JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform long-term high-resolution, single cell imaging of the intact lung in real time using a vacuum stabilized imaging window.

Abstract

ورم خبيث في المواقع الثانوية مثل الرئة والكبد والعظام هو ذلك الحدث الأليم مع معدل وفيات ما يقرب من 90٪ 1. من هذه المواقع، والرئة هو الأكثر صعوبة في تقييم باستخدام التصوير الضوئي حيوي داخلي بسبب موقف المغلقة في داخل الجسم، والطبيعة الحساسة ودورها الحيوي في الحفاظ على وظائف الأعضاء السليم. في حين طرائق السريرية (التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني (PET) والتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) والتصوير المقطعي (CT)) قادرة على توفير صور موسع من هذا النسيج، أنها تفتقر إلى القرار اللازم لتصور الأحداث المبكرة بذر، مع بكسل واحد تتكون من ما يقرب من ألف الخلايا. النماذج الحالية من الرئة المنتشر البذر الفرضية القائلة بأن الأحداث بعد وصوله إلى الخلايا السرطانية هي حتمية من أجل البقاء والنمو اللاحق. وهذا يعني أن الوقت الحقيقي أدوات التصوير حيوي داخلي لقرار خلية واحدة 2 مطلوبة من أجل تحديد الظواهر من سل البذرليرة سورية واختبار هذه النماذج. في حين عالية الدقة التصوير الضوئي في الرئة وقد تم تنفيذ باستخدام مختلف الاستعدادات خارج الحي، هذه التجارب عادة ما تكون المقايسات واحدة وقت نقطة وعرضة للالتحف واستنتاجات خاطئة محتملة، بسبب البيئة المتغيرة بشكل كبير (درجة الحرارة، وفرة، السيتوكينات، الخ ) الناتجة عن إزالة من تجويف الصدر والدورة الدموية 3. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة التي الوقت الفاصل بين التصوير الضوئي حيوي داخلي في الرئة سليمة ومن الممكن استخدام فراغ استقرت نافذة التصوير 2،4،5 ومع ذلك، فقد اقتصرت الأوقات التصوير التقليدية إلى ما يقرب من 6 ساعات. نحن هنا وصف بروتوكول للأداء على المدى الطويل التصوير حيوي داخلي الوقت الفاصل بين الرئة باستخدام مثل نافذة على مدى 12 ساعة. تسلسل صورة مرور الزمن تم الحصول عليها باستخدام هذه الطريقة تمكن التصور والكميات من التفاعلات خلية خلية، وديناميات غشاء ونضح الأوعية الدموية في الرئة. علينا مواصلة دescribe تقنية معالجة الصور التي تعطي رؤية واضحة غير مسبوق من الأوعية الدموية الدقيقة في الرئة.

Introduction

وقد ثبت عالية الدقة التصوير الضوئي حيوي داخلي أن تكون حاسمة لفهم العديد من العمليات البيولوجية، مما يسمح للوحيدة الخلية والمعلمات الفرعية الخلوية إلى أن تقاس وكميا. في أبحاث السرطان، وقد أدى التصوير حيوي داخلي من الخلايا السرطانية واللحمية لاكتشاف العديد من التفاعلات microenvironmental 6-11 التي تكون موجودة فقط في الحيوان سليمة.

الاكتشافات حول microenvironments المرتبطة دخول الوعاء ونشر الخلايا السرطانية في سرطان الثدي باستخدام تحليل خلية واحدة التصوير الضوئي في الجسم الحي أدت حتى إلى علامات جديدة لتشخيص والاستجابة للعلاج في مرضى سرطان الثدي 12-16. تقنيات أفضل التصوير المتاحة للعرض في أعماق الأجهزة الحيوية الداخلية سليمة هي طرائق السريرية (التصوير بالرنين المغناطيسي، PET، CT) والتي توفر إطلالة رائعة على الجهاز بأكمله ويمكن أن تكشف عن الأمراض حتى قبل أن تنتج الأعراض السريرية. أنهم غير قادرين، حowever، للكشف عن المراحل الأولى من ورم خبيث والآليات الخلوية يقود تطور الورم نظرا لعدم وجود قرار خلية واحدة. بحلول الوقت الانبثاث الرئة واضحة في هذه الطرائق، فهي راسخة والمتكاثرة. ونظرا للتقدير أن 90٪ من خلايا نشر الورم التي تصل إلى الرئة إما لا البقاء على قيد الحياة 17 أو في البداية تظل نائمة 18، ومراقبة وصولها في وقت سابق بكثير مما كان متوقعا 19 سابقا، تصوير أولى خطوات الوصول والبقاء على قيد الحياة يصبح من الأهمية ل فهم عملية البذر النقيلي وتكرار نمو الورم في مواقع بعيدة.

وقد ثبت أداء هذه الملاحظات في الرئة صعب للغاية ولكن؛ وقد استخدمت الغالبية العظمى من الدراسات التصوير خارج الحي أو يزدرع الاستعدادات 20-23، والتي تعطي فقط وجهة نظر في الرئة في نقطة زمنية واحدة. في حين أن هذه الاستعدادات لا توفر معلومات مفيدةrmation، فإنها لا تعطي فهم كامل للتفاعلات، علاقة العلة والمعلول، والديناميات التي تحدث بين مختلف مكونات المكروية. عدم وجود نظام سليم الدورة الدموية (وعدم التوازن ما يصاحب ذلك من التوازن)، وفصل عن بقية نظام المناعة في الجسم يجعل من رغبة في التحقق من صحة الاستنتاجات التي تولد هذه الاستعدادات في أنسجة سليمة في الجسم الحي.

وقد أجريت العديد من المجموعات التصوير حيوي داخلي في الرئة سليمة 2،4،5،24-33 مع Wearn والألمانية كونه أول من جراحيا فضح طبقة الجنبي 24 وتيري أول من الاستفادة من نافذة التصوير زرع 25.

ارتفاع القرار التصوير في الرئة أعاق إلى حد كبير من قبل حركة مستمرة الرئة ولقد تم تطوير العديد من التقنيات للتغلب على هذا القيد. فاغنر و[فيلي] 27 درس الحركة الطبيعية في الرئة الكلابويهدف البروتوكول من العمليات الجراحية لتحديد نافذة على زرعها على المنطقة ثابتة نسبيا في حين تستخدم فاغنر فراغ في كتابه نافذة إعداد الجراحية لشل حركة الأنسجة 28. منذ ذلك الوقت، وقد تم استخدام مجموعة متنوعة من التقنيات لصورة الرئة بما في ذلك: لقط القصبات الهوائية، توقف التنفس أثناء متسلسل والتصوير بوابات، واقتناء oversampled، لصق الفص الرئة والفراغ (34). كل من هذه مزاياه وعيوبه بحيث لم يبرز أي أسلوب واحد متفوقة على 34 بلدا آخر. على سبيل المثال، لقط القصبات الهوائية وتوقف التنفس أثناء متتابعة يغير تبادل العادي من الغازات في الرئة وقد يسبب انخماص. التصوير مسور واكتساب oversampled لا يعانون من هذه العيوب ولكنها تتطلب سرعة عالية أو معدات التصوير المتخصصة التي لا يمكن الوصول إليها على نطاق واسع. وأخيرا كل من لصق الرئة وتقنية فراغ تجنب كلا من العيوب المذكورة أعلاه، ولكن قد تظهر الإصابة القوة التي يسببها القص إذا الرعاية ليست تاكداخلية. في السنوات الأخيرة، وقد تم تصغير نافذة فراغ وتكييفها للاستخدام في الفئران باستخدام متحد البؤر وmultiphoton المجهر 4،5،33 وممتازة عالية الدقة التصوير وقد تم تحقيق 2. ويلخص الجدول 1 هذا التاريخ الغني ويسلط الضوء على تلك الأوراق التي تصف الرواية التطورات في استخدام حيوي داخلي نوافذ التصوير الرئة.

يصف هذا البروتوكول استخدام موسع الوقت الفاصل بين multiphoton حيوي داخلي المجهري لورم خبيث الصورة في العيش والرئة سليمة مع أعلى دقة التحت خلوية ممكن. يتم الحصول على الصور لمدة تصل إلى 12 ساعة باستخدام مجهر multiphoton مجهزة عالية الفتحة العددية عدسة موضوعية ومتعددة أنبوب مضخم (PMT) كاشفات. وتستخدم نماذج الماوس المعدلة وراثيا لتسمية fluorescently الضامة الأم جنبا إلى جنب مع الفلورسنت عالية ديكستران الوزن الجزيئي والبروتينات transfected الخلايا السرطانية الفلورسنت (لتسمية خلايا الأوعية الدموية والأورام التواليذ). في حين أن هذا الاختيار من خلايا fluorescently المسمى يمكن تصور التفاعلات خلية بلعم الخلايا البطانية الورم وديناميكية، وهذا البروتوكول يعمل على أي سلالة من الماوس الفلورسنت أو غير الفلورسنت. بعد الاستحواذ، والقضاء على حركة الانجراف المتبقية (إن وجدت) باستخدام فيجي المساعد 35،36 والعرف وحدات الماكرو الوقت المتوسط قناة الأوعية الدموية للقضاء على اللمعان الناجم عن غير المسماة الخلايا الدموية.

في حين يركز هذا البروتوكول على الانبثاث التصوير، وتقنيات قابلة للتطبيق على العديد من العمليات البيولوجية الأخرى يمكن ملاحظتها مع التصوير ذات الدقة العالية وحيدة الخلية في الرئة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

وقد تم تنفيذ كافة الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح لاستخدام الحيوانات الفقارية، بما في ذلك موافقة مسبقة من كلية ألبرت أينشتاين للطب المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.

1. توليد Fluorescently المسمى الفأر نموذج وورم الخلايا

  1. إعداد 100 مل من 0.1٪ (ث / ت) زلال المصل البقري / الفوسفات مخزنة المالحة (BSA / PBS) عازلة عن طريق خلط 0.1 غرام من BSA مع 100 مل من برنامج تلفزيوني.
  2. إعداد الخلايا السرطانية التي fluorescently المسمى ترنسفكأيشن مستقرة.
    ملاحظة: هنا نستخدم خلايا E0771-LG، وهو مشتق المنتشر بشدة E0771 الماوس خلايا غدية الثديية 37 التي تم عزلها من الأورام النقيلي المتقدمة في الرئة من C57BL / 6 الماوس حقنه عن طريق الوريد مع خلايا E0771 الوالدين 38.
    1. 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن، لوحة 1 × 10 5 خلايا EO771-LG على طبق نسيج الثقافة 60 ملم في 2 مل من المضاداتعرة الحرة 10٪ FBS (الجنين المصل البقري) DMEM (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة) واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    2. في وقت ترنسفكأيشن، احتضان 2 ميكروغرام من ناقلات البروتين الفلوري مع 10 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن لمدة 30 دقيقة قبل إضافة 190 ميكرولتر من تخفيض وسائل الاعلام المصل.
    3. غسل الخلايا EO771-LG مع Dulbecco والفوسفات المالحة (D-PBS) مرة واحدة وإضافة مزيج ترنسفكأيشن بلطف.
    4. احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 6 ساعة.
    5. غسل الخلايا والثقافة transfected في 2 مل من DMEM كاملة (10٪ FBS، البيروفات 1MM، 100 U / البنسلين مل، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين) لمدة 2 أيام.
    6. غسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة، إضافة 500 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين-EDTA واحتضان لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    7. جمع تعليق خلية وتخلط مع حجم 1 على الأقل من اكتمال DMEM وتدور باستمرار في 280 ز س.
    8. Resuspend الخلايا في 1 مل من اكتمال DMEM وتوسيع ثقافة الخلية إلى10 سم صحن زراعة الأنسجة.
    9. بدء اختيار الخلايا transfected بإضافة 700 ميكروغرام / مل من G418 المضادات الحيوية الانتقائية إلى 8 مل من DMEM وثقافة كاملة لمدة أسبوع، وتغيير المتوسط ​​كل ثلاثة أيام.
  3. إثراء السكان الفلورسنت من خلايا transfected التي كانت تحت التحديد في G418 بواسطة مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) 39،40.
    1. غسل الخلايا مع 5 مل من برنامج تلفزيوني وإضافة 1.5 مل من 0.25٪ التربسين.
    2. احتضان لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية وتخلط مع حجم واحد على الأقل من اكتمال DMEM.
    3. جمع تعليق خلية وتدور باستمرار في 280 x ج واعادة تعليق الخلايا في 1 مل من معقم 0.1٪ (ث ت /) العازلة BSA / برنامج تلفزيوني.
    4. تصفية تعليق الخلية من خلال شبكة 40 ميكرون وضبط مستوى الصوت إلى 1 مل مع 0.1٪ BSA عازلة / برنامج تلفزيوني للفرز.
    5. FACS-فرز 10٪ ألمع السكان على أساس الطيف مضان باستخدام فارز FACS 41.
    6. ثقافة الخلايا مرتبة لمدة أسبوع آخر شاختيار التانجو (700 ميكروغرام / مل G418 في DMEM كاملة).
    7. إعادة تحديد الخلايا fluorescently المسمى التدفق الخلوي عن طريق تكرار الخطوات 1.3.1 إلى 1.3.6 مرة أخرى.
    8. بعد الجولة الثانية من الاختيار، ويعرض للتريبسين وتصفية وإعادة تعليق الخلايا في 0.1٪ BSA / PBS كما هو موضح (خطوات 1.3.1-1.3.4). ضبط التركيز إلى 2 × 10 6 خلية / مل لخلية واحدة الفرز في 96 لوحات جيدة باستخدام فارز FACS.
    9. إعداد 3-5 96 لوحات جيدة مع 100 ميكرولتر من DMEM الكامل لجمع. لتحسين البقاء على قيد الحياة بعد الفرز، وإضافة 100 ميكرولتر من مستنبت تصفيتها من الأطباق التي كانت تزرع الخلايا EO771-LG 42.
    10. بعد فرز الخلايا في لوحات 96-جيدا، والعودة الخلايا ثقافة لمدة 2 أيام (37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2).
    11. تحديد الآبار مع الحيوانات المستنسخة واحدة قابلة للحياة عن طريق الفحص تحت المجهر المقلوب في 5X التكبير.
    12. يعرض للتريبسين وتوسيع استنساخ قابلة للحياة وتجميد الخلايا للنسخ الاحتياطي.
      1. غسل الآبار مع غرامبسبب استنساخ مع 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة. إضافة 50 ميكرولتر من 0.25٪ ث / التربسين الخامس واحتضان 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة 50 ميكرولتر من اكتمال DMEM ونقل إلى العقيمة أسفل لوحة 96-جيدا V-أسفل أو مستديرة لتدور باستمرار في 280 x ج لمدة 5 دقائق.
      2. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر من 700 ميكروغرام / مل G418 الكامل DMEM ولوحة كل استنساخ في لوحات 12-جيدا. إضافة 400 ميكرولتر من DMEM كاملة مع G418 والثقافة حتى متموجة.
      3. غسل الآبار مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، إضافة 100 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين واحتضان 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إضافة 100 ميكرولتر من DMEM كاملة وتدور باستمرار لمدة 5 دقائق في 280 ز س. و resuspend الخلايا في 100 من المجاهدين DMEM كاملة مع G418 ولوحة الخلايا في 6 لوحات جيدا حتى متموجة.
      4. مرة واحدة متموجة، ويعرض للتريبسين الخلايا، تدور أسفل وresuspend في 10٪ DMSO في FBS لتجميد أسهم الخلية.
      5. الحفاظ 1/10 من الايقاف الخلية في الثقافة عن طريق طلاء لهم في أطباق زراعة الأنسجة 100 ملم لتقييم قدراتهم النقيلي.
  4. اختبار إمكانية النقيلي من الحيوانات المستنسخة مختارة.
    1. يعرض للتريبسين وإعادة تعليق الخلايا في المياه المالحة إلى تركيز 2.5 × 10 6 خلية / مل وحقن 200 ميكرولتر في C57BL / 6 الفئران عن طريق الوريد عن طريق الوريد الذيل.
    2. بعد 2 أسابيع، وجمع أنسجة الرئة كما هو موضح سابقا 23 وقياس عبء الورم عن طريق العد السطح أو طريقة stereological 43. اختيار الحيوانات المستنسخة مع إمكانية النقيلي عالية للتصوير حيوي داخلي.
  5. رفع MacBlue (مروج محدد النخاعي القيادة سماوي ببروتين (CFP) التعبير (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)) الفئران مراسل 44.
    ملاحظة: عادة، وتستخدم الفئران بين 8 و 12 أسبوعا، ولكن الفئران في وقت مبكر من 7 و قد تم اختبارها في وقت متأخر من 20 أسبوعا إلى العمل كذلك.

2. Multiphoton مجموعة مجهر صعودا وإعداد التصوير

ملاحظة: في حين أن هذا البروتوكول لا يمكن أن يؤديها في أي موقد وصفت ultiphoton المجهر، وهو النظام المستخدم للحصول على البيانات الواردة في هذا البروتوكول سابقا بالتفصيل 45.

  1. بدوره على جميع مكونات المجهر والليزر بما في ذلك أشعة الليزر ثنائي الفوتون وكشف عن قبل ساعة واحدة على الأقل من وقت التصوير المرجوة.
  2. قبل الجراحة، وقياس قوة الضوء إلى المجهر عن طريق وضع رئيس السلطة متر البصرية في مسار الشعاع قبل المجهر وضبط المقابض ليزر نهاية تجويف مرآة حتى أقصى شدة الضوء في 880 نانومتر للقراءة على السلطة متر البصرية.

محدد نظام 3. فراغ يصل

  1. الغراء ساترة في إطار التصوير (التكميلي الشكل 1) مع cyanoacrylate. سماح لا يقل عن 4 ساعة للالغراء لتجف تماما.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم ذلك خطوة إلى الأمام من الزمن.
  2. قطع 100 ميكرولتر ماصة في السطر الأول من فتحة صغيرة وربط الطرف تقطيعه إلى الخامس رقيقةخرطوم acuum.
  3. ربط نظام فراغ وفقا لشكل 1 والتكميلي الشكل 2.
  4. مع الفراغ على ونهاية مفتوحة سدت، وضبط منظم للفراغ <3 بوصة زئبقية.
    ملاحظة: التعديل النهائي للمستوى فراغ سيتم تنفيذ طريق الملاحظة من الأوعية الدموية في الجسم الحي.
  5. تطبيق طبقة رقيقة من الشحوم البترولية على الجانب السفلي من لوحة التصوير لمنع موضوعي المتوسطة عدسة الغمر من اشرار بعيدا عن لوحة التصوير.
  6. وضع لوحة التصوير على المسرح المجهر.
    ملاحظة: لوحة التصوير مخصصة (الشكل التكميلي 3) هي ورقة من 1/8 "الألومنيوم سميكة تشكيله على حد سواء لتناسب في الفضاء مرحلة إدراج ومع من خلال ثقب في مركز لعقد نافذة التصوير.
  7. إدراج نافذة فراغ في لوحة التصوير مع ساترة إلى أسفل.
  8. تعقيم جميع الأسطح والأدوات بما في ذلك لوحة مرحلة التصوير، والتصوير الفوزمؤشر داو جونز مع 70٪ من الإيثانول.
  9. قم بتوصيل الطرف قطع من طرف ماصة إلى إطار فراغ والشريط خرطوم وصولا الى لوحة التصوير.
  10. جلب وثيقة موضوعية إلى إطار التصوير ووضع قطرة ماء كبيرة بين الهدف وساترة.
  11. تأكد من عدم وجود تسرب من ساترة من خلال منع افتتاح المركزي من النافذة فراغ والتحقق من أن قطرة الماء بين الهدف وساترة لا يحصل يستنشق.
    ملاحظة: هناك القديمة الكمبيوتر أسلوب الماوس وضع الكرة على نافذة مفيدة لمنع افتتاح مركزي.

4. جراحة

  1. اعداد منطقة الجراحية المعقمة.
    1. وضع جميع الأدوات في متناول اليد. تعقيم جميع الأسطح والأدوات بما في ذلك منطقة العمليات الجراحية، والأدوات الجراحية مع 70٪ من الإيثانول.
  2. ربط طول 3 بوصة من 2-0 خياطة لالقسطرة، ¼ بوصة فوق جلبة مع عقدة مزدوجة.
  3. إعداد ذيل فل الوريد القسطرةخوار بروتوكول نشرتها هارني وآخرون. 46.
  4. باستخدام مصباح الحرارة بالأشعة تحت الحمراء (IR)، تدفئة الحيوان في قفصه ل~ 5 دقائق لزيادة تدفق الدم في الوريد الذيل وللمساعدة في إدخال القسطرة. فمن المستحسن للحفاظ على الحيوانات استعد لدرجات حرارة الفسيولوجية طوال العملية الجراحية باستخدام مصباح الحرارة أو وسادة الاحترار.
  5. تخدير الحيوانات مع 5٪ الأيزوفلورين والتحقق من عدم وجود استجابة لقرصة أخمص قدميه.
  6. تطبيق مرهم للعين للعيون للحيوان.
  7. تطبيق محلول مزيل الشعر لمدة 10-30 ثانية لإزالة الشعر من الجانب الأيسر من الحيوان؛ من خط الوسط من الصدر إلى ربع الظهر ومن الإبطين إلى أقل من القفص الصدري.
  8. تنظيف أي محلول الزائد وتعقيم البشرة المكشوفة مع 70٪ من الكحول.
  9. إرفاق محقنة معقمة مليئة برنامج تلفزيوني إلى الوريد القسطرة الذيل وإدراج والشريط في مكان بعد بروتوكول نشرتها هارني وآخرون. 46. تأكد من أن الشريط هو الالتزام بإحكام الإبرة نفسها وليس حرا في الفجوة بين الذيل والشريط.
  10. أنبوبا الماوس التالية إما بروتوكول نشرتها داس وآخرون 47 أو دوبج وآخرون. 48
  11. بدوره على جهاز التنفس الصناعي وضعه على توريد 135 نفسا في الدقيقة و 200 ميكرولتر من خليط الأيزوفلورين الأكسجين.
  12. ربط القسطرة القصبة الهوائية إلى التنفس الصناعي.
  13. تحريك الماوس إلى منطقة العمليات الجراحية. خذ الحذر الشديد على عدم طرد القسطرة.
  14. ربطة عنق خياطة 2-0 في جميع أنحاء خطم من الفأرة تحت أسنان الأمامية.
  15. الشريط القسطرة إلى الخطم.
  16. الشريط forelimb الأيسر لالقسطرة للحفاظ عليه للخروج من المجال الجراحي.
  17. خفض التخدير الأيزوفلورين إلى المستوى السابق من 2.5٪ وتحقق من عدم وجود استجابة لقرصة أخمص قدميه.
  18. باستخدام مقص حاد، وإزالة 1 سم 2 من الجلد فوق جدار الصدر الأيسر.
  19. رفع رانه الثديية وحة الدهون وكوى أي الأوعية الدموية تتعرض مع القلم الكي.
  20. بتر لوحة الدهون عن طريق قطع مع مقص حاد.
  21. إزالة طبقة العضلات وصولا الى القفص الصدري عن طريق قطع مع مقص حاد. الحرص على عدم قطع الوريد الإبطي التوالي في قاعدة forelimb.
  22. استخدام ملقط لانتزاع ورفع ضلع ال 6. باستخدام مقص حاد عقدت في زاوية الضحلة (~ 5 °) قطع الضلع بالقرب من حافة فتحة في الجلد. خذ الحذر الشديد على عدم لمس أنسجة الرئة عرضة للخطر.
  23. توسيع فتحة في جدار الصدر لفضح الفص الرئة بالكامل عن طريق إزالة أربعة أضلاع متتالية.
    ملاحظة: حافظ على افتتاح 5 مم على الأقل بعيدا عن القص لتجنب القلب.
  24. بعناية رفع الماوس عن طريق استيعاب الذيل والقصبة الهوائية القسطرة وتحريك الماوس لمرحلة المجهر التصوير.
  25. مع من فراغ، وملء الغرفة من النافذة فراغ مع برنامج تلفزيوني.
  26. عكس الماوس وموقف يتعرضالرئة خلال نافذة فراغ التصوير.
  27. تتحول ببطء في الفراغ إلى ما يقرب من 3-5 بوصة من الزئبق باستخدام صمام الكرة.
  28. وضع تسخير الزجرية مصنوعة من المناديل الورقية في نصف مطوية مرتين على صدره من الفأرة وشريط لوحة المرحلة كما هو مبين في الشكل التكميلي 2.
  29. مقطع استشعار الفخذ للمقياس التأكسج النبض إلى أعلى الفخذ الحيوان والبدء في البرنامج.
  30. مكان الغرفة البيئية على المسرح وتشغيل نظام التدفئة للحفاظ على الماوس عند درجة حرارة الفسيولوجية.
  31. خفض مستوى الأيزوفلورين إلى 1-1.5٪ للحفاظ على التخدير والحفاظ على تدفق الدم.

