والاستشعار القائم بولي آنلين من الأحماض النووية

Summary

Nucleic acids are common analytes for assessing biological systems; however, bias from enzymatic manipulation can cause concern. Here a method is described for label-free detection of nucleic acids using polyaniline. This sensitive, cost-effective sensor technology can distinguish single nucleotide differences between molecules.

Abstract

Detection of nucleic acids is at the center of diagnostic technologies used in research and the clinic. Standard approaches used in these technologies rely on enzymatic modification that can introduce bias and artifacts. A critical element of next generation detection platforms will be direct molecular sensing, thereby avoiding a need for amplification or labels. Advanced nanomaterials may provide the suitable chemical modalities to realize label-free sensors. Conjugated polymers are ideal for biological sensing, possessing properties compatible with biomolecules and exhibit high sensitivity to localized environmental changes. In this article, a method is presented for detecting nucleic acids using the electroconductive polymer polyaniline. Simple DNA "probe" oligonucleotides complementary to target nucleic acids are attached electrostatically to the polymer, creating a sensor system that can differentiate single nucleotide differences in target molecules. Outside the specific and unbiased nature of this technology, it is highly cost effective.

Introduction

Conjugated polymers provide many options for molecular sensors. This includes fluorescence, electronic, and colorimetric responses¹. There have been many efforts to incorporate conjugated polymers in nucleic acid sensors. However, most systems require secondary detection, limiting sensing options². Recently, we reported a conjugated polymer-based sensor platform built on polyaniline (PANI) that exploits properties of this polymer, creating a label-free system³. PANI is an extensively conjugated electro-active polymer with properties such as fluorescence and resistance that are suitable for measuring biological systems⁴. The excitons within the structure are not localized leading to mobility of the positive charge between monomeric subunits. This provides a flexible scaffold of positive charges that can interact with the negatively charged backbone of DNA^5,6. Importantly, electrostatically attached DNA is orientated such that nitrogenous bases can participate in base pairing. Association with DNA alters the electronic properties of PANI, an effect that can be enhanced by UV irradiation (Figure 1)³. Using this system, oligonucleotides complementary to target nucleic acids can be immobilized on PANI. Multiple studies have demonstrated that upon hybridization electrostatically adsorbed oligonucleotides dissociate from PANI or other cationic matrices due to conformational changes caused by the switch to a double-stranded DNA structure^3,5,7.

In a sensor system where probe attachment modulates conjugated polymer properties, hybridization events can be transduced without labels or enzymatic modification of probes or target nucleic acids. Conjugated polymers offer great flexibility in detection methods, one of which is fluorescence. Through monitoring PANI fluorescence, concentrations of target nucleic acids as low as 10^-11 M (10 pM) can be detected³. Detection is rapid, occurring within 15 minutes of hybridization, and specific where a single mismatch in a target molecule can be differentiated³.

Fabrication of PANI-sensors is straightforward. High molecular weight PANI can be generated that is well-dispersed in water using standard synthesis procedures involving aniline monomer, surfactant, and controlled addition of an oxidant. Yield can be very high and unreacted oxidant removed by washing with water, ensuring no further PANI growth. PANI-probe association occurs spontaneously upon mixture, and complex formation is enhanced by mild UV exposure. Hybridization can be carried out immediately, and the changes in PANI fluorescence assayed following a short incubation. The simplicity of this technology makes it highly accessible to many laboratories.

Protocol

1. للمعالجة باني التجميعي

1. حل الأنيلين (1 مل، 11 ملمول) تماما في 60 مل من الكلوروفورم في 250 مل قارورة جولة القاع. إثارة في 600 دورة في الدقيقة ل5 دقائق وبارد إلى 0-5 درجة مئوية مع الثلج. هذا عادة ما يستغرق 15-20 دقيقة (الشكل 2A).
2. إضافة الصوديوم دوديسيل البنزين سلفونات (NaDBS) (7.44 غرام، 21 ملمول) إلى حل الأنيلين في دورق كروي، مع التحريك في 600 دورة في الدقيقة.
3. حل فوق كبريتات الأمونيوم (APS) (3.072 غرام، 13.5 ملمول) في 20 مل من الماء وإضافة كل منها قطرة من الحكمة أكثر من 30 دقيقة لتجنب ارتفاع درجة الحرارة رد فعل.
4. تنفيذ رد فعل في 0-5 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، والسماح لها للوصول إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة أخرى.
5. مراقبة خليط التفاعل بدوره في البداية أبيض حليبي بعد 15 دقيقة، والبني الداكن ثم بعد 2 ساعة وفي النهاية إلى اللون الأخضر الداكن ذلك بعد 24 ساعة (الشكل 2B-إف).
6. تصفية حل باني-NaDBS مع قمع بوخنر. مزيج 80 مل الكلوروفورم، و 120 مل من الماء في النحوقمع eparation (الشكل 2G).
7. احتضان الحل لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة وجمع باني خضراء داكنة من قمع الفصل، وترك NaDBS المتفاعل وكالة الأنباء الجزائرية في طاف مائي.

2. خلط باني مسبار الأشعة فوق البنفسجية والإشعاع

1. تمييع باني حل 10X مع الكلوروفورم للماء (1: 3 ت / ت) ومزيج 200 ميكرولتر من باني المخفف مع 6.4 مكرومول من أليغنوكليوتيد] الحمض النووي التحقيق التي كتبها هزاز لطيف لمدة 15 دقيقة في أنبوب microfuge.
2. أشرق الحل باني الحمض النووي مع 1200 μJ / الطول ² من الأشعة فوق البنفسجية في crosslinker ل2 دقيقة. ومن الأهمية بمكان أن التعرض للأشعة فوق البنفسجية يقتصر على المبلغ المشار إليه. مددت التعرض للأشعة فوق البنفسجية يهدد التغيير مضان في باني، من المحتمل بسبب التساهمية عبر ربط باني والحمض النووي.
3. مجمعات بيليه بواسطة الطرد المركزي في 17000 x ج لمدة 6 دقائق، ويغسل مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). بيليه مرة أخرى، وإعادة تعليق في برنامج تلفزيوني.

3. Hybridization من باني مسبار

1. إضافة 8 ميكرولتر من 100 ميكرومتر أليغنوكليوتيد] الحمض النووي مكملة أو استهداف الأحماض النووية إلى 200 ميكرولتر من المجمعات باني مسبار.
2. أداء التهجين التي تعصف حل الخليط لمدة 15 دقيقة في 40 ° C.
3. بيليه المجمعات باني بواسطة الطرد المركزي في 17000 x ج لمدة 6 دقائق. يغسل مع برنامج تلفزيوني واعادة تعليق في الماء.

4. الانبعاثات مطرد القياس دولة الإسفار

1. إضافة باني من العلاجات المختلفة في صفيحة 96 جيدا وقياس مضان الانبعاثات في نطاق 270-850 نانومتر الإثارة في 250 نانومتر. ينبغي مراعاة ذروة الانبعاثات لباني حوالي 500 نانومتر.

5. مضان المجهر قياس تهجين دوبلكس

1. إسقاط معطف باني على ساترة البورسليكات الزجاج وجافة عند 40 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
2. إضافة التحقيق (8 ميكرولتر من 100 ميكرومتر) على فيلم باني المجففة وأشرق ذلك مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية (1200 μJ / سم ² ) لمدة 2 دقيقة.
3. غسل فيلم باني مسبار مع برنامج تلفزيوني وجافة عند 40 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
4. أداء التهجين لمدة 15 دقيقة وذلك بإضافة الهدف الأحماض النووية. هذا يمكن أن يكون عينة بيولوجية أو قليل النوكليوتيد تحكم الهدف (8 ميكرولتر من 100 ميكرومتر). اتبع مع غسل برنامج تلفزيوني.
5. الحصول على صور الفلورسنت في 40X التكبير، مع 500 نانومتر تمريرة طويلة التصفية.

النتائج

الشكل 2A يلتقط الإعداد رد فعل في بداية عملية البلمرة، أي قبل وكالة الأنباء الجزائرية بالإضافة. تشكيل مذيلة هو الخطوة الأولى في رد فعل يحدث التوليف عملية باني في واجهة micellar. الشكل 2B يظهر حل حليبي بعد 5 دقائق. 30 دقيقة بعد إضافة ...

Discussion

جهاز استشعار على أساس باني من الأحماض النووية يتطلب الإذابة من البوليمر في الماء من أجل التفاعل مع الحمض النووي والحمض النووي الريبي. ويتم إنجاز تشتت باني في المياه باستخدام السطحي لتشكل المذيلات كما ذكرت سابقا ^8. بالإضافة إلى NaDBS المستخدمة هنا الأخرى أنيوني ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aniline	Fisher Scientific	A7401-500	ACS, liquid, refrigerated
Ammonium peroxydisulfate	Fisher Scientific	A682-500	ACS, crystalline
Sodium dodecylbenzene sulfonate	Pfaltz & Bauer	D56340	95% solid
Chloroform	Fisher Scientific	MCX 10601	Liquid
DNA primers	MWG operon	n/a	custom DNA sequence ~20 bps
Microplate	USA Scientific	1402-9800	96 well, polypropylene as it is unreactive to chloroform
Microplate Adhesive Film	USA Scientific	2920-0000	Reduces well-to-well contamination, sample spillage and evaporation
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-544-D	PANI coated on UV irradiated cover glass
UV crosslinker	UVP	HL-2000	Energy: X100 μJ/cm2; Time: 2 min
Hybridization Oven	VWR	01014705 T	Temperature: 400 °C; with rocking for 15 min
Glass Apparatus	Fisher Scientific		Three necked round bottom flask for reaction; dropping funnel, stoppers, condenser, separating funnel
Microscope	Leica Microsystems	Leica IMC S80	Magnification 20X; Pseudo color 536 nm; Exposure 86 msec; Gain 1.0x; Gamma 1.6
Microplate Reader	Molecular Devices	89429-536