    ملاحظة: كثافة الخلية غالبا ما تصل إلى حوالي 1.0 × 10 6 خلية / مل. كثافة الخلية أكبر من 3.0 × 10 6 خلية / مل عادة يعطي كفاءة ترنسفكأيشن غير مرغوب فيها. كما الخلايا هي خلايا HL60 تعليق، لا يلزم إعادة تعليق.
  6. الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق على RT. إزالة طاف و resuspend 2 × 10 6 HL60 الخلايا في 100 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن.
  7. إضافة 4 ميكروغرام من GFP-PKD1 البلازميد 9 إلى الخليط 100 ميكرولتر من الخلايا والكواشف ترنسفكأيشن وتخلط بلطف ودقة. إضافة الخليط في كفيت المقدمة.
  8. تحديد برنامج ما قبل مجموعة الشركة المصنعة للخط خلية الكريات البيض البشرية وتنفيذ أعمال Electroporation لل.
    ملاحظة: تتوفر المزيد من المعلومات من موقع الشركة المصنعة.
  9. بعد Electroporation لل، وعلى الفور وبلطف إضافة ما قبل حرارة 500 ميكرولتر RPMI 6140 المتوسطة انتعاش Electroporation للللخلايا، ونقل بلطف الخلايا من كفيت لأنبوب 1.6ml مع ماصات البلاستيك المقدمة.
  10. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في ترطيب 37 درجة مئوية مع حاضنة 5٪ CO 2. البذور 100 ميكرولتر أو 500 ميكرولتر من الخلايا في بئر واحدة من 4 جيدا أو غرفة 1-جيدا، على التوالي.
  11. إضافة RPMI 1640 مستنبت إلى الحجم النهائي من 1 مل أو 4 مل إلى أن نفس البئر من 4 جيدا أو غرفة 1-جيدا، على التوالي. احتضان خلايا في ترطيب 37 درجة مئوية مع حاضنة 5٪ CO 2 لمدة 3 ساعة. قبل الدافئة RPMI 1640 تجويع المتوسط ​​إلى 37 درجة مئوية.
  12. باستخدام ماصة 1ML، وإزالة بلطف 0.8 مل أو 3 مل من RPMI المتوسطة 1640 الثقافة من بئر غرفة 4-جيدا أو غرفة 1-جيدا، على التوالي. أن يكون لطيف وتجنب مص بعيدا الالتزام خلايا HL60.
    ملاحظة: خلايا HL60 تنمو ومتباينة في وسائل الاعلام تعليق. بعد أن يفرق أو مع بعض العلاجات، وخلايا HL60 تلتزم التحتية المغلفة مع متعدد الليزين، والكولاجين، والجيلاتين، أو فايbronectin.
  13. إضافة 0.8 مل أو 3 مل من RPMI 1640 تجويع المتوسطة في البئر من 4 جيدا أو 1-جيدا غرفة، على التوالي. انتظر 1 ساعة.
    ملاحظة: عند هذه النقطة الخلايا جاهزة للتجارب التصوير 9.

5. رصد لهذه العملية من بوساطة غشاء إزفاء من PKD1 من متعدد القنوات نيون الميكروسكوب