5. حيوي داخلي التصوير

  1. جلب 25 × 0.95 الفتحة العددية (NA) هدف عدسة بالقرب من ساترة وإضافة قطرة ماء كبيرة بينهما.
  2. عن طريق وضع epifluorescence، عرض قناة FITC وتقديم أنسجة الرئة إلى التركيز.
  3. إذا لم تفعل قبل الجراحة، طالخلايا السرطانية nject عن طريق القسطرة الوريد الذيل.
    1. قطع المحقنة برنامج تلفزيوني من القسطرة الوريد الذيل.
    2. تحميل محقنة معقمة مع 100 ميكرولتر من تعليق خلية الورم (2 × 10 7 خلية / مل في برنامج تلفزيوني كحد أقصى).
      ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك خطوة مقدما لدراسة صول الخلايا السرطانية للرئة عند نقاط زمنية مختلفة.
    3. ربط المحاقن مع الخلايا السرطانية على القسطرة الوريد الذيل.
    4. ببطء حقن الخلايا السرطانية في الوريد الذيل.
    5. قطع المحقنة مع الخلايا السرطانية من القسطرة الوريد الذيل.
    6. إعادة حقنة برنامج تلفزيوني للقسطرة الوريد الذيل.
      ملاحظة: التعرف على مواقع كل من الخلايا السرطانية قبل حقن ديكستران كما يصبح من الصعب التمييز بين الخلايا السرطانية من إشارة ديكستران عبر بصري بعد الحقن.
  4. تحديد موقع الخلايا السرطانية إلى صورة
    1. لتصوير الخلايا السرطانية الفردية، العثور على جميع الخلايا السرطانية وتسجيل مواقعها مع الالبريد لوحة متعددة من البرنامج.
      1. العثور على جميع مجالات بغية صورة من خلال مراقبة الخلايا السرطانية في بصري المجهر.
      2. في البرنامج، والتحول إلى لوحة متعددة عن طريق النقر على زر متعدد نقطة وتخزين موقع الخلية عن طريق النقر على زر إضافة الوظيفة.
    2. للتصوير الفسيفساء، تحديد أصل الفسيفساء وتعيين الإحداثيات التصوير
      1. تحديد موقف في أعلى الزاوية اليسرى من الهيكل ليتم القبض.
      2. صفر إحداثيات X و Y و Z من المرحلة بالضغط على زر "الصفر" على وحدة تحكم المرحلة.
      3. تصل حمولة القائمة المناسبة الإحداثيات الفسيفساء من خلال النقر على زر "تحميل" واختيار القائمة.
        ملاحظة: سيكون هناك قائمة مثال للفسيفساء 2 × 2 مع تداخل 20٪ من حقل 500 ميكرون نظر هي: Pos.1 = (0،0)، نقاط البيع. 2 = (400،0)، نقاط البيع. 3 = (0400)، نقاط البيع. 4 = (400400).
  5. إزالة حقنة ثإيث برنامج تلفزيوني في الوريد القسطرة الذيل واستبدال مع حقنة تحتوي على ديكستران.
  6. حقن ببطء يصل إلى 100 ميكرولتر من 20 ملغ / مل 155 كيلو دالتون رودامين-ديكستران الذائبة في برنامج تلفزيوني في الماوس عن طريق القسطرة الوريد الذيل تليها ضخ 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العقيمة لمسح الخط. لا يعرض أي فقاعات في الخط. عند الضرورة، حقن ديكستران ساعة واحدة على الأقل بعد حقن الخلايا السرطانية بحيث لا يتجاوز إجمالي حجم تدار على الماوس 4 مل / كغ / ساعة.
  7. إعداد المعلمات التصوير.
    1. التبديل المجهر لوضع multiphoton.
    2. تعيين التكبير إلى عامل من 2X من خلال النقر على زر إشارات التوقيت وتحديث مجال تكبير عامل.
    3. ضبط قوة الليزر ل~ 10٪ (~ 10-15 ميغاواط في العينة) من خلال النقر على زر كشف والليزر ومن ثم تعديل شريط التمرير تسونامي الطاقة إلى 10.
  8. صورة كل موقع للتحقق من وجود الخلايا السرطانية ووضع تصور تدفق وسلامة vasculature.
    ملاحظة: يجب أن يظهر سفن perfused تماما مع الكريات الحمراء تتدفق، وينبغي أن يتضمن ديكستران الفلورسنت داخل الأوعية دون تسرب إلى مساحات خارج الأوعية. ومن المتوقع 20 الخلايا السرطانية لتكون ضمن فتحة واضحة من النافذة فراغ - 10 تقريبا.
  9. ضبط عمق الانطلاق من كل مكان يتم تصويرها.
    1. لكل موقع، وضبط ض موقف بتدوير مقبض التركيز على وحدة تحكم مرحلة لصورة شريحة العليا من الخلايا السرطانية.
    2. وضع الخلايا في وسط مجال الرؤية.
    3. انقر على زر متعددة، انقر على الموقف من مجال الرؤية لتسليط الضوء عليه وانقر على إضافة يليه زر حذف لتحل محل موقف الخلية المخزنة في قائمة متعددة.
    4. مراقبة بصريا السطوع النسبي للخلية الورم في كل موقف.
  10. حفظ مواقع جديدة في كل من الخلايا عن طريق النقر على زر حفظ في لوحة على عدة نقاطد تحديد اسم الملف.
  11. للتصوير الخلايا السرطانية الفردية، واختيار ثلاث خلايا من سطوع أي ما يعادل تقريبا وحذف جميع المواقع الأخرى من قائمة متعددة عن طريق النقر على موقعها في القائمة ومن ثم النقر على زر حذف.
  12. انقر على زر كشف والليزر وضبط المتزلجون لتحقيق مكاسب PMT من قنوات خضراء وحمراء 45 بحيث إشارات أدناه التشبع.
  13. ضبط شريط التمرير للقناة الزرقاء 45 بحيث الضامة تظهر السماوي.
    ملاحظة: سوف تظهر أي إشارة التوافقية الثانية فقط في القناة الزرقاء، ويمكن فصلها عن الضامة السماوي باتباع الإجراء قناة الطرح الموصوفة سابقا 45.
  14. تحديد بداية ض المكدس عمق 0 ميكرون وعمق نهاية إلى 24 ميكرون عن طريق تحريك المرحلة ض إلى الموقع والنقر على بداية ونهاية أزرار على التوالي.
    ملاحظة: سيتم تصور الخلايا الموجودة داخل هذا العمق مع أفضل إشارة لالضوضاء والقرار.
  15. تعيين حجم ض خطوة إلى 3 ميكرون.
  16. تعيين المعلمات التصوير المعلمات التالية الموصوفة سابقا 45،49.
    1. للتصوير الخلايا السرطانية الفردية، انقر فوق الزر إشارات التوقيت وثم أدخل 4 الخامس في حقل عامل التكبير (أي ما يعادل عامل التكبير 1.5X)، أدخل 3 في حقل المتوسطات الإطار وانقر على زر الوقت الفاصل بين وأدخل 10 في حقل الوقت الفاصل.
      ملاحظة: هذه الإعدادات الحصول على 1 إطار كل 3 ثوان.
    2. للتصوير الفسيفساء، انقر فوق الزر إشارات التوقيت وإدخال عامل التكبير من 1.5 V (أي ما يعادل عامل التكبير من 4X)، أدخل 3 في عدد من المتوسطات الإطار وانقر على زر الوقت الفاصل بين وأدخل 10 في قت- الفاصل الزمني الحقل تأخير.
      ملاحظة: هذه الإعدادات الحصول على 1 إطار كل 3 ثوان.
  17. تمكين متعددة، ض المكدس وسائط التصوير ر الفاصل بين بالضغط على الأزرار الخاصة بهم.
  18. اضغط على زر التسجيل للحصول على الصور.
    ليسE: أنسجة الرئة حساسة جدا وعرضة للتلف الصور. يجب القيام به إذا بعد توقف الوقت تدفق التصوير مرور الدم في مجال المصورة، هو الأكثر احتمالا ليزر التصوير عالية جدا ولاحق من غيرها من المجالات في خفض استهلاك الطاقة.
  19. كل 30-45 دقيقة، وضخ ببطء 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني أو المالحة للحفاظ على الماء للحيوان.

6. القتل الرحيم

  1. زيادة الأيزوفلورين إلى 5٪.
  2. حفاظ على الحيوانات أقل من 5٪ الأيزوفلورين حتى 30 ثانية بعد أن يتوقف عن التنفس وإزالة الحيوان من المرحلة.
  3. أداء خلع عنق الرحم للتأكد من القتل الرحيم الكامل.

تحليل 7. صورة

  1. لتجارب التصوير خلية واحدة:
    1. تحميل الصور في فيجي وتنسيقها كما Hyperstack.
    2. لكل ض شريحة في Hyperstack، ولعب مرة فيلم مرور والبحث في الحركة س ص المتبقية. إذا وجدت الحركة س ص المتبقية، وتطبيق البرنامج المساعد دعا StackReg 36 إلى المكدس لالقضاء على الحركة.
  2. لتجارب التصوير الفسيفساء:
  3. تحميل الصور في فيجي وغرزة بعضهم البعض عن طريق فتح الفسيفساء خياطة الماكرو (التكميلي ملف التعليمات البرمجية الفسيفساء خياطة) وإدخال المعلومات حول الصور مثل الدليل، واسم قاعدة الملفات، وعدد من الحقول X و Y في الفسيفساء وعدد من شرائح ونقاط الوقت.
    ملاحظة: نظرا لكيف يفسر جافا الدلائل، يجب أن يكون أسماء المجلدات اثنين الخطوط المائلة العكسية مثل الفواصل فرعي. ونظرا لضيق في المدمج في البرنامج المساعد البشرى خياطة، ويجب ألا تحتوي على أسماء الملفات قاعدة أي شرطات.
  4. للحصول على رؤية واضحة للحدود الأوعية الدموية، ومتوسط ​​بين كل نقطة من النقاط الزمنية للقناة الدم في صورة واحدة، ثم تكرار هذه الصورة كخلفية لكل إطار من الفيلم من القنوات الأخرى.
    ملاحظة: يتم ذلك ببساطة عن طريق تشغيل نفذ المتوسط ​​الدم الماكرو (ملف التعليمات البرمجية التكميلي نفذ المتوسط ​​الدم).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

للتدليل على نوع النتائج التي يمكن تحقيقها مع هذا الأسلوب، نحن حقن الخلايا السرطانية E0771-LG المسمى مع البرسيم البروتين الفلوري في الوريد ذيل MacBlue الفئران 44 في متفاوتة نقاط الوقت قبل الجراحة. بعد الجراحة، تم حقن 155 دينار كويتي رودامين المسمى ديكس?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

دقة عالية في التصوير الضوئي الجسم الحي بالإضافة إلى العلامات وظيفية fluorescently المسمى مثل البروتينات والأجسام المضادة قد زاد بشكل كبير من فهمنا للتتالي النقيلي. وقد مكن ذلك التصور المباشر وتقدير من وحيدة الخلية والمعلمات الفرعية الخلوية في الخلايا السرطانية...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This research was supported by NIH-CA100324, Einstein National Cancer Institute's cancer center support grant P30CA013330, R01CA172451 to JWP and the Integrated Imaging Program. This technology was developed in the Gruss-Lipper Biophotonics Center and the Integrated Imaging Program at the Albert Einstein College of Medicine. We acknowledge the support of these Centers in this work. The authors thank Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon and Anthony Leggiadro of the Einstein machine shop for their skilled and timely craftsmanship, the laboratory of Matthew Krummel for generously sharing their window design drawings, Kevin Elicieri and Jeremy Bredfeldt for their expertise in microscopy and their amplifier recommendations and Allison Harney and Bojana Gligorijevic for informative discussions.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Nickel-Plated Brass Vacuum Regulator 1/8 NPT Female, w/ Gauge, 0 - 20" Hg VacuumMcMaster Carr4172K12 Vacuum Regulator
Brass Barbed Hose Fitting Adapter for 1/4" Hose ID X 1/8" NPTF Male PipeMcMaster Carr5346K13Vacuum Regulator Hose Adapter
Pyrex Brand Filtering Flasks with Tubulation; Neck tooled for rubber stopper No. 4; Capacity: 50 mlCorning Life Sciences Glass5360-50Vacuum Flask
Round Glass Coverslips Thickness #1.5, 0.16 - 0.19 mm 10 mm dia. Ted Pella, Inc.260368Cover slips
Exel International Disposable Safelet I.V. Catheters; 22 g x 1 in. Exel International26746Tracheal Catheter
PERMA-HAND Black Braided Silk Sutures, ETHICON LIGAPAK Dispensing Reel Size 2-0VWR95056-992String
Liquid Super Glue, Clear, 0.14 ozHendel Corp.LOC1647358Cyano-acrylate Glue
Tetramethylrhodamine isothiocyanate–DextranSigma-AldrichT1287-500MG155 kD Dextran
Laboratory Clear Tygon PVC Tubing, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Wall Thickness, 25 ft. LengthMcMaster Carr5155T12Thin Tubing & Tubing for Luer
Crack-Resistant Polyethylene Tubing, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" Wall Thickness, White, 50 ft. Length McMaster Carr5181K24 Thick Tubing
Depillatory LotionNair-
Micro Medical Tubing 95 Durometer LDPEScientific Commodities Inc.BB31695-PE/1Tubing for tail vein catheter
30 G x 1 in. BD PrecisionGlide NeedleBD305128Needles for tail vein catheter
Puritan Nonsterile Cotton-Tipped Swabs Fisher Scientific867WCNOGLUE
Clear Polycarbonate Barbed Tube Fitting, Reducing Straight for 3/32" x 1/16" Tube IDMcMaster Carr5117k51Connectors between tubes
One-Hole Rubber StoppersFisher Scientific14-135FStopper for Vacuum Flask
SHARP Precision Barrier Tips, For P-100, 100 µlDenville Scientific Inc.P1125Pipette Tip
Laboratory tapeFisher Scientific159015R
PuralubeHenry Schein Animal Health008897Opthalmic Ointment
Gemini Cautery KitHarvard Apparatus726067Cautery Pen
Graefe Micro Dissecting Forceps; Serrated; Slight Curve; 0.8 mm Tip Width; 4" LengthRoboz SurgicalRS-5135 Forceps
Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mmRoboz SurgicalRS-5912Sharp Scissors
Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/BluntRoboz SurgicalRS-5980Blunt Scissors
WipesFisher Scientific06-666-A Harness
PhysioSuite SystemKent ScientificPhysioSuiteVitals Monitor
1 ml Syringe, Tuberculin Slip TipBD309659Syringe
Cyano acrylateStaplesLOC1647358Cover Slip Adhesive
Petroleum JellyFisher Scientific19-086291Water Barrier
Adapter Luer Cannulla 1.5 - 2.2 mmHarvard Apparatus734118Catheter Connector
PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeterKent ScientificPulse Oximeter
Isoethesia (isoflurane)Henry Schein Animal Health50033250 ml
OxygenTechAirOX TM
1x PBSLife Technologies10010-023
PVC Ball Valve, Push to Connect, 1/4 InGrainger3CGJ7Vacuum Valve
Small Animal VentilatorHarvard Apparatus683Alternative is available from Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Reduced Serum MediumThermoFisher Scientific31985062 
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermoFisher Scientific11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J MiceJackson Laboratory026051 
Multiphoton MicroscopeOlympusFluoview FV1000Alternative to custom built scope
Environmental EnclosurePrecision PlasticsChamber for FV1000Alternative to custom built enclosure
Phosphate Buffered SalineThermoFisher Scientific14190136
Laser Power MeterCoherentFieldMaxIITOP
Laser Power Meter HeadCoherentPM10
pcDNA3-Clover Fluorescent Protein VectorAddgene40259
G418 Sulfate Selective AntibioticThermoFisher Scientific10131027
MoFlo Fluorescent-Activate Cell Sorter Beckman CoulterXDP
Trypsin EDTA 1xCorning25-052-Cl
40 µm MeshFalcon352235
96 Well PlateCostar3599
60 mm Culture DishCorning430196
10 cm Culture DishCorning353003
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA4503
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1xCorning21-031-CV
C57BL/6J MouseJackson Laboratory000664 
Kim WipesFisher Scientific06-666-A 

References

  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  2. Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
  3. Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
  4. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  5. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  6. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).
  7. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
  9. Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
  10. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  11. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  12. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  13. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
  14. Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124(2012).
  15. Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483(2015).
  16. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112(2014).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  18. Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
  19. Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
  20. St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
  21. Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562(2009).
  23. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  24. Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
  25. Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
  26. De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
  27. Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
  28. Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
  29. Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
  30. Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
  31. Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  32. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
  33. Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
  34. Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  37. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
  38. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
  39. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  40. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  41. Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. , Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
  42. Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
  43. Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
  44. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  45. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  46. Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042(2016).
  47. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318(2013).
  48. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  49. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7(2013).
  50. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294(2013).
  51. Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

116 multiphoton

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved