في فيفو نموذج لاختبار تأثير نقص الأكسجة على الانبثاث ورم

Summary

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

Abstract

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm³. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

Introduction

يوينغ ساركوما (ES) هي خباثة العدوانية التي تؤثر على الأطفال والمراهقين. ¹ الأورام تنمو في الأنسجة الرخوة والعظام، عادة في الأطراف. في حين وجود نقائل هو أقوى عامل النذير سلبي واحد للمرضى وفاق، لا تزال الآليات الكامنة وراء تنميتها واضحة. ² ورم نقص الأكسجة هو واحد من العوامل القليلة المتورطين في ES التقدم. في المرضى الذين فاق، ويرتبط وجود مناطق غير perfused داخل أنسجة الورم مع سوء أحوال الطقس. ³ في المختبر، نقص الأكسجين يزيد من غزو خلايا ES ويطلق تعبير عن الجينات الموالية للالنقيلي. ^4-6 ومع ذلك، على الرغم من هذه الأسطر من الأدلة، لا يوجد دليل مباشر على وفاق الناجم عن نقص الأكسجة تطور وانتشار موجودا. وعلاوة على ذلك، فإن الآليات التي نقص الأكسجة يمارس هذه الآثار هي، في الوقت الحاضر، غير معروفة. ومن هنا، قمنا بإنشاء نموذج في الجسم الحي لملء الفجوة بين القائمة في بيانات المختبر وobser السريريالأرصاد. هذا النظام النموذجي تمكن من اختبار مباشر من آثار نقص الأكسجين على الأورام التي تحدث في بيئتها الطبيعية، وذلك باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) لمتابعة تطور الورم والانبثاث في الجسم الحي في تركيبة مع خارج الحي التحليلات المرضية والجزيئية (الشكل 1).

منذ لا يوجد نموذج المعدلة وراثيا المعمول بها ES متاح حاليا، فإن الدراسات المجراة على خصائص النقيلي من هذه الأورام تعتمد على حقن الخلايا البشرية في الفئران المناعة. في حين أن استخدام الحيوانات ضعف المناعة قد نقلل من تأثير على الجهاز المناعي على تطور المرض، والقدرة على استخدام الخلايا البشرية يزيد ترجمتها من هذه الدراسات. ومن بين النماذج طعم أجنبي المختلفة، والحقن النظامية إلى الوريد الذيل هي أسهل للأداء، ولكنها حذفت الخطوات الأولية من ورم الخلايا دخول الوعاء والهروب من الموقع الرئيسي للنمو. ^7-12 من ناحية أخرى، orthoto الموافقة المسبقة عن علم xenografting، الذي ينطوي على حقن الخلايا السرطانية في العظام (عظم الفخذ، الضلع) أو العضلات، هو أكثر تحديا من الناحية الفنية، ولكن أيضا أكثر بيولوجيا ذات الصلة لسرطان البشري. ^13-16 القتل الرحيم الحيوانات ومع ذلك، في الماضي، وارتفاع معدلات المراضة المرتبطة بالنمو السريع للأورام الأولية وكثيرا ما استلزم قبل تطور ورم خبيث. في هذه الدراسة، قمنا بتوظيف نموذج المحددة سابقا من حقن الخلايا في عضلة الساق تليها استئصال الورم الرئيسي مما أدى جنبا إلى جنب مع مراقبة الطولي للتطور المنتشر طريق التصوير بالرنين المغناطيسي. ^17،18 مثل هذه الحقن في عضلة الساق على مقربة من الساق تسمح لنمو الورم في بيئتين ES الطبيعية - العضلات والعظام - وينتج عن النقائل البعيدة إلى الأماكن المتضررة عادة في البشر. ¹⁸ وبالتالي، فإن هذا النموذج يلخص بدقة العمليات النقيلي التي تحدث في المرضى الذين يعانون ES أثناء تطور المرض.

خيمة "> توطين الأورام الأولية في hindlimb أقل كما يسهل مراقبة دقيقة من وصول الدم إلى الأنسجة السرطانية. ربط الشريان الفخذي (فال) هي تقنية راسخة المستخدمة في البحوث الأوعية الدموية لمنع تدفق الدم إلى المناطق البعيدة المحطة والتحقيق في الأوعية الدموية الأنسجة استجابة لنقص التروية. ^19،20 الأهم من ذلك، ويتبع الانخفاض الأولي في تدفق الدم عن طريق فتح السفينة الجانبية وضخه الأنسجة لوحظ بعد حوالي 3 أيام فال. ²⁰ وهكذا، عندما أجريت في أحد أطرافه الورم الحاملة، هذا النموذج بإعادة الأحداث نقص الأكسجة / ضخه التي تحدث بشكل طبيعي في الأورام التي تنمو بسرعة وتمكن من الهروب من خلايا الورم النقيلي بسبب إعادة التروية إلى انخفاض hindlimb عبر السفن الضمانات الذي افتتح حديثا. ²¹ والأهم من ذلك يجب أن يتم تنفيذ هذا الإجراء عندما يكون حجم الورم صغيرة بما يكفي لمنع نقص الأكسجين الزائد في الأورام التحكم (عادة في الساق المجلد الورم الحاملةأوميا من 150-250 مم ^3)، وضمان اختلافات كبيرة في مستويات نقص الأكسجة الورم بين السيطرة والمجموعات المعالجة فال.

بالإضافة إلى مراقبة الطولي للتأثير نقص الأكسجين على وفاق الكمون وتيرة الانبثاث، وهذا النموذج يسمح أيضا لجمع الأنسجة وتطوير خطوط الخلايا الجديدة من كل من الأورام الابتدائية والانبثاث. الأهم من ذلك، العمل السابق نص على أن خطوط الخلايا المشتقة الانبثاث، معرضا تعزيز إمكانات المنتشر على إعادتها إلى الحيوانات، مشيرا إلى أن نشر ورم يرتبط مع تغييرات دائمة في الخلية النمط الظاهري الورم، وبالتالي التحقق من صحة استخدام هذه خطوط الخلايا فك العمليات النقيلي. ¹⁸ مجتمعة، وهذه النماذج يمكن الآن أن تستخدم في التحليلات الوراثية والجزيئية اللازمة لتحديد مسارات المنتشر الناجم عن نقص الأكسجين.

كما نقص الأكسجين هو أحد العوامل المؤيدة للالمنتشر تعزيز الورم الخبيث من مختلف رumors، لدينا نموذج يمكن أن تستخدم كمنصة للتحقيق في دور نقص الأكسجة في أنواع الأورام الأخرى التي تتطور بشكل طبيعي في أطرافه، مثل عظمية والعضلية المخططة. ^21-23 وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق نهج مماثل لالأورام الخبيثة المتزايدة في مواقع تشريحية أخرى مع طريق واضحة المعالم من إمدادات الدم. في نهاية المطاف، فإن النموذج يمكن تعديل وفائدتها تمديدها، وهذا يتوقف على الاحتياجات البحثية الفردية.

Protocol

وقد وافق جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة جورج تاون.

1. إعداد الخلايا لمثلي الحقن

1. خلايا ES الثقافة البشرية في ظل ظروف قياسية. استخدام ما يقرب من واحد لوحة خلية ثقافة 15 سم لا تتجاوز 70٪ من confluency للحقن من 5 الفئران.
   ملاحظة: للحصول على هذه الدراسة، كانت الخلايا SK-ES1 مثقف في المتوسط ​​5A مكوي مع 15٪ مصل بقري جنيني (FBS) على لوحات المغلفة الكولاجين وخلايا TC71 تم تربيتها في RPMI مع FBS 10٪ و 1٪ 4- (2-هيدروكسي ) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES). واستكملت كل من وسائل الإعلام مع المضادات الحيوية - البنسلين (100 وحدة / مل)، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، وfungizone (1 ميكروغرام / مل).
2. غسل خلايا ES مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ويعرض للتريبسين في 70٪ التقاء مع 0.25٪ التربسين ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل / (EDTA) لمدة 5 دقائق.
3. إزالة خلايا ES من لوحة مع ميدي ثقافة الخليةلذلك، ثم الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة. إعادة تعليق الخلايا ES في 10 مل من برنامج تلفزيوني الباردة ومن ثم حساب عدد الخلايا.
4. خلايا الطرد المركزي ES لمدة 5 دقائق في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة، ثم إعادة تعليق في 2 × 10 ⁷ (SK-ES1) أو 10 ⁷ (TC71) خلايا لكل مل في برنامج تلفزيوني الباردة. الحفاظ على تعليق خلية النهائي على الجليد أثناء أداء الحقن.

2. حقن مثلي الخلايا ES في عضلة الساق

1. استخدام 4-6 الاسبوع القديمة الإناث SCID / الفئران البيج.
2. لحقن الخلايا الجذعية الجنينية، وعقد بلطف الماوس وتحقيق الاستقرار في الساق اليسرى ما بين الأصابع الرابع والخامس، وفضح الجانب الإنسي من hindlimb أقل.
3. باستخدام إبرة 28 G ونصف، حقن 0.1 مل من تعليق خلية معدة مسبقا التي تحتوي إما 2 × 10 ⁶ (SK-ES1) أو 10 ⁶ خلايا (TC71) ES في عضلة الساق (الشكل 2A).
   ملاحظة: على الرغم من حجم الحد الأقصى لينج العضليections عادة 0.05 مل، لهذا الإجراء بشكل خاص في زيادة حجم 0.1 مل هو ضروري نظرا لعدد الخلايا عالية حقن. تمت الموافقة على هذا الإجراء من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة جورج تاون.
   1. ادخال الإبرة في العضلة الأمامية في ما يقرب من 30 - زاوية 45 درجة في اتجاه قمة عظام الساق / الحدبة.
   2. سحب قليلا الإبرة مرة واحدة أنها تمس قمة عظام الساق / الحدبة. حقن ببطء الحل تعليق خلية، والانسحاب تدريجيا الإبرة للافراج عن الضغط.
4. رصد حقن الفئران على مدى ال 24 ساعة القادمة لعلامات الضيق.
   ملاحظة: يجب أن المحققون مع أقل خبرة في التعامل مع الحيوانات تنظر التخدير الفئران لحقن الخلايا السرطانية. قد تتطلب بعض المؤسسات التخدير لأسباب تتعلق بالسلامة.

3. مراقبة نمو الأورام الأولية

1. مراقبة نمو الأورام الأولية دaily حتى حجم الورم يصل حجم المطلوب.
   ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام حجم العجل من 250 مم ³ كنقطة انطلاق التجربة (الشكل 2B). عادة، فإنه يأخذ حوالي 1-2 أسابيع للأورام للوصول إلى هذا الحجم.
   1. قياس حجم العجل يوميا مع الفرجار الرقمية عبر أطوال لها سطي الاطراف والأمامي الخلفي.
   2. تحديد حجم العجل بواسطة الصيغة (D XD ^2/6) × 3.14، حيث D هو القطر الطويل ود هو قطر أقصر من انخفاض hindlimb الحاملة للورم.
      ملاحظة: حجم العادي العجل الماوس البالغين حوالي 40 - 50 مم ^3. سوف حجمه زيادة نظرا لنمو الورم وفي مراحل لاحقة العجل وسيتألف أساسا من أنسجة الورم.

4. الشريان الفخذي من ربط (فال) لإحداث نقص الأكسجة في Hindlimb الحاملة للورم

1. إعداد الأدوات الجراحية اللازمة لهذه العملية: لئيموأشار فيد أو ملقط غرامة أشار، ملقط، مقص جراحي وحامل إبرة. تعقيم هذه الأدوات قبل الجراحة باستخدام الأوتوكلاف أو معقم الساخنة حبة. بالإضافة إلى ذلك، لدينا مسحات القطن غرامة على استعداد لهذه الجراحة.
   ملاحظة: من المستحسن أن الأدوات يعاد تعقيمها على نصائح حسب الحاجة أثناء العملية.
2. حقن كيل مسكن (كاربروفين 5 ملغ / كلغ) تحت الجلد (SQ). للكشف والتأكد من نقص الأكسجين، وضخ hypoxyprobe-1 (pimonidazole، 60 ملغ / كلغ).
   ملاحظة: هذه الجرعة تعادل 1.5 ملغ في الماوس، وحققت من خلال ضخ 0.1 مل من محلول مل / 15 ملغ hypoxyprobe في برنامج تلفزيوني داخل الصفاق (IP). وhypoxyprobe هو ثم بعد الوفاة التي يمكن اكتشافها في الأنسجة الحيوانية المناعية.
3. ضع الماوس في غرفة تحريض التخدير التي تحتوي على 3-5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪ في معدل التدفق من 1 لتر / دقيقة.
4. ترك الماوس في غرفة تحريض حتى يصبح غير قادر على الاستجابة للمؤثرات الخارجية. ثم إزالة الحيوان من أناnduction غرفة. وضع الحيوان في موقف ضعيف على ثنى العقيمة وضعت فوق وسادة الاحترار على سطح التشغيل. استخدام مخروط الأنف لتوصيله إلى تدفق مستمر من 1-3٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪ بمعدل تدفق 0.8 لتر / دقيقة.
   1. تطبيق العقيمة مرهم للعين غير بالأدوية إلى كل عين لمنع جفاف القرنية. ليزيل الشعر تماما على منطقة العمليات الجراحية، وتطبيق كريم إزالة الشعر، تركها على البشرة لمدة لا تزيد عن 10 ثانية. ثم تمحو كريم إزالة الشعر باستخدام وسادة الإيثانول الإعدادية.
5. توسيع وتأمين hindlimb مع قطعة من الشريط ما يقرب من 45 درجة من خط الوسط من الفأرة. وبمجرد أن hindlimb آمنة، ومسح البشرة المكشوفة مع 10٪ البوفيدون / اليود مسحة / الحل، تليها الإيثانول، وتكرار مرتين أخريين لكل منهما. للفترة المتبقية من العملية الجراحية، واستخدام المجهر ستيريو للحصول على عرض موسع للمنطقة hindlimb.
6. باستخدام ملقط وأشار ومقص جراحي، وجعل شق من كورونافي ما يقرب من 1 سم، من منتصف الفخذ نحو المنطقة الأربية. باستخدام قطعة قطن مبللة غرامة المالحة، وفرشاة بلطف بعيدا تحت الجلد الأنسجة الدهنية المحيطة عضلة الفخذ.
7. كشف بعناية الشريان الفخذي الأساسي عن طريق تشريح حادة خلال النسيج الدهني تحت الجلد. استقرار الجرح والجراحي الميداني لفضح الأوعية الدموية في العضلات المقربة منتصف العليا.
8. باستخدام ملقط غرامة، بلطف بيرس خلال غمد الفخذ غشائي لفضح حزمة وعائية عصبية. باستخدام مجموعة نظيف من ملقط غرامة، تشريح وفصل الشريان الفخذي من الوريد الفخذي والعصب في الموقع القريب قرب الفخذ، البعيدة إلى الرباط الإربي. توخي الحذر لتجنب اختراق جدار الوريد الفخذي.
9. وبعد تشريح، تمر بنوع من 6-0 خياطة الحرير تحت الشريان الفخذي والبعيدة إلى فرع من الشريان الفخذي المنعطف الجانبي (LCFA). انسداد الشريان الفخذي باستخدام عقدة مزدوجة (الشكل 3).
10. إغلاق شق باستخدام 6-0 خيوط البولي بروبلين. بعد إغلاق الجرح، وحقن SQ 0.5 مل من المياه المالحة الدافئة لعلاج توازن السوائل. وضع الحيوان على رأس وسادة دافئة رايات في قفص الانتعاش ومراقبة مستمرة حتى مستيقظا.
11. مراقبة الحيوانات خلال ساعة 6 الأولى بعد الجراحة وحقن عامل مسكن (كاربروفين 5 ملغ / كغ، SQ) كل يوم لمدة 3 أيام. إزالة الغرز 10 أيام بعد الجراحة باستخدام مقص العقيمة.

5. استئصال الورم الرئيسي من بتر الساق

ملاحظة: بتر انخفاض hindlimb الحاملة للورم عندما يصل حجم العجل 250 ملم ³ للمجموعة الضابطة أو 3 أيام بعد FAL للمجموعة ميتة.

1. حلاقة الشعر من الأطراف الورم الحاملة من الساق البعيدة لمنطقة الحوض مع الشعر كليبرز في حين عقد بلطف الحيوان. حقن عامل مسكن (كاربروفين 5 ملغ / كغ، SQ) قبل إجراء العملية.
2. ضع الماوس في لمحة تعريفية الفصل التخديرالعنبر التي تحتوي على 3-5٪ الأيزوفلورين في الأكسجين 100٪ في معدل التدفق من 1 لتر / دقيقة. ترك الماوس في غرفة تحريض حتى يصبح غير قادر على الاستجابة للمؤثرات الخارجية. ثم إزالة الحيوان من غرفة تحريض.
3. وضع الحيوان في حق وضعية الاضطجاع الجانبي على ثنى العقيمة وضعها على وسادة الاحترار على سطح التشغيل. استخدام مخروط الأنف لتوصيله إلى تدفق مستمر من الأيزوفلورين 1-3٪ في 100٪ من الأكسجين بمعدل تدفق 0.8 لتر / دقيقة. تطبيق العقيمة مرهم للعين غير بالأدوية إلى كل عين لمنع جفاف القرنية
4. تحضير موقع الجراحة باستخدام 10٪ البوفيدون / اليود مسحة / الحل، تليها الإيثانول، وتكرار 3 مرات. تطبيق شاش معقم (على سبيل المثال، ثنى الجراحية) على الماوس للحصول على الجراحي الميداني العقيمة.
5. جعل الفخذ كفافي شق الجلد المتوسطة، تليها تشريح حادة وتراجع من الجلد قريب. فضح عنيق عائية عصبية الفخذ وسطي على الجانب متوسط ​​الساق، ثم ligateبالقرب من الرباط الإربي باستخدام 4-0 المغلفة (polyglactin 910) امتصاص مواد خياطة الجروح.
6. إجراء transection منتصف الفخذ من المجموعات العضلية مع مقص، تليها تشريح حادة من الأنسجة اللينة إلى المفصل الوركي الفخذي بحسب. استخدام قطع العظام، وإجراء العظم منتصف الفخذ. باستخدام العقيمة مسحة القطن غرامة أو الإسفنج الجيلاتين امتصاص، اضغط بلطف الموقع العظم لتقليل ومنع النزيف.
7. إغلاق الجلد المغطي باستخدام مقاطع الجرح الجراحية وحقن 0.5 مل من SQ المالحة الدافئة لعلاج توازن السوائل. وضع الحيوان على رأس وسادة دافئة رايات في قفص الانتعاش ومراقبة مستمرة حتى مستيقظا.
8. على الجراحة، وجمع عينات من أنسجة الأورام الأولية لRNA، DNA أو عزل بروتين، والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 مئوية. للثقافة الخلية الأولية، وجمع عينات الأنسجة في هذه الخطوة، كما هو موضح في القسم 9 أدناه. إصلاح الأنسجة أطرافهم المتبقية في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة لالأنسجة وimmunochemisمحاولة، بما في ذلك الكشف hypoxyprobe-1.
9. مراقبة الحيوانات لتحرك والألم واستهلاك الغذاء خلال 6 ساعات الأولى بعد الجراحة، ثم كل يوم لمدة 3 أيام. حقن عامل مسكن (كاربروفين 5 ملغ / كغ، SQ) يوميا لمدة 3 أيام. إزالة مقاطع الجرح 10 أيام بعد بتر باستخدام مزيل الجرح كليب.

6. الفئران رصد لوجود الانبثاث

1. مراقبة الفئران يوميا وتقييمها للعلامات سريرية للورم خبيث على الأقل مرتين في الأسبوع.
   1. مراقبة الحيوانات لوجود macrometastases كما عرض الجماهير التي تتطور في أماكن مختلفة، وعادة ما الكتفين والساقين المقابل والفكين. تحقيقا لهذه الغاية، جس بعناية الرأس والعنق ومنطقة الإبطين، وhindlimb المقابل. تحقق من وجود نقائل الجهاز الداخلية عن طريق انتفاخ في البطن مع التصوير بالرنين المغناطيسي المسح.
   2. تحقق من وجود الانبثاث الرئة عن طريق الضغط على عملية سيفي الشكل (الطرف الأدنى من القص) مع INDEالإصبع العاشر. ²⁴
      ملاحظة: هذا الضغط يقلل من قدرة التنفس حجابي. الفئران مع الانبثاث الرئة المتقدمة تظهر علامات الضائقة التنفسية يتجلى في التنفس شاقة.
   3. مراقبة الحيوانات لأعراض عصبية مثل الشلل الساق وترنح يشير الانبثاث إلى الجهاز العصبي المركزي.
   4. مراقبة الفئران مرة واحدة في الأسبوع على الأقل لفقدان الوزن، ومؤشرا على تطور المرض المحتملين. يعتبر الجسم وفقدان الوزن تزيد عن 15٪ من وزن ما قبل الإجرائية نقطة نهاية إنسانية.

7. التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) للكشف الانبثاث

1. أداء التصوير بالرنين المغناطيسي للكشف عن الانبثاث في نقاط الوقت المطلوب. ¹⁸
   ملاحظة: في هذه الدراسة، تم استخدام مطياف الأفقي 7 تيسلا. تم إجراء التصوير بالرنين المغناطيسي في أيام 15 و 35 بعد بتر للخلايا SK-ES1 وفي يوم 15 لTC71 الخلايا.
2. ضع الماوس في لمحة تعريفية chambe التخديرص تحتوي على 1-3٪ الأيزوفلورين في خليط الغاز من 30٪ من الأكسجين وأكسيد النيتروز 70٪.
3. ترك الماوس في غرفة تحريض حتى يصبح غير قادر على الاستجابة للمؤثرات الخارجية. ثم إزالة الحيوان من غرفة تحريض.
4. نقل الماوس تخدير على حامل التجسيمي مع التنفس وmonitorization درجة الحرارة مع الادارة مستمرة من 1.5٪ الأيزوفلورين وأكسيد النيتروز بنسبة 30٪. تطبيق العقيمة مرهم للعين غير بالأدوية إلى كل عين لمنع جفاف القرنية. صورة الحيوان إما في 40 أو 23 ملم بروكر حجم الماوس لفائف الجسم كله أو تصوير الدماغ، على التوالي.
5. استخدام ثنائي الأبعاد، T2 المرجحة نادر تسلسل: TR = 3000 ميللي ثانية، TE = 24 ميللي ثانية، مصفوفة = 256، فوف = 4.35 س 3.0 سم، وسمك شريحة = 0.5 مم، عامل نادر = 4 والمتوسطات = 4. ¹⁸
6. وضع الحيوانات في قفص الانتعاش الحار ومراقبة مستمرة حتى مستيقظا.
   ملاحظة: إن الفئران على التعافي سريعا منذ يستخدم طائرة الضحلة من التخدير.
7. مراقبة الحيوانات خلال ساعة 6 الأولى بعد التصوير للتأكد من عدم وجود أي آثار سلبية من التخدير.

8. القتل الرحيم والتشريح

1. الموت ببطء الفئران مرة واحدة الحيوانات الحالية مع الانبثاث كشفها بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي و / أو الأعراض السريرية لتطور المرض.
   ملاحظة: في هذه الدراسة، تمت التضحية الفئران في أيام 50 و 25 بعد بتر للحيوانات تحمل SK-ES1 وTC71 xenografts، على التوالي. في بعض الحالات، كان القتل الرحيم في وقت سابق ضرورية نظرا للعبء ورم خبيث عالية.
2. الموت ببطء الفئران عن طريق التعرض لثاني ₂ في 1.5 لتر / دقيقة (CO ₂ في 10-30٪ من غرفة القتل الرحيم المجلد / دقيقة). لضمان موت الحيوان، نفذ خلع عنق الرحم بعد التعرض CO _2.
3. رش الماوس كامل مع 70٪ من الإيثانول ووضعه في غطاء تدفق الصفحي. جمع الدم عن طريق ثقب القلب باستخدام إبرة 25 G ونصف مع حقنة 1 مل ونقل إلى جمع الدم توأن تحتوي على 2 ملغ من EDTA.
4. جمع الأنسجة التالية: الطحال والغدد الكظرية، والمبايض والكلى والكبد والرئتين والدماغ والساق اليمنى، ونخاع العظام من كل من العضد والعمود الفقري، وكذلك الانبثاث العيانية موجودة في مواقع أخرى. ^25،26
5. إصلاح نصف كل الأنسجة في 10٪ من الفورمالين محايدة مخزنة لالأنسجة وكيمياء المناعة، بما في ذلك الكشف hypoxyprobe-1. التقط تجميد النصف الآخر في النيتروجين السائل، ثم تخزينها في -80 مئوية لمدة RNA، DNA أو عزل بروتين. ^25،26 لزراعة الخلايا الأولية، وجمع عينات الأنسجة كما هو موضح في القسم 9 أدناه.

9. الثقافة الخلية الأولية

1. لأداء ثقافة الخلية الأولية، تشريح الأنسجة من الطرف بتر (القسم 5 أعلاه) أو أثناء التشريح (المادة 8 أعلاه) تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي.
2. إعداد خلية ثقافة وسائل الإعلام يتناسب مع خط الخلية المستخدمة للحقن مثلي، على أن تستكمل مع البنسلين (200 وحدة / مل)،الستربتومايسين (200 ميكروغرام / مل)، fungizone (1 ميكروغرام / مل)، و 0.2٪ الميكوبلازما المضادات الحيوية الوقائية. ضع 2.5 مل من مستنبت الأساسي في لوحة خلية ثقافة 6 سم.
3. تحديد المناطق الأنسجة السرطانية قابلة للحياة من الأورام الأولية أو الانبثاث، ثم عزل 2-3 شرائح بمعدل 2-3 ملم كل باستخدام مقص العقيمة.
   ملاحظة: تم العثور على عادة الأنسجة السرطانية قابلة للحياة على حواف الورم ويمكن تميز من نخر من قبل ردي اللون أو يميل إلى الحمرة لها، بريق كبير والمظهر الرطب بشكل عام. في المقابل، يعتبر النسيج الميت عادة في مركز الورم، ويقدم باعتباره بيضاء / كريم كتلة اللون مع مملة، والمظهر جبني. ²⁷
4. نقل قطاعات معزولة إلى لوحة خلية ثقافة 6 سم تحتوي على مستنبت الأساسي هو موضح في الخطوة 9.2.
5. ثقافة الخلايا تحت الظروف القياسية، كما وصفها في القسم 1 (ملاحظة) و 9.2. ^18،28 تحقق من ثقافة لنمو الخلايا الناشئة عن قطعة نسيج، ذوي الخوذات البيضاءالتراث الثقافي غير المادي ينبغي مراعاتها في غضون أيام قليلة. مرة واحدة الخلايا الوصول إلى نقطة التقاء، ويعرض للتريبسين وترويجها وفقا للتقنيات زراعة الخلايا القياسية.
   ملاحظة: ثقافة الخلية الأولية يمكن استخدامها في وقت لاحق لتقييم النمو وخصائص المنتشر من الخلايا المشتقة من الرقابة ونقص الأوكسجين الأورام، وكذلك خصائصها الجزيئية، كما هو موضح سابقا. ¹⁸

النتائج

بعد حقن الخلايا الجذعية الجنينية في عضلة الساق، ويسمح الأورام الأولية أن تنمو إلى حجم العجل من 250 مم ³ (الشكل 1 و 2). الوقت اللازم للأورام للوصول إلى هذا الحجم يتراوح عادة 10-15 يوما لTC71 إلى 20-25 يوما لxenografts SK-ES1، على التوالي. الأورام في حجم ال...

Discussion

ويشمل نموذجنا مقارنة ورم خبيث في مجموعتين تجريبيتين - مجموعة مراقبة، حيث يسمح للأورام لتطوير في hindlimb تليها البتر عند بلوغ حجم العجل 250 ملم ^3، ومجموعة المعرضة للنقص الأكسجين، والذي tumor- يخضع تحمل hindlimb لفال في نفس الحجم، تليها بتر بعد 3 أيام. على الرغم من أن في هذه ا?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells	ATCC
TC71 Human ES cells			Kindly provided from Dr. Toretsky
McCoy's 5A (modified) Medium	Gibco by Life Technologies	12330-031
RPMI-1640	ATCC	30-2001
PBS	Corning Cellgro	21-040-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500mL
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life Technologies	25200-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco by Life Technologies	15140-122
Fungizone® Antimycotic	Gibco by Life Technologies	15290-018
MycoZap™ Prophylactic	Lonza	VZA-2032
Collagen Type I Rat tail high concetration	BD Biosciences	354249
SCID/beige mice	Harlan or Charles River	250 (Charles River) or 18602F (Harlan)
1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle	BD	329424
Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP)	Hospira, INC	NDC 0409-7984-37
Digital calipers	World Precision Instruments, Inc	501601
Surgical Tools	Fine Science Tools
Rimadyl (Carprofen) Injectable	Zoetis
Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid)	HPI, Inc	HP-100mg
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg)	HPI, Inc	CCI-103F-250mg
Povidone-iodine Swabstick	PDI	S41350
Sterile alcohol prep pad	Fisher HealthCare	22-363-750
LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment)	Major Pharaceuticals	NDC 0904-5168-38
VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56617-014
Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade	Oster	078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade)
Nair Lotion with baby oil	Church & Dwight Co., Inc.
Silk 6-0	Surgical Specialties Corp	752B
Prolene (polypropylene) suture 6-0	Ethicon	8680G
Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0	Ethicon	J386H
Fisherbrand Applicators (Purified cotton)	Fisher Scientific	23-400-115
GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4	Pfizer Pharmaceutical	9039605
Autoclip Wound Clip Applier	BD	427630
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Autoclip remover	BD	427637
Aound clip	BD	427631
MRI 7 Tesla	Bruker Corporation
Paravision 5.0 software	Bruker Corporation
CO2 Euthanasia system	VetEquip
25 G 5/8 Needle (for heart-puncture)	BD	305122
0.1 ml syringe (for heart-puncture)	Terumo	SS-01T
K3-EDTA Micro tube 1.3 ml	Sarstedt	41.1395.105
10% Neutral Buttered Formalin	Fisher Scientific	SF100-4