  1. تحضير خليط جديد من 100 نانومتر fMLP و 1 ميكروغرام / مل اليكسا 594 في RPMI 1640 تجويع المتوسطة كما المحفزات.
    ملاحظة: خليط من fMLP واليكسا احتياجات 594 لبذل حديثا لضمان أقصى قدر من الفعالية.
  2. جبل المصنفة واحد غرفة 4 جيدا مع خلايا أكثر من عدسة النفط 40X.
  3. تعيين مجهر نيون في تكوين المتعددة على النحو التالي:
    1. تعيين القناة الخضراء الانبعاثات (500-530 نانومتر) لGFP الموسومة PKD1، قناة الانبعاثات الحمراء (580-620 نانومتر) لجاذب كيميائي fMLP (اليكسا 594)، والتي تنتقل عن طريق قناة الخفيفة لتحديد الالتزام خلايا HL60.
    2. بدء "العيش" حيازة وتحسين شروط الحصول على ثلاث قنوات:
    3. صقل بين شدة وقوة الليزر لجميع القنوات الثلاث للحد من photobleach لفترة أطول من التصوير.
    4. إذا لزم الأمر، ومتوسط ​​كل 2-4 إطارات لتقليل نسبة الضوضاء في الخلفية لتحسين نوعية الصور. استخدام فاصل 1 ثانية.
  4. البحث عن التمسك الخلايا التي تعبر عن قوي PKD1-GFP من وجهة نظر القناة GFP ومدينة دبي للإنترنت (التفاضل تدخل على النقيض). خلايا التمسك مسطحة شكليا ولا تتحرك بسرعة.
  5. بعد تحديد الالتزام خلايا HL60 أن غاية صريحة GFP-PKD1، وتحسين حالة الاستحواذ عن طريق خفض قوة الليزر مع زيادة ربح كاشف لكل قناة لتقليل photobleach للتصوير على المدى الطويل (الشكل 3A).
  6. تناول 100 ميكرولتر من fMLP / اليكسا 594 حل مع ميكرولتر pipetter 200 وتوضع جانبا. حدد "شراء الوقت الفاصل"، وتعيين فترات2 ثانية، وعدد من الإطارات إلى الحصول على 100.
    تعتمد على فترات وعدد من الأطر واكتسابهم على الغرض من التجارب: ملاحظة. وغالبا ما تستخدم 1-2 فترات ثانية و 100 لقطة للتجارب التصوير، كما في الشكل (3). لالمهاجرة ببطء الخلايا، ضرورية للتصوير على المدى الطويل فترات أطول. في المقابل، لتهاجر بسرعة الخلايا، ويطلب فترات أقصر لرصد تفاصيل المستمرة للهجرة الخلايا.
  7. تأخذ بعناية قبالة غطاء غرفة 4 جيدا بحيث لا يتم تغيير الموقف من الغرفة. بدء استحواذ على الفور والحصول على 3-5 صور من الخلايا unstimulated في حين تحديد المواقع pipetter 200 ميكرولتر مباشرة على الخلايا باستخدام بقعة ضوء الليزر كدليل.
  8. ماصة fMLP / اليكسا 594 الخليط على الخلايا التي يجري تصويرها مع سريعة وحتى تتدفق والانتهاء من مجموعة كاملة من اكتساب الوقت الفاصل. اسم وحفظ البيانات التي سيتعرض للمزيد من تحليل البيانات.

    9. 6. خلايا التصوير Chemotaxing في المحفزات الكيماوي جاذبة المرئية والسيطرة عليها

    1. باستخدام 10 micropipetter وحقن ميكرولتر نصائح، الردم وmicropipette مع 30 ميكرولتر الطازجة خليط من fMLP وAlexa594.
    2. إرفاق micropipette إلى صاحب micropipette التي شنت على أعلى مرحلة المجهر وتوصيل أنابيب إلى وحدة إمداد الضغط، جهاز الذي يوفر الضغط المستمر للافراج عن حل fMLP / Alexa594 من micropipette لتوليد التدرج ثابت.
    3. بدوره على امدادات ضغط وضبط ضغط التعويض (PC) إلى 70 هكتوبسكال.
    4. جبل ساترة 1-جيدا تشامبيريد المصنف مع الخلايا HL60 معربا عن PKD1-GFP خلال عدسة النفط 40X على المجهر متحد البؤر أو المجهر الفلورسنت يعادلها.
    5. تعيين الاستحواذ في وضع القناة في التكوين التالية: قناة الخضراء (500-530 نانومتر) لPKD1 الموسومة GFP. القناة الحمراء (580-620 نانومتر) لجاذب كيميائي fMLP (Alexa594)؛ وعبرmitted قناة الخفيفة لتحديد الالتزام خلايا HL60.
    6. بدء شراء "العيش" وتحسين شروط اكتساب لثلاث قنوات: ضبط شدة كل قناة للتحليل الكمي للبيانات التصوير. صقل بين شدة وقوة الليزر لجميع القنوات الثلاث للحصول على صور ذات نوعية أفضل وتقليل الصور التبييض. إذا لزم الأمر، ومتوسط ​​كل 2-4 إطارات لتحسين جودة الصورة. ونحن عادة استخدام فاصل 1 ثانية.
    7. بدء شراء "العيش" والبحث عن التمسك الخلايا التي تعبر عن قوي PKD1-GFP في وجهة نظر GFP وقنوات الخفيفة المرسلة. استخدام البصريات مشرق الميدان، مركز micropipette في وسط الميدان نظر الشكل (4A) من أجل رؤية التدرج fMLP والالتزام خلايا HL60 معربا عن PKD1-GFP.
    8. اختر اكتساب الوقت الفاصل بين وتعيين فترات 2 فترات ثانية، وعدد من الأطر واكتسابهم إلى 100.
      ملاحظة: بعد جمع كل رسلسلة IME الفاصل، اسم وحفظ البيانات التي سيتعرض للمزيد من تحليل البيانات.

النتائج

التصوير في وقت واحد الكيميائي للخلايا HL60 متعددة باستخدام جهاز تحليل الحركة الخلية

واستنادا إلى مبدأ على microfluidics 16، وقد وفرت الشركة المصنعة لمحات محاكاة التدرجات: يتم إنشاء التدرج في 1 دقيقة، استقر في 5 دقائق، والحفاظ على أكثر من 2 ساعة. لمحات متوقع بشكل كبير من التدرجات مستقرة التي تولدها على microfluidics تسمح متعددة الكيميائي المقايسات التي يتعين القيام بها في وقت واحد. في هذه الدراسة، لاحظنا ثلاثة فحوصات الكيميائي في وقت واحد (الشكل 2A وفيلم 1). وجدنا أن HL60 الخلايا التي chemotaxing على الفور بعد حقن جاذب كيميائي في البئر من جاذب كيميائي، وأبقى chemotaxing في الطريق المستقيم لدقيقة 60 التالية، بما يتفق مع نتائج المحاكاة للاستقرار الانحدار. تتبع مسار السفر ومورفولوجيامن الخلايا يسمح القياسات الكمية والمقارنة لاحقة من السلوكيات الكيميائي باستخدام مؤشر الكيميائي يتضمن إجمالي طول المسار والسرعة واتجاهها، والاستدارة من الخلايا (الشكل 2B). إجمالي طول المسار هو مجموع أطوال أجزاء الخط الذي يربط بين centroids المسار. يتم الحصول على سرعة بقسمة مجموع طول الطريق من الوقت. يتم قياس اتجاهها التصاعدي وتعرف على النحو التالي: (Y تنسيق من نهاية المسار ناقص Y تنسيق من البداية) مقسوما على إجمالي طول المسار. وهذا يعطي 1.0 لكائن الانتقال مباشرة إلى أعلى. استدارة الخلية هي مقياس (في المائة) من مدى كفاءة كمية معينة من محيط يرفق المنطقة. دائرة لديها أكبر منطقة للأي محيط معين، ولها معلمة استدارة 100٪. وخط مستقيم يرفق أي مجال، ولها معلمة استدارة 0٪. نقدم لك مجموعة من السلوك الكيميائي قياسها كميا كما هو موضح من قبل المعلمات الكيميائي المحدد(الشكل 2C).

مراقبة PKD توطين التحت خلوية في الخلايا HL60 تحت حافزا fMLP مرئية spatiotemporally والسيطرة عليها

وهو التقدم التقني الكبير لتطبيق fluorescently المسمى والتحفيز جاذب كيميائي يمكن السيطرة عليها إلى نظام تجريبي. تاريخيا، فقد قدمنا ​​طلبا إما متجانسة (وتسمى أيضا موحدة) تحفيز أو تنشيط التدرج لمراقبة استجابة الخلايا والسلوكيات. ومع ذلك، "الأعمى" التحفيز لا يوفر فقط أي معلومات الزمانية المكانية على مدى يصل إلى تحفيز الخلايا، ولكن أيضا يلقي بظلال من الشك على أي ملاحظات "غير طبيعية" من استجابة الخلايا لتحفيز، وذلك ببساطة لأننا لا نرى التحفيز. لقد أظهرنا سابقا أن صبغة الفلورسنت (Alexa594) يمكن تطبيقها مع جاذب كيميائي لإقامة علاقة خطية بين تركيز جاذب كيميائي ومonitored الفلورسنت كثافة الصبغة 15. مع تكوين اكتساب البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، انبعاث الأحمر من صبغة الفلورسنت (Alexa594)، والضوء المرسل، ونحن قادرون على رصد الخلايا الالتزام، وتطبيق حافز، واستجابة الخلية لحافز (الشكل 3A). بروتين كيناز D هي عائلة سيرين / ثريونين كاينيسات التي تلعب دورا أساسيا في توجه الخلايا الهجرة 9،17. وردا على موحد التطبيقية fMLP (الحمراء) تحفيز خلايا HL60 توسط إزفاء غشاء قوي من GFP الموسومة البروتين كيناز D1 (الأخضر) (الشكل 3B وفيلم 2). في التدرج fMLP (أحمر) (الشكل 4A)، وخلايا HL60 تجنيد بنشاط PKD1 إلى الحافة الأمامية (الشكل 4B و فيلم 3). مقارنة وثيقة للتوطين التحت خلوية من GFP في بروز الحافة الأمامية إلى أن PKD1 يموضع في الجزء الخلفي من حافة الرائدة (الشكل 4C).

figure-results-3541
الشكل 1. خلية جهاز تحليل الحركة يسمح ما يصل إلى 6 فحوصات الكيميائي في وقت واحد. (A) مخطط يبين تصميم حراكا خلية التحليل رقاقة جهاز لرصد وقت واحد من 6 المقايسات الكيميائي مستقلة. يظهر الحمراء جاذب كيميائي تضاف إلى الآبار. (ب) مقدمة من HL60 الخلايا إلى الآبار الخلايا في حين تبعثر جاذب كيميائي لإقامة fMLP الانحدار المستمر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4226
الشكل 2. مراقبة في وقت واحد من المقايسات الكيميائي متعددة مع خلايا HL60. (A نانوغرام>) المونتاج يظهر صورا لتنقل الخلية الكيميائي جهاز تحليل فحص لفحص الآثار المثبطة للمثبطات PKD محددة على الكيميائي في أوقات 0 و 12 دقيقة بعد تطبيق التدرج. وقبل تعامل خلايا الكيميائي HL60 مع PKD المانع 1 ميكرومتر CID755673 لمدة 30 دقيقة. سمح خلايا HL60 مع أو بدون علاج مثبط PKD لchemotax في أي RPMI1640 تجويع 100 التدرجات نانومتر fMLP لمدة 12 دقيقة أو المتوسطة. (ب) خطة يدل على طول مسار السفر ومورفولوجيا الخلايا HL60 تتبعها. (C) الكمي الكيميائي كما يبلغ طول الطريق، والسرعة، واتجاهها، واستدارة. يعني ± يظهر SD. ن = 10، 12، أو 11 من دون التدرج، fMLP التدرج من دون علاج CID755673، والعلاج fMLP مع العلاج CID755673، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> figure-results-5352
الشكل 3. النوع من الاختزال بوساطة النبات غشاء قوي من PKD1 استجابة للمؤثرات fMLP التطبيقية بشكل موحد. (A) المتعددة رصد PKD1-GFP (الأخضر)، وجاذب كيميائي (1 ميكرومتر fMLP مختلطة مع 0.1 ميكروغرام / مل صبغة الفلورسنت اليكسا 594، أحمر) ، ومدينة دبي للإنترنت (التفاضل تدخل على النقيض) لتحديد الخلايا HL60 الالتزام في بئر من غرفة 4well المغلفة مع 0.2٪ الجيلاتين في المتوسط ​​1640 RPMI. شريط النطاق = 10 ميكرون. (ب) المونتاج يدل على أن تطبيقها بشكل موحد fMLP (الحمراء) يدفع النبات غشاء قوي من PKD1-GFP (الأخضر). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6225
شملت رقمه 4. قيادة توطين حافة PKD1 في chemotaxing خلايا HL60. (A) قناة التكوين اكتساب وضع يسهل تصور التدرج fMLP وديناميات الزمانية المكانية من PKD1. في A - C، أعرب خلايا HL60 عابر PKD1 الموسومة GFP. لتصور التدرج fMLP ولدت من micropipette (DIC)، و 100 نانومتر fMLP (الأحمر) كانت مختلطة مع 0.1 ميكروغرام / مل صبغة الفلورسنت اليكسا 594. (ب) توطين المخصب من PKD1 في طليعة من الخلية chemotaxing. شريط النطاق = 10 ميكرون. وتشير (C) الصور المدمجة التي PKD1 يموضع في الجزء الخلفي من حافة الرائدة في الخلايا HL60. يظهر اللون الأخضر PKD1 توطين الخلوية، وتظهر صورة مدينة دبي للإنترنت ومنطقة جاحظ من الحافة الأمامية. مقياس شريط = 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

في هذه الدراسة، وتبين لنا مثالين من المقايسات الكيميائي: لأول مرة، ورصد في وقت واحد من المقايسات الكيميائي متعددة من قبل الجهاز تحليل حركية الخلية؛ والثانية، والتصور التدرج جاذب كيميائي وديناميات الزمانية المكانية من الإشارات الأحداث في نفس الخلايا في الوقت الحقيقي.

جهاز تحليل التنقل خلية لعدة فحوصات الكيميائي في وقت واحد

في هذه الدراسة، قدمنا ​​بروتوكول مفصلة لأداء عدة فحوصات الكيميائي في وقت واحد باستخدام جهاز تحليل الحركة الخلية. هذا الجهاز يسمح للمستخدم لمراقبة السلوك الكيميائي الخلوي مع 10X عدسة موضوعية في مراقبة مشرق الميدان التقليدية. بسبب الخصائص نشر المهيمن على تدفق السوائل، وجهاز تحليل التنقل خلية يولد يمكن التنبؤ بها للغاية، التدرجات مستقرة ويسمح ما يصل الى ستة الكيميائي المقايسات التي يتعين الاضطلاع بها في وقت واحد. الخطوات الحاسمة في البروتوكول هيللحصول على تدرجات موثوقة ولمحاذاة الخلايا على خط شرفة. يجب على المستخدم تتبع بدقة تعليمات الشركة الصانعة لتجميع حامل وحقن chemoattractants والخلايا. أيضا تعليمات مفصلة على شبكة الإنترنت. بالمقارنة مع الطرق البديلة الكيميائي 11-13،15، وهذا الجهاز بشكل كبير على تحسين موثوقية وكفاءة فحوصات الكيميائي. أربعة أحجام للحراك خلية التحليل رقاقة الجهاز في أحجام 4، 5، 6، و 8 ميكرون تتوفر لاستيعاب أنواع وأحجام مختلفة من الخلايا المختلفة. وجدنا أن 4 أو 5 ميكرون التنقل خلية رقاقة جهاز تحليل مناسب لHL60 ود. خلايا discoideum، والتي هي حوالي 10-15 ميكرون في القطر. ومع ذلك، الحد واحد هو أن هذا الجهاز غير مناسب لجميع أنواع من الخلايا. كان لدينا نجاح يذكر باستخدام التنقل خلية جهاز التحليل الكيميائي مقايسة مع الخلايا Raw267.4. قد يكون السبب أن الخلايا Raw267.4 تهاجر ببطء شديد. الوقت اللازم لتشي كفاءةmotaxis الخلايا Raw267.4 قد تكون أطول بكثير من الوقت الذي يتم الحفاظ على التدرج من قبل الجهاز. بدلا من ذلك، عملت فحص transwell الهجرة بشكل جيد لخلايا Raw267.4 9. الحد الآخر هو أن المراقبة الفلورسنت غير ممكن مع الجهاز الحالي. والاتجاه المستقبلي هو رصد التصوير الفلورسنت مع أعلى التكبير. وهذا ممكن مع تحسن جهاز تحليل حركية الخلية، وهو مجهز الكشف الفلوري وعدسة الهدف 100X. وبالإضافة إلى ذلك، يتم زيادة عدد فحوصات في وقت واحد أيضا إلى 12. كل هذه التحسينات تسهيل إنتاجية محسنة من المقايسات الكيميائي ومراقبة ديناميات التحت خلوية في الخلايا المهاجرة.

كفاءة ترنسفكأيشن عالية من HL60 الخلايا للتعبير عن الفلورسنت البروتين الموسومة البروتين

خلايا HL60 هي خط خلية سرطان الدم تقسيم بنشاط وتنمو في تعليق. كما ذكرت سابقا 18-20، وخلايا HL60 مقاومة لزنقل الشم. على حد سواء وقد تم اختبار الدهون ونقل Electroporation للجينات، وتم الحصول على أعلى كفاءة ترنسفكأيشن مع Electroporation لل، كما هو موضح بالتفصيل في القسم 4. الحصول على قابلية عالية بعد Electroporation للأمر بالغ الأهمية للحصول على كفاءة ترنسفكأيشن عالية بسبب الضرر الشديد الذي ينتج من Electroporation لل. بعد ذلك، يطلب من التعامل مع الخلية دقيق ولطيف، خصوصا بعد Electroporation لل. تحتوي كافة وسائل الإعلام أن تكون قبل حرارة وأضاف بلطف إلى الخلايا في أي خطوات بعد Electroporation لل. فمن الأهمية بمكان لتقليل الوقت تعرض الخلايا إلى كاشف Electroporation للأيضا. لتجنب موت الخلايا، بعد Electroporation لل، يجب إضافة RPMI 1640 الانتعاش Electroporation للمتوسطة إلى الخلايا على الفور. لقد وجدنا أن 20٪ FBS في المتوسط ​​الانتعاش يعطي معدل استرداد خلية أعلى بكثير من 10٪ FBS. بعد Electroporation لل، الحضانة في RPMI 1640 Electroporation للمتوسطة الانتعاش لمدة 30 دقيقة أمر بالغ الأهمية لزيادة سلامة وترنسفكأيشنكفاءة. لزيادة كفاءة ترنسفكأيشن، وكنا أيضا 4 ميكروغرام DNA البلازميد في ترنسفكأيشن، الذي هو تقريبا مبلغ مرتين البلازميد الموصى بها من قبل الشركة المصنعة.

هناك نوعان من القيود الرئيسية على ترنسفكأيشن Electroporation لل: وtransiency للتعبير البروتين والحد عدد الخلايا (2 × 10 6 خلايا لكل ترنسفكأيشن). في خلايا غير متمايزة، والتعبير هو كشفها فقط خلال أول زوجين من انقسامات الخلية، حيث يتم المخفف البلازميد ناقلات بمقدار النصف بعد كل انقسام الخلايا. لوHL60 متباينة خلايا البقاء على قيد الحياة لا أكثر من 48 ساعة. ونتيجة لذلك، فإن أي تجربة تتطلب تعداء جديدة 6 ساعة قبل التجربة. عدد الخلايا ل electroporation واحد فقط يلبي الحد الأدنى من المتطلبات لأي فحوصات البيوكيميائية. لغرض الاستخدام المتكرر أو كمية كبيرة، فمن المستحسن أن يتم إنشاء خط الخلية HL60 غير متمايزة تعبر عن ثبات البروتين من مبادرة الخوذ البيضاء الفائدةوقد تم وسمها الفصل مع بروتين فلوري من قبل ناقلات فيروسية، إذا كان ناقلات فيروسية غير متوفرة أو يمكن بناؤها.

Disclosures

The authors declare no competing financial interest for this work.

Acknowledgements

This work is supported by the intramural fund of NIAID, NIH.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
RPMI 1640 Medium GlutaMAXLife technologies61870-036
Sodium pyruvateThermo Fisher Scietific11360-070
Fetal bovine serumGemini Bio-Products100-106
1 M HEPES sterile solution, pH 7.3Quality Biological Inc.A611-J848-06
Penicillin streptomycin solutionFisher Scientific15140122
NucleofectorTM 2bLonzaAAB-1001
AmaxaTM Cell Line NucleofectorTM Kit V including NucleofectorTM Solution, Singe use pipettes, AmaxaTM certified 100 ml aluminum electrode cuvettesLonzaVCA-1003
Lab-Tek chambered #1.0 Borosilicate CoverglassNalge Nunc International Inc155383
2% Gelatin solutionSigma-AldrichG1393
FibronectinSigma-AldrichF1141
HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution)Life technologies14025-076
Bovine serum albuminSigma-AldrichA3803
Single well Lab-Tek II coverglass chambersNalge Nunc International Inc155361
Four-well Lab-Tek II coverglass chambersNalge Nunc International Inc155383
Alexa 594Thermo Fisher ScientificA-10438
fMLPSigma -AldrichF3506-5MG
Cover glass thickness (2) 22 mm x 22 mmCorning2855-22
EZ-TAXIScanEffector Cell Institute, Inc.MIC-1001
EZ-TAXIScan chip (5 mm)Effector Cell Institute, Inc.EZT-F01-5
1701RN 10 μl syringeHamilton80030
Femtotips II Injection tipsEppendorf5242956003
Femtotips IIEppendorf930000043
TransferMan NK2, including motor module, X head with angle adjuster, and Positioning aids. Eppendorf5188900056
DIAS softwareSolltech Inc.
LSM 780 META or equivalent confocal microscope with a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lensCarl Zeiss

References

  1. Pocha, S. M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of single and collective cell migrations in Drosophila: themes and variations. Annual review of genetics. 48, 295-318 (2014).
  2. Wen, Z., Zheng, J. Q. Directional guidance of nerve growth cones. Current opinion in neurobiology. 16, 52-58 (2006).
  3. Bravo-Cordero, J. J., Hodgson, L., Condeelis, J. Directed cell invasion and migration during metastasis. Current opinion in cell biology. 24, 277-283 (2012).
  4. Zigmond, S. H. Chemotaxis by polymorphonuclear leukocytes. The Journal of cell biology. 77, 269-287 (1978).
  5. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-8 (2008).
  6. Dong, X., et al. P-Rex1 is a primary Rac2 guanine nucleotide exchange factor in mouse neutrophils. Current biology : CB. 15, 1874-1879 (2005).
  7. Li, Z., et al. Directional sensing requires G beta gamma-mediated PAK1 and PIX alpha-dependent activation of Cdc42. Cell. 114, 215-227 (2003).
  8. Van Haastert, P. J., Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nature reviews: Molecular cell biology. 5, 626-634 (2004).
  9. Xu, X., et al. GPCR-Mediated PLCbetagamma/PKCbeta/PKD Signaling Pathway Regulates the Cofilin Phosphatase Slingshot 2 in Neutrophil Chemotaxis. Mol Biol Cell. , (2015).
  10. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of experimental medicine. 115, 453-466 (1962).
  11. Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of cell biology. 75, 606-616 (1977).
  12. Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of cell science. 99 (Pt4), 769-775 (1991).
  13. Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PloS one. 5, e15309(2010).
  14. Bozzaro, S., Fisher, P. R., Loomis, W., Satir, P., Segall, J. E. Guenther Gerisch and Dictyostelium, the microbial model for ameboid motility and multicellular morphogenesis. Trends in cell biology. 14, 585-588 (2004).
  15. Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein coupled receptor (GPCR)-mediated signaling events that control chemotaxis of Dictyostelium discoideum. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  16. Lin, F., et al. Generation of dynamic temporal and spatial concentration gradients using microfluidic devices. Lab Chip. 4, 164-167 (2004).
  17. Eiseler, T., et al. Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot. Nature cell biology. 11, 545-556 (2009).
  18. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6, 127-134 (2000).
  19. Schakowski, F., et al. Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines. Genet Vaccines Ther. 2, 1(2004).
  20. Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells. Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

115 G GPCR G

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved