فحص مضان القائم من الفوسفوليبيدية Scramblase آخر

Summary

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Abstract

Scramblases نقل من الدهون الفوسفاتية عبر طبقة ثنائية الغشاء الاتجاهين بطريقة مستقلة اعبي التنس المحترفين. وscramblase الأولى أن يكون تحديد وكيميائيا التحقق وأوبسين، في صميم بروتيني من رودوبسين مبصرة. رودوبسين هو مستقبلات البروتين يقترن-G المحلية في قضيب مبصرة الأغشية القرص من شبكية العين حيث أنها مسؤولة عن إدراك الضوء. النشاط scramblase رودوبسين للا تعتمد على يجند لها 11- رابطة الدول المستقلة -retinal، أي أوبسين صميم بروتيني كما تنشط باعتباره scramblase. على الرغم من التأسيسية وينظم فوسفورية الهرولة تلعب دورا هاما في علم وظائف الأعضاء الخلية، تم التعرف على عدد قليل فقط scramblases فوسفورية حتى الآن إلى جانب أوبسين. نحن هنا وصف مقايسة على أساس مضان النشاط scramblase أوبسين ل. وأعيد أوبسين في الجسيمات الشحمية unilamellar كبيرة تتألف من فسفاتيديل، phosphatidylglycerol وكمية ضئيلة من الفلورسنت وصفت دبي الوطني PC (1-صalmitoyl-2- {6- [7-نيترو-2-1،3-benzoxadiazole-4-YL) الأمينية] hexanoyl} - SN -glycero-3-phosphocholine). يتم تحديد النشاط Scramblase من خلال قياس مدى جزيئات دبي الوطني-PC الموجود في النشرة الداخلية للحويصلة قادرة على الوصول إلى النشرة الخارجية حيث يتم التخلص مضان من كيميائيا من قبل وكيل الحد الذي لا يمكن عبور الغشاء. الطرق وصفنا لها تطبيق عموما، ويمكن استخدامها لتحديد وتوصيف الأنشطة scramblase للبروتينات غشاء الأخرى.

Introduction

رودوبسين مستقبلة للضوء، وهو نموذج أولي G البروتين يقترن مستقبلات (مراجعة على سبيل المثال، في اشارة ^1)، هو أول scramblase فوسفورية الكشف عن هويته والتحقق منها كيميائيا ^2،3. Scramblases هي النقل فوسفورية التي تزيد من بطء في جوهرها من transbilayer حركة فوسفورية على الناحية الفسيولوجية المستويات الملائمة في ثنائي الاتجاه، بطريقة ATP مستقلة ^4-6. أمثلة من تصرفاتهم يمكن العثور عليها في الشبكة الإندوبلازمية وغشاء هيولي البكتيرية التي تحتاج إلى الهرولة التأسيسي للتوازن الغشاء والنمو، فضلا عن مجموعة متنوعة من مسارات بالغليكوزيل ^5. فوسفورية ينظم الهرولة هناك حاجة لفضح فسفاتيديل (PS) على سطح الخلايا أفكارك حيث أنه بمثابة "أكل لي" -signal لالضامة ⁷ و يوفر سطح محفز التخثر على الصفائح الدموية تنشيط لتحفيز إنتاج بروتين عاملق اللازمة لتخثر الدم. في مبصرة الأغشية القرص، وقد اقترح النشاط الهرولة رودوبسين لمواجهة الخلل فوسفورية بين اثنين من منشورات غشاء من طبقة ثنائية التي يتم إنشاؤها من قبل لاعبي التنس المحترفين التي تعتمد، الدهن أحادي الاتجاه flippase ABCA4 ^{4،8،9 10-12.}

وعلى الرغم من أهمية الفسيولوجية للscramblases، وظلت هويتهم بعيد المنال حتى أفيد رودوبسين باعتباره scramblase في أقراص مستقبلة للضوء ^2، تم تحديد أعضاء الأسرة البروتين TMEM16 كما كا ²⁺ scramblases معتمد على الحاجة للتعرض PS في غشاء البلازما (مراجعة في إشارة ^13)، واقترح البروتين البكتيري FtsW باعتباره الدهن الثاني scramblase المطلوبة لتخليق ببتيدوغليكان ^14. واستندت هذه الاكتشافات على إعادة تشكيل تنقية البروتينات في الجسيمات الشحمية ومظاهرة من النشاط scramblase في proteoliposomes الناتجة باستخدام describ منهجيةإد هنا. scramblases إمكانات أخرى ^15-21 - البروتينات MurJ وAMJ المتورطين في التركيب الحيوي ببتيدوغليكان، WzxE والبروتينات ذات الصلة المتورطين في الهرولة السلائف-O مستضد، البروتين منتدى مادهيسي اللازمة لنقل من phosphatidylglycerol aminoacylated عبر غشاء هيولي البكتيرية، وأفراد الأسرة Xkr8 أنه قد أقترح لفضح PS على سطح الخلايا أفكارك - لا يزال يتعين اختبار كيميائيا. هذا يسلط الضوء على أهمية فحص قوية لتحديد وتوصيف النشاط scramblase.

هنا، نحن تصف إعادة تشكيل أوبسين النقي، وصميم بروتيني من رودوبسين مبصرة، إلى الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs)، وتحليل لاحقة من النشاط scramblase في proteoliposomes الناتجة باستخدام مقايسة على أساس مضان. وهناك العديد من البروتوكولات وصفها جيدا المتاحة في الأدب للتعبير مغاير وتنقية أوبسين، وبالتالي فإننا لن وصف في هذا البروتوكول. نستخدم البروتوكولات المذكورة في غورين وآخرون. ⁽³⁾ الذي ينتج العلم الموسومة، أوبسين بالحرارة بنحو 100 نانوغرام / ميكرولتر في 0.1٪ (ث / ت) dodecylmaltoside (DDM).

ويتحقق إعادة بواسطة علاج LUVs مع المنظفات كافية بحيث تنتفخ ولكن لا تذوب. في ظل هذه الظروف، وهو بروتين الغشاء - المتوفرة في شكل المذيلات البروتين المنظفات - والاندماج في الجسيمات الشحمية وتصبح أعاد في غشاء الحويصلية على إزالة المنظفات، مما أدى إلى proteoliposomes. لإعادة أوبسين (تم الحصول عليها من البروتين النقي في 0.1٪ (ث / ت) DDM)، يتم إعداد LUVs من خليط من POPC (1-بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3-phosphocholine) وPOPG (1- بالميتويل-2-oleoyl- التعطيل -glycero-3- [الفوسفات-rac- (1-الجلسرين)]) ومشبعة DDM قبل إضافة أوبسين وبنك دبي الوطني-PC. ثم تتم إزالة المنظفات عن طريق التعامل مع عينة مع الخرز البوليسترين.

معشوقة = "jove_content"> ويظهر المبدأ الأساس لفحص القائم على مضان في الشكل 1B. وأعيد LUVs بشكل متناظر مع كمية ضئيلة من بنك دبي الوطني-PC أو غيرها المسمى دبي الوطني، مراسل فوسفورية فلوري (الشكل 1A). على إضافة dithionite، يتم تخفيض على غشاء impermeant dianion، يتم تقديم جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الخارجية للLUVs غير الفلورسنت كما نيترو-مجموعة بنك دبي الوطني إلى الأمينية مجموعة غير الفلورسنت. كما لا الجزيئات دبي الوطني-PC ولا dithionite قادرة على اجتياز الغشاء على المدى الزمني للتجربة (<10 دقيقة)، وهذا يؤدي إلى تخفيض 50٪ من إشارة الفلورسنت. ومع ذلك، إذا تم إعادة تشكيل الجسيمات الشحمية مع scramblase، جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الداخلية يمكن أن يتبارى بسرعة إلى الخارج حيث تقوم بتقليل. وهذا يؤدي إلى فقدان تام للمضان في حالة مثالية (الشكل 1C).

وفاق / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. الشكل 1: تمثيل تخطيطي لفحص النشاط scramblase يستخدم فحص والمسمى دبي الوطني الفلورسنت مراسل الدهنية؛ ويرد دبي الوطني-PC (A). وأعيد الحويصلات unilamellar كبيرة مع كمية ضئيلة من بنك دبي الوطني-PC. إعادة تنتج الحويصلات متماثل، مع بنك دبي الوطني-PC موزعة بالتساوي في منشورات الخارجي والداخلي. Dithionite (S ₂ O ₄ ^2-) يقلل كيميائيا نيترو مجموعة بنك دبي الوطني إلى الأمينية مجموعة غير الفلورسنت. علاج الجسيمات الشحمية خالية من البروتين مع dithionite (ب، أعلى) يؤدي إلى تخفيض 50٪ من مضان فقط منذ جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الخارجي يتم تخفيض: تم شحن dithionite سلبا ولا يمكن عبور الغشاء لتتفاعل مع جزيئات دبي الوطني-PC في النشرة الداخلية. العلاج Dithionite من proteoliposomes التي تحتوي على أوبسين (B، أسفل)، أي proteoliposomes-scramblase نشط، والنتائج في فقدان 100٪ من وluorescence كما أوبسين يسهل حركة بنك دبي الوطني-PC بين الداخلية والنشرة الخارجية. (C) ويظهر آثار مضان المثالية الحصول على علاج الجسيمات الشحمية خالية من البروتين وproteoliposomes التي تحتوي على أوبسين مع dithionite. معدل فقدان مضان هو نفسه في الحالتين يشير إلى أن تخفيض الكيميائية دبي الوطني dithionite هو معدل الحد، والتي تسعى جاهدة يحدث بمعدل يساوي أو أكبر من معدل التفاعل الكيميائي. وتظهر آثار الحصول عليها من تجربة الفعلية في الشكل (3). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الطرق وصفنا يمكن استخدامها لإعادة بناء ومقايسة تنقية البروتينات الأخرى، فضلا عن خليط من البروتينات الغشاء تم الحصول عليها، على سبيل المثال، عن طريق استخراج microsomes ل مع المنظفات ^22.

Protocol

1. إعداد الليبوزومات وProteoliposomes

1. الحويصلية تشكيل
   1. باستخدام حقنة زجاجية، إضافة 1،435 ميكرولتر POPC (25 ملغ / مل، في الكلوروفورم) و 160 POPG ميكرولتر (25 ملغ / مل، في الكلوروفورم) إلى قارورة أسفل جولة للحصول على 52.5 مكرومول الدهون في نسبة المولي من POPC: POPG = 9: 1.
   2. تجفيف الدهون لمدة 30 دقيقة باستخدام المبخر الدوار في سرعة دوران 145 دورة في الدقيقة (لا حاجة لحمام الماء لهذا الحجم من المذيبات)، ثم نقل القارورة إلى مجفف فراغ لا يقل عن 3 ساعة، أو بين عشية وضحاها، في درجة حرارة الغرفة (RT).
   3. هيدرات الفيلم الدهون المجففة مع 10 مل من 50 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 7.4، 100 مم كلوريد الصوديوم (المشار إليه فيما عازلة أ) من قبل يحوم بلطف القارورة حتى متجانسة، والنتائج تعليق العكرة.
      ملاحظة: تركيز الدهون في هذه المرحلة ومن المتوقع أن يكون 5.25 ملي كما لا خسائر ينبغي أن يكون حدث حتى الآن.
   4. يصوتن تعليق في حمام مائي لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع تردد سو 40 كيلو هرتز. فإن الحل يبدو أكثر وضوحا إلى حد ما.
   5. باستخدام الطارد، تمرير تعليق 10 مرات من خلال الغشاء مع حجم المسام 400 نانومتر، تليها المرحلة الثانية من قذف مع 4 تمريرات من خلال الغشاء مع حجم المسام 200 نانومتر.
      ملاحظة: متوسط ​​قطر LUVs الناتج هو ~ 175 نانومتر. إذا لزم الأمر، وحجم وتجانس LUVs يمكن فحصها من قبل الحيوي تشتت الضوء وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   6. قياس تركيز فوسفورية من تعليق LUV كما هو موضح في القسم 1.2).
      ملاحظة: نظرا للخسائر خلال البثق، وتركز عادة حوالي 3.6 ملي.
   7. تخزين LUVs في 4 درجة مئوية لمدة حوالي 2 أسابيع إن لم يكن استخدامها على الفور.
2. الكمي فوسفورية
   ملاحظة: لتحديد تركيز فوسفورية من تعليق LUV المستخدمة لإعادة تشكيل، وكذلك من proteoliposomes التي يتم إنشاؤها في نهاية المطاف، قسامة من العينة subjeالإدارة التنفيذية للأكسدة حمض البيركلوريك. هذا الإجراء ينهار الدهون الفوسفاتية للافراج عن الفوسفات غير العضوية التي يتم بعد ذلك كميا عن طريق فحص اللونية في المقارنة مع المعايير ^23.
   1. يعد حل 40 ملي الأسهم من فوسفات الصوديوم (نا ₂ هبو ₄₎ في الماء المقطر منزوع الأيونات.
   2. تمييع الحل الأسهم مع الماء المقطر منزوع الأيونات للحصول على 4 ملم و 0.4 ملم الحلول التي ستكون بمثابة معايير المعايرة العمل.
   3. باستخدام حلول العمل، وإعداد المعايير في 13 أنابيب × 100 مم ² كوب تتراوح 0-80 نانومول فوسفات الصوديوم في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر.
   4. يستغرق 10 ميكرولتر كل من العينات LUV وproteoliposome أن يكون كميا وتمييع مع 40 ميكرولتر من ده ₂ O في 13 أنابيب × 100 مم ² الزجاج.
      ملاحظة: كما في تركيز الدهون من LUVs وproteoliposomes هو في حدود 2.5-5 ميكرومتر، 10 ميكرولتر من العينة يجب أن يحتوي على 25-50 نانومول الدهون الفوسفور.
   5. إضافة حمض 300 ميكرولتر البيركلوريك إلى كل من المعايير والعينات والحرارة لمدة 1 ساعة على 145 درجة مئوية في كتلة التدفئة. وضع الرخام على الأنابيب لمنع التبخر.
   6. السماح للأنابيب بارد لدرجة حرارة الغرفة وإضافة 1 مل من ده ₂ O.
   7. إضافة 400 ميكرولتر من كل الطازجة 12 غ / كربونات الأمونيوم L و 50 جرام / لتر أسكوربات الصوديوم ودوامة لخلط.
   8. الحرارة لمدة 10 دقيقة في 100 درجة مئوية مع الرخام على أعلى الأنابيب. إزالة الأنابيب من كتلة التدفئة والسماح لهم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
   9. قياس الامتصاصية من العينات ضد فارغة (عينة القياسية التي تحتوي على 0 نانومول فوسفات الصوديوم) مع مطياف عند طول موجي 797 نانومتر.
   10. تحديد محتوى الفوسفات من عينات ضد منحنى المعايرة القياسية.
3. إعادة تشكيل أوبسين
   ملاحظة: من الضروري تحديد شروط تورم المثلى لإعادة وهذه تعتمد على طبيعة المنظفات، وكذلككما تكوين الدهون وتركيز LUVs. كما LUVs تغيير خصائص تشتت الضوء على تورم عملية يمكن رصدها من خلال قياس الامتصاصية (الشكل 2) على النحو الذي استعرضه ريغو وليفي ²⁴ و Geertsma وآخرون. ^25.
   1. ماصة 800 ميكرولتر من LUVs (من القسم 1.1؛ والانتعاش الدهون بعد قذف هو 70٪، وتركيز المتوقع من LUVs 3.6 ملي فوسفورية) في أنبوب microfuge 2 مل.
   2. إضافة 5.3 ميكرولتر من العازلة وو 34.7 ميكرولتر من 10٪ (ث / ت) DDM حل في المخزن A.
   3. احتضان لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة مع نهاية الإفراط في نهاية الاختلاط.
   4. وفي الوقت نفسه إعداد الخرز البوليسترين:
      1. استخدام 400 ملغ من الخرز لكل عينة ووزن لهم في كوب زجاجي.
      2. غسلها مرتين مع الميثانول، ثلاث مرات بالماء ومرة ​​واحدة مع العازلة A. للحصول على كل استعمال خطوة الغسيل 5 مل من السائل ويحرك ببطء لمدة 10 دقيقة.
         ملاحظة: من المستحسن لإعداد البوليسترينحبات لعدة عينات في وقت واحد، على سبيل المثال، في وزن 6 غرام من الخرز ويغسل مع 75 مل من السائل. حبات الزائدة يمكن تخزينها في الثلاجة لعدة أيام.
   5. خلال 30 دقيقة الماضي من زعزعة الاستقرار حويصلة تجفيف فوسفورية المسمى بنك دبي الوطني في أنبوب المسمار سقف زجاجية ( "إعادة أنبوب زجاجي '): لكل عينة، 9.5 ميكرولتر من بنك دبي الوطني-PC (1 ملغ / مل في الكلوروفورم، مما أسفر عن 0.4 مول٪ من إجمالي الدهون الفوسفاتية) يتم تجفيفها تحت تيار من النيتروجين في أنبوب زجاجي وحلت في وقت لاحق في 45 ميكرولتر من 0.1٪ (ث / ت) DDM في المخزن A.
   6. بعد 3 ساعات من زعزعة الاستقرار الحويصلة تضاف فوسفورية المنحل-دبي الوطني المسمى، البروتين DDM-بالفاعلات وعازلة بحيث الحجم النهائي من 1 مل يحتوي على 0.36٪ (ث / ت)، أي 7 ملم، DDM.
      1. وهكذا، لتوليد الجسيمات الشحمية خالية من البروتين (المستخدمة كعينة مراقبة) إضافة 45 ميكرولتر من بنك دبي الوطني-PC (المنحلة في 0.1٪ DDM)، 60 ميكرولتر من 0.1٪ DDM و 55 ميكرولتر من العازلة A؛ لproteoliposomes إضافة للامتحانسبيل، 40 ميكرولتر من البروتين (من محلول المخزون نموذجي من ~ 110 نانوغرام / ميكرولتر) في 0.1٪ DDM، 45 ميكرولتر من بنك دبي الوطني-PC (حل في 0.1٪ DDM)، و 20 ميكرولتر من 0.1٪ DDM و 55 ميكرولتر من العازلة لل .
         ملاحظة: ترتيب بالإضافة يجب على النحو المبين.
   7. خلط العينة لانهاء ساعة إضافية خلال نهاية في درجة حرارة الغرفة.
   8. إضافة 80 ملغ من الخرز البوليسترين المعدة واحتضان العينة مع نهاية الإفراط في نهاية خلط لمدة 1 ساعة على RT.
   9. التالي إضافة 160 ملغ إضافي من الخرز البوليسترين واحتضان مع نهاية الإفراط في نهاية خلط ل2 ساعة إضافية في RT.
   10. نقل العينة (ترك الخرز البوليسترين قضى خلف) إلى أنبوب زجاجي المسمار الحد الأقصى تحتوي على 160 ملغ من الخرز البوليسترين الطازجة وتخلط بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
       ملاحظة: أسهل طريقة لنقل العينة وتجنب امتصاص الخرز هو استخدام ماصة باستير أن يتم الضغط على الجزء السفلي من أنبوب زجاجي مع ضغط إيجابي يذكر. مرة واحدة غيض من ماصة هو راسخ فيالجزء السفلي من الأنبوب، ثم عينة يمكن سحب بسهولة دون تدخل من الخرز.
   11. في صباح اليوم التالي، ونقل العينة إلى أنبوب microfuge دون تحمل اكثر من الخرز ومكان على الجليد تمهيدا لفحص النشاط scramblase.

2. Scramblase آخر الفحص

ملاحظة: كثافة مضان من الجسيمات الشحمية أو proteoliposomes المخفف مع العازلة ويتم رصد مرور الوقت على إضافة dithionite في مطياف مضان. للحصول على كثافة بدءا مستقرة، يتم تسجيل مضان لا يقل عن 50 ثانية (أو حتى يتم التوصل إلى إشارة مستقرة) قبل أن يضيف dithionite على عينة أثار باستمرار ومن ثم يتم متابعتهم لمدة لا يقل عن 500 ثانية بعد إضافة dithionite.

1. إضافة 1950 ميكرولتر من العازلة ألف إلى كفيت بلاستيكية تحتوي على ميني ضجة بار.
2. إضافة 50 ميكرولتر من PROTEO استعداد (الجسيمات الشحمية)، والسماح للعينة يوازن في الطيف مضانمتر مع التحريك المستمر لعدة ثوان.
3. وفي الوقت نفسه يعد حل من 1 M dithionite في 0.5 M غير مصقول تريس (على سبيل المثال، لعينتين تزن من 20 ملغ من dithionite في أنبوب microfuge وتذوب في 114 ميكرولتر الجليد الباردة 0.5 M تريس مباشرة قبل الاستخدام والحفاظ على الجليد لالمقبل عينة).
   ملاحظة: يجب أن يكون مستعدا الحل dithionite الطازجة ولا ينبغي أن تستخدم أكثر من 20 دقيقة بعد الإعداد؛ إذا العديد من القياسات ليكون، aliquots من dithionite يمكن أن يكون وزنه في وقت مبكر وحل الحق قبل الاستخدام.
4. بدء رصد مضان (الإثارة 470 نانومتر، وانبعاث 530 نانومتر، شق العرض 0.5 نانومتر).
5. إضافة 40 ميكرولتر من الحل dithionite 1 م إلى كفيت 50 ثانية بعد بدء مضان تسجيل (استخدام الحاجز في غطاء غرفة كفيت إن أمكن) والاستمرار في تسجيل مضان ل400-600 ثانية أخرى.
6. تحليل البيانات كما هو موضح في القسم 3.

3.تحليل البيانات

1. حركية الجهاد
   1. تميز أثر مضان من كل عينة التي حصل عليها النشاط فحص scramblase من خلال تحديد مضان الأولي، F _ط، قبل إضافة dithionite، ومضان نقطة النهاية، F، وصلت بعد> 400 ثانية. يتم تحديد F _ط لكل عينة حيث بلغت قيمة متوسط ​​مضان لفترة 30 ثانية قبل إضافة dithionite.
   2. تحديد البيانات نقطة النهاية المقابلة لمدى انخفاض مضان، R = 100 • F / F _ط. نحن نستخدم المصطلحات R _L لالجسيمات الشحمية خالية من البروتين وR _P لproteoliposomes التي تحتوي على أوبسين.
2. تحديد الوزن الجزيئي للوظيفيا المعاد Scramblase
   1. تحويل البيانات للحد من مضان وفقا للمعادلة التالية:
      ص (≥1 scramblase) = (R _P - R _L) / (R _ماكس - R _L) (المعادلة 1)
      ملاحظة: أين R _{الحد الأقصى} هو الحد الأقصى للتخفيض التي يتم الحصول عليها عند إعادة تشكيل ما يكفي من البروتين مثل هذا أن جميع الحويصلات في العينة تمتلك scramblase وظيفي واحد على الأقل، و p هو احتمال أن حويصلة خاصة في عينة تشكيلها هو 'scramblase نشط، أي أنها تمتلك scramblase وظيفي واحد على الأقل. قيمة R _L هو عادة 45٪ ³ في حين R _{الحد الأقصى} هو عادة 82.5٪ ^3، بدلا من المتوقع 100٪ (يمكن تجريبيا لproteoliposomes أوبسين مع طاعون المجترات الصغيرة من> 1 ملغ / مليمول R _ماكس). كما R _ماكس <100٪ فمن المفترض أن شبه السكان من الحويصلات هو صهر لإعادة. لR _{الحد الأقصى} = 82.5٪، ونسبة من الحويصلات التي لا يستطيع قبول البروتين هو 0.35.
   2. وصف العلاقة بين ص (≥1 scramblase) وطاعون المجترات الصغيرة (ملغ من البروتين / مليمول فوسفورية) من خلال إحصاءات بواسون على النحو التالي:
      ص (≥1 scramblase) = 1 - ه -m = 1 - إكسب (-PPR / α) (المعادلة 2)
      ملاحظة: أين م = عدد scramblases في الحويصلة وα = أحادية الأسي مناسبا ثابت في وحدات ملغ فوسفورية بروتين / ملمول.
   3. كما لا يسهم جزء من الحويصلات إلى الهرولة حتى في طاعون المجترات الصغيرة عالية (انظر المناقشة)، تعديل المعادلة إلى:
      ص (≥1 scramblase) = 1 - إكسب (-PPR * / α) (المعادلة 3)
      ملاحظة: أين طاعون المجترات الصغيرة * = طاعون المجترات الصغيرة / (1- و)، حيث f هو السكان الحرارية من الحويصلات، أو في هذه الحالة، طاعون المجترات الصغيرة * = طاعون المجترات الصغيرة / 0.65 (المعادلة 4).
      ملاحظة: يتم تحديد α ثابت مناسبا من المناسب على الرسم البياني للص (≥1 scramblase) مقابل طاعون المجترات الصغيرة * مع وظيفة أحادية الأسي. إذا أوبسين (الوزن الجزيئي 41.7 كيلو دالتون) reconstitutes وظيفيا إلى الحويصلات 175 نانومتر القطر (كل حويصلة ديها 280،000 الفوسفورية ²⁶⁾ كما مونومر، α = 0.187 ملغ مليمول ^-1. إذا dimerizes أوبسين قبل إعادة ³ لانتاج الحويصلات scramblase النشط، ثم α= 0.37 ملغ مليمول ^-1. إذا كانت طاعون المجترات الصغيرة بدلا من طاعون المجترات الصغيرة * لاستخدامها في التحليل، ثم القيم ألفا المقابلة ستكون 0.122 و 0.244 ملغ مليمول ^-1. تفترض هذه القيم المتوقعة للα أن جميع الجزيئات أوبسين هي المختصة وظيفيا. ولو جزء بسيط من جزيئات غير أكفاء لتغيير معالم الدهون، ثم القيم المناظرة من α سيكون أكبر.

النتائج

وصفنا إعادة تشكيل أوبسين إلى LUVs لوصف النشاط scramblase وذلك باستخدام مقايسة على أساس مضان. نحن تحليل النتائج لوضع الحد الأدنى لمعدل فوسفورية بوساطة أوبسين الهرولة ولتحديد حالة بلازميدة قليلة القسيمات التي أوبسين reconstitutes وظيفيا إلى الحويصلات.

Discussion

فحص النشاط scramblase مكنتنا أصلا لتحديد ما أوبسين ديه فوسفورية النشاط scramblase ^2. يسمح فحص لنا أيضا لوصف النشاط scramblase أوبسين عن طريق اختبار خصوصية (كنا مجموعة متنوعة من الدهون مراسل المسمى دبي الوطني مثل بنك دبي الوطني فسفاتيديل إيثانولامين، وصفت مع بنك دبي الوطني على...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	840457C	POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Fluorimeter cuvettes	sigma	C0918-100EA	cuvettes
Spectrofluorometer	Photon Technology International, Inc.	fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85%	Sigma	157953-5G	dithionite
GraphPad Prism 5 software			Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 ml extruder	Northern Lipids, Inc.		Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110607	400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110606	200 nm membrane
sodium phosphate	Sigma	S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm	VWR Scientific	47729-572	glass tubes
Perchloric acid	Sigma	30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma	A-7302	ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma	A7631-25G	sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents	Bio Rad	1523920	polystyrene beads
2.0 ml Microtubes clear	VWR Scientific	10011-742	Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube	VWR Scientific	53283-800	Reconstitution glass tubes
Zetasizer	Malvern		DLS