JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، نحن تصف إعداد واستخدام مسبار على أساس النشاط (ARN14686، undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية) التي تسمح للكشف والقياس الكمي ل الشكل النشط من الانزيم proinflammatory N أميداز حمض -acylethanolamine (ناا)، سواء في المختبر والمجراة سابقا.

Abstract

على أساس النشاط التنميط البروتين (ABPP) هو وسيلة للتعرف على انزيم من الفائدة في بروتيوم معقدة من خلال استخدام مسبار الكيميائية التي تستهدف مواقع الإنزيم النشط. علامة مراسل أدخلت على التحقيق تسمح للكشف عن الإنزيم المسمى عن طريق المسح الضوئي في جل مضان، وصمة عار البروتين، المجهري مضان، أو السائل الطيف اللوني الشامل. هنا، نحن تصف إعداد واستخدام ARN14686 المجمع، تحقيقا على أساس النشاط بنقرة والكيمياء (CC-برنامج الجسر الأكاديمي) أن تعترف بشكل انتقائي الانزيم N أميداز حمض -acylethanolamine (ناا). ناا هو هيدرولاز السيستين الذي يعزز الالتهاب عن طريق إلغاء تنشيط مستقبلات الذاتية تنشيط ناشر-بيروكسية (PPAR) منبهات -alpha مثل palmitoylethanolamide (PEA) وoleoylethanolamide (أويا). ويتم تصنيع ناا باعتبارها proenzyme كامل طول الخاملة، التي يتم تفعيلها من خلال تحلل بروتيني ذاتي في درجة الحموضة الحامضية لليحلول. دراسات الترجمة حافي أظهرت أن ناا وأعرب في الغالب في الضامة وغيرها من الخلايا المشتقة الوحيدات، وكذلك في B-الخلايا الليمفاوية. نحن نقدم أمثلة على الكيفية التي يمكن أن تستخدم ARN14686 لكشف وتحديد نشط ناا فيفو السابقين في أنسجة القوارض لطخة البروتين والفحص المجهري مضان.

Introduction

يشيع استخدامها أساليب للتحقيق في أنماط التعبير، والتفاعلات، وظائف البروتينات، بما في ذلك منصات الطيف اللوني الشامل السائل لتحليل طلقات نارية 1،2، الخميرة أساليب اثنين هجينة 3،4، وفي فحوصات المختبر، تقتصر في أن تكون غير قادر على تقييم نشاط البروتينات في حالتها الأصلية. على أساس النشاط بروتين التنميط (ABPP) يمكن استخدامها لملء هذه الفجوة. في هذا النهج، جزيء صغير يسبر قادرة على ملزمة تساهميا إلى موقع نشط من انزيم من الفائدة مترافق إلى مجموعة المراسل أن يسمح للكشف عن الهدف. عن طريق النقر الكيمياء (CC)، لمراسل ويمكن دمجها في التحقيق أو يمكن إدخال بعد الاشتباك الهدف حدث 5،6. يتطلب الإجراء الأخير استخدام المجسات التي تحتوي على مجموعات كيميائية مناسبة، مثل آلكاين محطة أو أزيد، والتي يمكن تعديلها مع عدد من الكواشف مراسل عبر التفاعلات الحيوية متعامد يمثح باسم النحاس (I) -catalyzed Huisgen [3 + 2] cycloaddition 7-9 أو شتاودينغر ربط 10،11.

في الآونة الأخيرة، ونحن الكشف عن ARN14686 مركب مثل برنامج الجسر الأكاديمي الأول للفي التجارب المختبرية وكشف الجسم الحي من هيدرولاز السيستين، ناا 12. ناا يحفز التعطيل حلمهي من القوات المسلحة المشبعة وغير المشبعة الاحادية، بما في ذلك oleoylethanolamide (أويا) وpalmitoylethanolamide (PEA)، والتي هي محفزات الذاتية للالمضادة للالتهابات مستقبل نووي PPAR ألفا 13-15. وأعرب عن ناا في الغالب في الضامة وغيرها من الخلايا المشتقة الوحيدات، وكذلك في B-الخلايا الليمفاوية 14،16، مما يشير إلى دور في تنظيم الاستجابة المناعية الفطرية. يتم تصنيعه الانزيم في الشبكة الإندوبلازمية الخام في شكل غير نشط ويتم تنشيط في مقصورات الحمضية من الخلية بواسطة آلية autoproteolytic 17. الانقسام autoproteolytic يولد N السيستين -terminal الجديدة (C131 في الفئران والجرذان، C126 في البشر)، وهذا هو المسؤول النيوكليوفيل لFAE التحلل 18،19. تثبيط الدوائية النشاط ناا يغير FAE التوازن التوليف / تدهور لصالح زيادة مستويات الخلايا من القوات المسلحة 16،20،21. وقد ثبت عدة β-اكتون وβ لاكتام المشتقات لكبح النشاط ناا مع قوة عالية والانتقائية 16،22-26. هذه المثبطات تعمل من خلال S -acylation من السيستين الحفازة 16،27،28.

تم تصميم ARN14686 مركب على أساس التركيب الكيميائي للالنشطة للنظام، المستمدة سيرين β لاكتام ناا المانع، ARN726 (4 cyclohexylbutyl- N - [(S) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية) 16. تم استبدال مجموعة 4-بوتيل cyclohexyl من ARN726 مع سلسلة الأليفاتية المشبعة C9 تحمل علامة آلكاين محطة لتصريف CC لاحق مع علامة مراسل أزيد الحمل. لقد اخترنا لتصميم برنامج الجسر الأكاديمي من خطوتين لminimallذ تغيير هيكل السقالة الأصلية، وبالتالي الحفاظ على تقارب لجنة التحقيق لناا. وعلاوة على ذلك، وتجنب إدخال علامات ضخمة، يمكن لمثل هذا التحقيق أن يكون أكثر مناسبة لتلقي العلاج في الجسم الحي من برنامج الجسر الأكاديمي المباشر. ARN14686 يمنع ناا مع قوة عالية (hNAAA IC 50 = 6 نيوتن متر، rNAAA IC 50 = 13 نانومتر) من خلال تشكيل ناتج إضافة التساهمية مع السيستين الحفاز للانزيم 12. وأظهرت التجارب على الفئران الحية أن التحقيق هو انتقائية في التقاط أعرب ناا في الرئتين. وقد تم تحديد حمض سيراميداز، أميداز السيستين آخر يتقاسم الهوية 33-34٪ مع ناا، أيضا كهدف تقارب منخفضة عند استخدام تركيزات عالية من التحقيق (10 ميكرومتر في المختبر، 10 ملغ / مل في الوريد، والرابع) 12. وقد استخدمنا أيضا ARN14686 لدراسة وجود ناا فعال في أنسجة الفئران الملتهبة التالية إدارة مساعد الكامل فرويند (CFA) 29.

هنا، ونحن الخطوط العريضة لبروتوكول لpreparatiعلى من ARN14686 (الشكل 1) وتطبيقه على التحقيق في تفعيل ناا خارج الحي. وكمثال على ذلك، نحن تصف الإجراء التجريبي لتصور ناا في الكفوف الفئران بعد تناوله CFA. في هذه التجربة، يتم استخراج البروتينات من الأنسجة مخلب بعد حقن الرابع لجنة التحقيق، ويتعرض بروتيوم المسمى برنامج الجسر الأكاديمي إلى CC مع البيوتين أزيد. يتم إثراء عينات المعقدة البيروكسيديز باستخدام الخرز streptavidin، ويتم تنفيذ البقع البروتين. في تطبيق آخر، وصفنا توطين ناا نشط بواسطة المجهر مضان في الرئتين الماوس من الفئران المعالجة التحقيق. في هذه الحالة، يتم مقطوع الأنسجة ويتعرضون أقسام إلى CC لإضافة رودامين. ويتضح مخطط سير العمل في الشكل 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تحذير: يجب أن يتولى جميع التفاعلات الكيميائية في غطاء الدخان التهوية ومع استخدام معطف المختبر، والقفازات، ونظارات واقية. وينبغي أن يتم ردود الفعل أيضا في بيئة النيتروجين.

بيان الأخلاقي: اجراءاتنا التي تنطوي على الحيوانات تتم وفقا للوائح الإيطالية على حماية الحيوانات المستخدمة لأغراض تجريبية وأخرى علمية (DM 116192)، وأنظمة الجماعة الاقتصادية الأوروبية (الجريدة الرسمية للEC L 358/1 1986/12/18 ).

ملاحظة: توليف [(3 S) -2-oxoazetidin-3-YL] يوصف خلات الأمونيوم للعوائد على نطاق واسع (50 غ ن -Cbz-L-سيرين)، ولكن يمكن زيادتها بسهولة إلى أسفل.

1. توليف

ملاحظة: انظر الشكل رقم 1 لنظام رد فعل التوليف.

  1. إعداد 2-بيرويل كربونات Undec-10-ynyl وUndec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-الكربوكسيل
    1. في 50 مل قارورة جولة القاع، حل 350 ملغ من undec-10-YN-1-أول في 3.5 مل من ثنائي كلورو ميثان الجاف.
    2. إلى الحل في 1.1.1، إضافة 25 ملغ من 4 dimethylaminopyridine (DMAP) و 530 ملغ من 2 dipyridylcarbonate (DPC). يحرك الخليط في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 16 ساعة.
    3. إضافة 20 مل من ثنائي كلورو ميثان.
    4. نقل الخليط في قمع فصل. إضافة 15 مل من الماء، التخلص منه، والسماح للمرحلتين لفصل.
    5. فتح محبس، وجمع المرحلة العضوية (أسفل)، ثم قم بإغلاق محبس. إضافة 15 مل من المشبعة NaHCO 3 الحل. يهز قمع الفصل والسماح للمرحلتين منفصلتين. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
    6. تجفيف الطبقة العضوية مع نا 2 SO 4، من خلال تصفية القطن في قارورة ذهابا والقاع (الفارغة الأولى)، وتتبخر إلى جفاف تحت ضغط منخفض (المبخر الدوار).
    7. وزن القارورة والحصول على 600 ملغ من النفط الذي هو خليط من 2 بيرويل كربونات undec-10-ynyl وundec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-الكربوكسيل في نسبة 1.7: 1.
      1 H NMR (400 ميغاهيرتز، DMSO- د 6) عنصرا رئيسيا δ = 8.39 (اليوم، J = 5.0، 2.0، 1H)، 7.98 (الدفتيريا، J = 7.9، 2.0، 1H)، 7.40 (د د د، J = 7.2، 4.9، 0.9، 1H)، 7.30 (د، ي = 8.2، 1H)، 4.22 (ر، ي = 6.6، 2H)، 2.73 (ر، ي = 2.4، 1H)، 2،18-2،11 (م، 2H)، 1.76 - 1.62 (م، 2H)، 1،50-1،23 (م، 12H).
      1 H NMR (400 ميغاهيرتز، DMSO- د 6) عنصرا ضئيلا δ = 7.74 (اليوم، J = 7.2، 1.9، 1H)، 7.47 (اليوم، J = 6.7، 2.3، 1H)، 6.44 (د، ي = 9.4، 1H)، 6،30-6،25 (م، 1H)، 4.35 (ر، ي = 6.5، 2H)، 2.72 (ر، ي = 2.4، 1H)، 2،18-2،11 (م، 2H)، 1،77-1،60 (م، 2H )، 1،52-1،20 (م، 12H).
    8. استخدام النفط دون أي فصل آخر أو تنقية.
  2. إعداد [(3 S) -2-oxoazetidin-3-YL] الأمونيوم خلات
    1. إعداد البنزيل N - [(S) -1- (hydroxymethyl) -2 - [(4 methoxyphenyl) الأمينية] -2-oxoethYL] الكرباماتية.
      1. وفي 4-L قارورة جولة القاع، ويحل 141.5 غرام من ص -anisidine في 1.5 لتر من رباعي هيدرو الفوران و 0.5 لتر من ثنائي كلورو ميثان.
      2. تبريد حل ل0 درجة مئوية في حمام الثلج.
      3. إضافة 50.0 غرام من N -Cbz-L-سيرين و43،9 غرام من N - (3-dimethylaminopropyl) - N 'هيدروكلوريد -ethylcarbodiimide.
      4. يحرك الخليط مع شريط مغناطيسي في 0 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      5. إزالة الحل من حمام كريم واثارة مع شريط مغناطيسي على RT لمدة 16 ساعة.
      6. تتبخر المذيبات تحت ضغط منخفض (المبخر الدوار).
      7. إضافة 400 مل من 1: 1 الهكسان الحلقي / خلات الإيثيل، وإثارة مع ملعقة، وصب.
      8. كرر الخطوة 1.2.1.7 مرتين أخريين.
      9. حل بقايا غائر في 500 مل من خلات الإيثيل، ويغسل مع 400 مل من 0.1 حل M حمض الهيدروكلوريك (10 مرات)، مع 400 مل من المشبعة NaHCO 3 حل (2 مرات)، ومع 400 مل من محلول ملحي.
      10. تجفيف الطبقة العضوية معنا 2 SO 4، تصفية حل من خلال القطن في قارورة ذهابا والقاع (الفارغة الأولى)، وتتبخر إلى جفاف تحت ضغط منخفض (المبخر الدوار).
      11. وزن القارورة والحصول على 61.4 غرام من مادة صلبة بيضاء.
        1 H NMR (400 ميغاهيرتز، DMSO- د 6) δ = 9.86 (بكالوريوس، 1H)، 7.52 (د، 2H، J = 9.0 هرتز)، 7،42-7،25 (م، 6H)، 6،91-6،85 (م، 2H) ، 5.06 (د، 1H، J = 12.9 هرتز)، 5.02 (د، 1H، J = 12.9 هرتز)، 4.98 (ر، 1H، J = 5.6 هرتز)، 4،24-4،15 (م، 1H)، 3.72 (ق، 3H)، 3،70-3،57 (م، 2H).
    2. إعداد البنزيل N - [(S) -1- (4 methoxyphenyl) -2-أوكسو azetidin-3-YL] الكرباماتية.
      1. حل 58.6 غرام من N - [(S) -1- (hydroxymethyl) -2 - [(4 methoxyphenyl) الأمينية] -2-أوكسو إيثيل] الكرباماتية في 1.6 لتر من N، N -dimethylformamide.
      2. تبريد حل ل0 درجة مئوية مع حمام الثلج.
      3. إضافة 50.6 غرام من 1،1'-sulfonyldiimidazole واثارة مع شريط مغناطيسي لمدة 30 دقيقة.
      4. تبريد الحلإلى -20 درجة مئوية مع / حمام كلوريد الصوديوم الجليد وإضافة 10.2 غرام من هيدريد الصوديوم (60٪ في الزيوت المعدنية) جزء من الحكمة.
      5. يحرك الخليط عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، ثم يطفئ مع 2 مل من الميثانول و 1 لتر من الماء.
      6. فراغ تصفية الرواسب، ويغسل مع 200 مل من الماء، ويجف تحت فراغ.
      7. الحصول على 42.2 غرام من مادة صلبة بيضاء.
        1 H NMR (400 ميغاهيرتز، DMSO- د 6) δ = 8.08 (د، 1H، J = 8.5 هرتز)، 7،42-7،28 (م، 5H)، 7.30 (د، 2H، J = 8.9 هرتز)، 6.95 (د ، 2H، J = 8.9 هرتز)، 5.06 (ق، 2H)، 4.86 (د د د، 1H، J = 8.5، 5.6، 2.6 هرتز)، 3.90 (ر، 1H، J = 5.6 هرتز)، 3.73 (ق، 3H) ، 3.55 (اليوم، 1H، J = 5.6، 2.6 هرتز).
    3. إعداد البنزيل N - [(S) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية.
      1. تعليق 9.0 غرام من البنزيل N - [(S) -1- (4 methoxyphenyl) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية في 500 مل من الأسيتونتريل و 400 مل من الماء.
      2. تبريد حل ل0 درجة مئوية في حمام الثلج.
      3. إضافة 45.4 غرام من CERIج نترات الأمونيوم جزء من الحكمة أكثر من 45 دقيقة ويقلب مع شريط مغناطيسي في 0 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      4. إضافة 500 مل من المشبعة NaHCO 3 حل بحذر، ثم قم بإضافة 500 مل من خلات الإيثيل.
      5. تصفية الراسب ويغسل مع 200 مل من خلات الإيثيل.
      6. فصل حل ثنائي الطور وغسل الطبقة المائية مع 200 مل من خلات الإيثيل (3 مرات).
      7. تجفيف الطبقة العضوية مع نا 2 SO 4، إضافة 5 غرام من الفحم المنشط، فلتر من خلال لوحة من السيليكا دياتومي، وتتبخر إلى جفاف تحت ضغط منخفض (المبخر الدوار).
      8. إضافة ايثر واثارة مع ملعقة.
      9. تصفية الصلبة والحصول على 4.85 غرام من مادة صلبة من البيض.
        1 H NMR (400 ميغاهيرتز، DMSO- د 6) δ = 7.97 (د، 1H، J = 8.7 هرتز)، 7.94 (بكالوريوس، 1H)، 7.42- 7.30 (م، 5H)، 5.05 (ق، 2H)، 4.67 (د د د، 1H، J = 8.7، 5.4، 2.7 هرتز)، 3.40 (ر، 1H، J = 5.4 هرتز،)، 3.09 (اليوم، 1H، J = 5.4، 2.7 هرتز).
    4. إعداد [(S) -2-oxoazetidin-3-YL] -ammonium خلات.
      1. حل 0.93 مل من حمض الخليك في 245 مل من خلات الإيثيل. بمناسبة هذا بأنه "محاصرة حل."
      2. حل 3.28 غرام من benzyl- N - [(R) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية في 298 مل من الايثانول.
      3. إضافة 14.1 مل من cyclohexadiene و 3.27 غرام من 10٪ بلاديوم على الكربون.
      4. تحريك تعليق على RT لمدة 12 ساعة، ومن ثم تصفية من خلال لوحة قصيرة من الأرض دياتومي. صب السائل يبلغ حجمه مباشرة في حل محاصرة.
      5. تتبخر المذيب تحت ضغط منخفض (المبخر الدوار)، والحفاظ على درجة حرارة أقل من 35 درجة مئوية.
      6. يسحن في الحصول متينة مع رباعي هيدرو الفوران والحصول على 1.72 غرام من مادة صلبة بيضاء.
        1 H NMR (400 ميغاهيرتز، DMSO- د 6) δ = 7.68 (بكالوريوس، 1H)، 3.99 (د د د، 1H، J = 5.2، 2.4، 1.2 هرتز)، 3.32 (ر، 1H، J = 5.2 هرتز)، 2.79 (اليوم، 1H، J = 5.2، 2.4 هرتز)، 1.90 (ق، 3H).
  3. إعداد Undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-YL] الكرباماتية
    1. في 10 مل قارورة جولة القاع، ويحل 60 ملغ من [(3 S) -2-oxoazetidin-3-YL] خلات الأمونيوم في 2 مل من ثنائي كلورو ميثان الجاف.
    2. تبريد حل ل0 درجة مئوية في حمام الثلج وإضافة 81 ميكرولتر من N، N -diisopropylethylamine قطرة من الحكمة.
    3. حل 350 ملغ من الخليط الخام التي تحتوي على undec-10-ynyl 2-oxopyridine 1-الكربوكسيل في 2 مل من ثنائي كلورو ميثان الجافة، إضافة إلى الحل، ويقلب في RT لمدة 15 ساعة. تتبخر المذيب للجفاف تحت ضغط منخفض (المبخر الدوار).
    4. تنقية بواسطة اللوني العمود (هلام السيليكا) باستخدام جهاز كروماتوجرافيا العمود الآلي:
      1. امتصاص العينة على هلام السيليكا، تتوازن العمود مع الهكسان الحلقي، وتحميل العينة إلى خرطوشة.
      2. أزل مع خلات الهكسان الحلقي / اثيل من 100: 0-0: 100 وجمع القمم في أنابيب الاختبار.
      3. تتبخر المذيب من الكسور المقابلة لمجمع للجفاف تحت ضغط منخفض (المبخر الدوار) والحصول على 40 ملغ من مادة صلبة بيضاء.

2. إعداد الكواشف CC

  1. إعداد 5 ملي محلول المخزون من الجزيئات تاج أزيد
    1. حل 1.5 ملغ من أزيد-PEG3 فلور 545 في 0.5 مل من سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]). جعل قسامات في 0.5 مل أنابيب microcentrifuge ومخزن في -20 درجة مئوية.
    2. حل 1.1 ملغ من أزيد-PEG3-البيوتين في 0.5 مل من DMSO. جعل قسامات في 0.5 مل أنابيب microcentrifuge ومخزن في -20 درجة مئوية.
  2. إعداد 50 ملي حل الأوراق المالية من تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين (TCEP)
    1. حل 14.3 ملغ من TCEP في 1 مل من الماء، وجعلها جديدة في كل مرة.
  3. إعداد 50 ملي حل من كبريتات النحاس 4 · 5H 2 O
    1. في قارورة زجاجية، ويحل 120.48 ملغ من كبريتات النحاس 4 · 5H 2 O في 1 مل من الماء. تخزين على RT لمدة شهر واحد.
  4. إعداد 83.5 ملي محلول المخزون من تريس [(1-البنزيل-1H-1،2،3-triazol-4-YL) الميثيل] أمين (TBTA)
    1. في قارورة زجاجية، ويحل 8.85 ملغ من TBTA في 200 ميكرولتر من DMSO. تخزين على RT لمدة شهر واحد.
  5. إعداد 1.7 ملي العمل الحل من TBTA (مباشرة قبل الاستعمال)
    1. إضافة 20 ميكرولتر من 83.5 ملي TBTA إلى قارورة زجاجية وتمييع مع 180 مل من DMSO.
    2. إضافة 800 ميكرولتر من -Butanol ثالثي ودوامة.

3. تحليل التعبير ناا في باو أنسجة الفئران المعالجة CFA،

ملاحظة: استخدام الذكور سبراغ داولي الفئران، وزنها 175-200 غرام، وأداء جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية للاستخدام الأخلاقية للحيوانات. الفئران منزل في أقفاص التهوية على ضوء لمدة 12 ساعة / دورة الظلام ومنحهم حرية الوصول إلى الغذاء والماء. لبروتوكول CFوالعلاج، والرجوع إلى المقال الذي نشرته Bonezzi وآخرون. 29 استخدام الحيوانات بعد 7 أيام إدارة CFA.

  1. إدارة الوريد من ARN14686
    1. حل ARN14686 في السيارة (15٪ PEG و 15٪ من محلول ملحي توين). حساب تركيز المحلول وفقا لوزن الفئران (جرعة 3 ملغ / كغ، وحجم حقن 5 مل / كغ).
    2. المضي قدما في الرابع الحقن في ثلاث السذاجة وثلاثة الفئران المعالجة CFA. وضع كل فأر في جهاز ضبط النفس البلاستيك المناسب. ثم، ضع ذيل فأر في ماء دافئ لمدة 2-4 دقيقة للسماح توسع الأوعية، وحقن الرابع المجمع عن طريق الوريد الذيل.
    3. حقن ثلاثة الفئران (الساذج وCFA المعاملة) رابعا مع سيارة فقط.
  2. مخلب جمع وتشريح
    1. التضحية الفئران عن طريق CO 2 الاستنشاق 4 ساعات بعد التحقيق أو مركبة الادارة وجمع الكفوف بالقص 0.5 سم فوق مفصل الركبة باستخدام مشرط.
    2. بعناية إزالة الجلد عن طريق تشريح بمساعدة مقص وتشريح خارج الأنسجة الرخوة عن طريق كشط لهم من العظام. تجاهل العظام وجمع الأنسجة الرخوة في الكفوف. عينات تجميد المفاجئة في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.
  3. مخلب التجانس والليزوزومية إعداد البروتين
    ملاحظة: تجنب استخدام المنظفات الصناعية والمخازن التي تحتوي على الأمينات، لأنها يمكن أن تمنع رد فعل CC.
    1. الجمع بين الأنسجة مخلب من 3 الفئران (تم الحصول عليها كما هو موضح في القسم 3.2.1) والتجانس لهم في 4 مل من 320 ملي السكروز في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4) والكوكتيل مثبط البروتياز (انظر المادة / الكاشف الجدول). استخدام أداة تفريق عالية الأداء (انظر المادة / الكاشف الجدول).
    2. أجهزة الطرد المركزي لجناسة الأنسجة لمدة 20 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية. حفظ طاف.
    3. إضافة 2 مل من 320 ملي السكروز في برنامج تلفزيوني والكوكتيل مثبط البروتياز لبيليه الأنسجة والتجانس مرة أخرى.
    4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 1000 x ج في 4 درجات مئوية، وإضافة وطاف على واحد من الخطوة 3.3.2.
    5. أجهزة الطرد المركزي في supernatants المجمعة لمدة 30 دقيقة في 12000 x ج في 4 درجات مئوية.
    6. تزن بيليه و resuspend في مجلدين من برنامج تلفزيوني (أي 200 ميكرولتر لكل 100 ملغ من بيليه). نقل إلى أنبوب 1.5 مل جمع وتجميد في -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    7. ذوبان الجليد العينات وتجميد مرة أخرى لمدة 1 ساعة على -80 درجة مئوية.
    8. تكرار دورة تجميد / الذوبان مرتين أخريين.
      ملحوظة: تم تصميم هذه الخطوة لإذابة البروتين. تجميد بين عشية وضحاها إذا لزم الأمر.
    9. الطرد المركزي لمدة 1 ساعة على 100000 x ج في 4 درجات مئوية. جمع طاف، والذي يحتوي على البروتينات الليزوزومية القابلة للذوبان، وتجاهل بيليه. تخزين في -80 درجة مئوية أو الشروع فورا في تقدير البروتين.
    10. قياس محتوى البروتين باستخدام بروتين BCA فحص 30 مجموعة تجارية (انظر المادة / الكاشف الجدول )، بعد تعليمات الشركة الصانعة.
    11. تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  4. CC مع أزيد-PEG3-البيوتين
    ملاحظة: بروتوكول CC وتخصيب حبة streptavidin (الخطوات 3،4-3،6) يتم تعديل قليلا عن البروتوكول الذي نشرته سبيرس وCravatt 31.
    1. إعداد 500 ميكرولتر (1 ملغ / مل، في برنامج تلفزيوني) من البروتينات الليزوزومية من الفئران probe- والمعالجة المركبة (الفئران ساذجة وتعامل CFA).
    2. عينات Preclear مع 40 ميكرولتر من الطين 50٪ من الاغاروز streptavidin (يغسل ثلاث مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام) لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية. أجهزة الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 1000 x ج في 4 درجات مئوية، واتخاذ طاف.
    3. إضافة 11.3 ميكرولتر من مخزون 5 مم من أزيد-PEG3-البيوتين ودوامة.
    4. إضافة 11.3 ميكرولتر من الأسهم 50 ملم من الطازجة TCEP ودوامة.
    5. بريمكس 34 ميكرولتر من حل العاملة الطازجة من 1.7 ملي TBTA مع 11.3 ميكرولتر من 50 ملي كبريتات النحاس 4 · 5H 2 O الأسهم.
    6. إضافة 45.3 مل من محلول المخلوط TBTA / كبريتات النحاس 4 · 5H 2 O ودوامة.
    7. احتضان رد الفعل عند 25 درجة مئوية لمدة 2 ساعة (فترة حضانة أطول لا يؤثر على رد فعل). مراقبة هطول البروتين في هذه الخطوة. مزيج بعد الساعة الأولى من الحضانة.
  5. إزالة من الكواشف CC الزائدة
    1. عينات الطرد المركزي لمدة 4 دقائق في 6500 x ج في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف.
    2. إضافة 750 ميكرولتر من الميثانول الباردة و resuspend صوتنة (5 ثانية مع sonicator التحقيق).
    3. الطرد المركزي العينات لمدة 4 دقائق في 6500 x ج في 4 درجات مئوية، وإزالة طاف باستخدام المحاقن والإبر.
    4. كرر الخطوة 3.5.2 مرتين (غير مطلوب صوتنة).
    5. بعد غسل الماضي، إضافة 325 ميكرولتر من كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) 2.5٪ في برنامج تلفزيوني للبروتين بيليه ويصوتن 3X لمدة 5 ثوان.
    6. تسخين العينات لمدة 5 دقائق عند 65 درجة مئوية ويصوتن لربح.
    7. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 6500 x ج في RT وحفظ طاف.
    8. إضافة 1.4 مل من برنامج تلفزيوني لتخفيف تركيز SDS إلى 0.5٪. مخزن في -20 درجة مئوية أو الاستمرار في تخصيب streptavidin.
  6. Streptavidin التخصيب
    1. مع برنامج تلفزيوني، ليصبح حجم العينات التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.5.8 إلى 4.2 مل. إضافة 40 ميكرولتر من الطين 50٪ من الاغاروز streptavidin باستخدام تلميح نهاية قطع (يغسل ثلاث مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني قبل الاستخدام).
    2. احتضان لمدة 2 ساعة على RT مع دوران ثم الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1400 ز س.
    3. إزالة طاف دون تجفيف حبات بيليه واستخدام طاف المتبقية لنقل الخرز إلى 1 مل تدور العمود (انظر المادة / الكاشف الجدول).
    4. يغسل عن طريق الجاذبية مع 3X 1 مل من 1٪ SDS (في برنامج تلفزيوني)، 3X 1 مل من 6 M اليوريا (في برنامج تلفزيوني)، و4X 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    5. استخدام 2X 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لنقل الخرز لأنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 1400 x ج في RT. نضح بلطف طاف مع المحاقن والإبر.
    6. أزل البروتينات محددة الراتنج وذلك بإضافة 25 ميكرولتر من شطف العازلة (6 M اليوريا و 2 M ثيوريا، 2٪ SDS، و 6 البيوتين مم، وكلها في برنامج تلفزيوني) لمدة 15 دقيقة في RT تليها 15 دقيقة في 95 درجة مئوية (32).
  7. البروتين وصمة عار
    1. إضافة 5 ميكرولتر من العازلة 6X Laemmli (9 مل: 0.5 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 و 5 مل من 20٪ SDS، 5 ملغ برموفينول الأزرق، 3 مل الجلسرين، وH 2 O ما يصل إلى 9 مل)، وإضافة 5٪ β-المركابتويثانول مباشرة قبل الاستعمال. لفترة وجيزة الطرد المركزي العينات في 2000 x ج لتكوير الراتنج وتحميل 25 ميكرولتر من طاف الحصول عليها إلى هلام بولي أكريلاميد 4-12٪.
    2. أداء الكهربائي للهلام ونقل البروتين على غشاء النشاف وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 33.
    3. تشبع غشاء النشاف لمدة 1 ساعة مع 10 مل من عازلة تمنع (انظر المادة / الكاشف الجدول) تحتوي على 0.1٪ توين-20.تجنب استخدام الحليب، لأنها يمكن أن تزيد من الخلفية.
    4. يغسل الغشاء مع 10 مل من 0.05٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني وإضافة 10 ميكرولتر من streptavidin الفلورسنت (انظر المادة / الكاشف الجدول) المذاب في 10 مل من عازلة تمنع بالإضافة إلى 0.1٪ توين-20 لمدة 1 ساعة على RT.
    5. تغسل 4 مرات مع 0.05٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني ومرة ​​واحدة مع برنامج تلفزيوني وحدها (10 دقيقة لكل منهما).
    6. استخدام الماسح الضوئي صورة (انظر المادة / الكاشف الجدول). التبديل على الصك وجهاز كمبيوتر متصل. انتظر حتى جاهزة.
    7. بدء تشغيل البرنامج اقتناء واختيار وضع مضان. حدد منطقة الغشاء واختيار مجلد وجهة لحفظ الملفات.
    8. تعيين المعلمات الاستحواذ التالية: 680 نانومتر طول الإثارة، BPFR700 التصفية، 1000 V أنبوب مضخم (PMT) بقيمة (قناة 2)، و 25 ميكرون حجم بكسل. الحصول على صورة.

4. توطين أحدث حفاز ناا في ماوس الرئتين بواسطة الإسفار مايكرووننسخ

ملاحظة: فئران عمرها أسابيع 8-10 استخدام الذكور، وتأدية جميع الإجراءات وفقا لمبادئ توجيهية لاستخدام الأخلاقية للحيوانات. الفئران منزل في أقفاص التهوية على 12 ساعة دورة الضوء / الظلام ومنحهم حرية الوصول إلى الغذاء والماء.

  1. إدارة الوريد من ARN14686 في الفئران
    1. حل ARN14686 في السيارة: 15٪ PEG و 15٪ توين 20 محلول ملحي. حساب تركيز المحلول وفقا لوزن الماوس (جرعة 3 ملغ / كغ، وحجم حقن 5 مل / كغ).
    2. المضي قدما في حقن الرابع من 3 الفئران. وضع كل الماوس في جهاز ضبط النفس البلاستيك المناسب. ثم، ضع ذيل الماوس في ماء دافئ لمدة 2-4 دقيقة للسماح توسع الأوعية وحقن الرابع المجمع عن طريق الوريد الذيل.
    3. ضخ 3 الفئران الرابع مع السيارة فقط.
  2. الرئة جمع وإعداد شريحة
    تحذير: التعامل مع امتصاص العرق مع الحرص في غطاء الدخان، وارتداء قفازات!
    1. تخدير الفئران مع chloهيدرات راؤول (400 ملغ / كلغ). تأكيد التخدير مع قرصة أخمص قدميه. إجراء نضح transcardial على النحو التالي:
      1. قطع سطحي الجلد البطني مع مقص وفضح السطوح غشاء الصدر والبريتوني.
      2. قطع سطحي الغشاء البريتوني مع مقص، وأقل بقليل من عملية سيفي الشكل، وفضح الحجاب الحاجز والأجهزة الحشوية. يجب الحرص على عدم ممزق أي الأوعية الدموية كبير.
      3. فتح التجويف الصدري عن طريق قطع الحجاب الحاجز من الجانب الوحشي واحدة إلى أخرى.
      4. إدراج إبرة 25 G متصلا ضخ حقنة الآلي ويبث 20 مل من 0.9٪ محلول ملحي تليها 60 مل من 4٪ PFA في العازلة الفوسفات (0.1 م، ودرجة الحموضة 7.4).
    2. وبمجرد أن نضح كاملة، وسحب القلب باستخدام ملقط وتشريح بعناية من ذلك. فهم القصبة الهوائية مع ملقط وقطع تماما من خلال ذلك باستخدام المقص. الساحبة بلطف صعودا القصبة الهوائية وإزالة الرئتين من القفص الصدري. تشريح الأنسجة لفصل الرئة اليمنى من الناحية اليسرى.
    3. بوستفيكس الأنسجة في امتصاص العرق 4٪ لمدة 1 ساعة، عينات تجميد في البرد 2-methylbutane، وتخزينها في -80 درجة مئوية.
    4. جمع 40 ميكرون المقاطع باستخدام ناظم البرد، جبل على الفور على الشرائح (واحد كل الخامس)، ومعالجتها لالمناعية كما هو موضح أدناه.
  3. الأنسجة شرائح Permeabilization والحجب
    1. يغسل مع برنامج تلفزيوني (2X لمدة 5 دقائق) وpermeabilize مع 0.1٪ تريتون X-100 برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في RT.
    2. يغسل مع برنامج تلفزيوني (2X لمدة 5 دقائق) ومنع مع 3٪ زلال المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في RT.
    3. يغسل مع برنامج تلفزيوني (2X لمدة 5 دقائق) والمضي قدما CC.
  4. CC مع أزيد-PEG3 فلور 545 على شرائح الأنسجة
    1. يعد حل عن طريق خلط الكواشف CC أعد كما هو موضح في القسم 2. ل1 مل من محلول، إضافة: 2 ميكرولتر من أزيد-PEG3 فلور 545 (5 الاسهم ملم)، 20 ميكرولتر من TCEP (الطازجة 50 ملي جواربك)، و 58.8 ميكرولتر من TBTA (الطازجة 1.7 ملي حل العمل)، و 20 ميكرولتر من كبريتات النحاس 4 · 5H 2 O (50 الاسهم ملم)، و 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
    2. إضافة حوالي 400 ميكرولتر من مزيج CC إلى شرائح الأنسجة، والتي تم إعدادها وفقا للمادة 4.2. الانتباه إلى أن حجم اختيار من مزيج CC كافية لتغطية شرائح. احتضان لمدة 1 ساعة على RT محمية من الضوء.
    3. يغسل مع برنامج تلفزيوني (1X لمدة 5 دقائق)، والميثانول البارد (1X لمدة 5 دقائق)، وهو حل من 1٪ توين 20 و 0.5 ملي EDTA في برنامج تلفزيوني (3X لمدة 2 دقيقة)، وبرنامج تلفزيوني (1X لمدة 5 دقائق).
    4. الهواء الجاف، إضافة قطرة من antifade مرس مع دابي (انظر المادة / الكاشف الجدول)، وثيقة مع زلات غطاء (تجنب تشكيل فقاعة)، وختم بطلاء. تخزينها في 4 درجات مئوية حتى التحليل.
  5. الحصول على الصور
    1. استخدام المجهر متحد البؤر مجهزة 546 نانومتر و 450 نانومتر ليزر الإثارة (انظر المادة / الكاشف الجدول) التاليةدليل المستخدم.
    2. حدد 60X عدسة موضوعية مع NA = 1.40، مع التأكد من معاينة الشريحة من خلال العدسات والتركيز على مساحة من الاهتمام.
    3. تحديد المعلمات الاستحواذ وفقا لخصائص العينة والمعدات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وقد تم تصميم ARN14686 بناء على سقالة من المانع ARN726 ناا. تم استبدال مجموعة 4-بوتيل cyclohexyl من ARN726 مع سلسلة الأليفاتية المشبعة C9 تحمل علامة آلكاين محطة (الشكل 1). وقدم العلامة آلكاين من أجل السماح باستخدام إجراء وضع العلامات من خطوتين لإضافة fluorophore أو...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وينظم نشاط انزيم بدقة على مختلف المستويات، بما في ذلك النسخ RNA، تخليق البروتين، النبات البروتين، وتعديل ما بعد متعدية، وتفاعل البروتين البروتين. في كثير من الأحيان، والتعبير انزيم وحده لا يفسر لنشاطها. وقد وضعت ABPP لدراسة نشاط البروتينات في حالتها الأصلية. مطلوبة سمت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank the Nikon Imaging Center at Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italy (NIC@IIT).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1’-sulfonyldiimidazole Sigma Aldrich367818Harmful
2-dipyridylcarbonateFluorochem11331Harmful
2-MethylbutanSigma AldrichM32631Flamable, toxic,hazardous to the aquatic environment
4-(Dimethylamino)pyridineSigma Aldrich107700Toxic
Acetic acidSigma Aldrich695092Flammable, Corrosive
Acetonitrile Sigma Aldrich34998Flammable, Toxic
Activated charcoalSigma Aldrich161551
Ammonium chlorideSigma AldrichA9434Harmful
Azide-PEG3-BiotinJena BiosciencesCLK-AZ104P4
Azide-PEG3-Fluor 545Jena BiosciencesCLK-AZ109
BCA protein assay kitThermo Fisher Scientific23227
Bio-spin columnsBiorad732-6204
BiotinSigma AldrichB4501
Blocking bufferLi-Cor Biosciences927-40000
β-mercaptoethanolSigma AldrichM6250Higly toxic
Bovin serum albumine (BSA)Sigma AldrichA7030
Bromophenol blueSigma AldrichB0126
Bruker Avance III 400Bruker
CeliteSigma Aldrich419931Health hazard
Ceric ammonium nitrate Sigma Aldrich22249Oxidizing, Harmful
Chloral hydrateSigma AldrichC8383Higly toxic
CuSO4.5H2O Sigma Aldrich209198Toxic
CyclohexadieneSigma Aldrich125415Flammable, Health hazard
CyclohexaneSigma Aldrich34855Flammable, Harmful, Health hazard, Environmental hazard
DichloromethaneSigma Aldrich34856Harmful, Health hazard
Diethyl etherSigma Aldrich296082Flammable, Harmful
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Acros Organics348441000
Dimethyl sulfoxide d6 (DMSO-d6)Sigma Aldrich175943
EthanolSigma Aldrich2860Flammable, Harmful
Ethyl acetateSigma Aldrich34858Flammable, Harmful
GlycerolSigma AldrichG5516
Irdye 680-LT StreptavidinLi-Cor Biosciences925-68031
IRDye680-LT Streptavidin Licor925-68031Briefly centrifuge before use to precipitate protein complexes
MethanolSigma Aldrich34966Highly toxic
MethanolSigma Aldrich34860Flammable, Toxic, Health hazard
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochlorideSigma AldrichE7750Harmful, Corrosive
N,N-diisopropylethylamineSigma AldrichD125806Flammable, Corrosive, Toxic
N,N-dimethylformamideSigma Aldrich227056Flammable, Harmful, Health hazard
N-Cbz-L-SerineFluorochemM03053Harmful
Nikon A1 confocal microscopyNikonRead the user manual
NuPAGE 4-12% Bis-Tris gelThermo Fisher ScientificNP0335BOX
Palladium on carbonSigma Aldrich330108
p-anisidineSigma AldrichA88255Toxic, Health hazard, Environmental hazard
Paraformaldehydesigma Aldrich441244Toxic, respiratory harmful, corrosive, falmable
Poly(ethylene glycol) Sigma AldrichP3265
ProLong Gold antifade mountant with DAPI Thermo Fisher ScientificP36931Avoid bubbles formation
Protease inhibitor cocktailSigma AldrichP8340
Sodium bicarbonateSigma AldrichS6014
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma AldrichL3771Toxic, corrosive, falmmable
Sodium hydride Sigma Aldrich452912Flammable
Sodium sulfateSigma Aldrich239313
Starion FLA-9000 immage scannerFUJIFILMRead  the user manual
Streptavidin agaroseThermo Fisher Scientific20349
SucroseSigma AldrichS7903
Tert-butanolSigma Aldrich360538Toxic, flammable
TetrahydrofuranSigma Aldrich186562Flammable, Harmful, Health hazard
ThioureaAcros Organics424542500Toxic, warm at 50 °C to dissolve
TrisSigma AldrichRDD008
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)Sigma AldrichC4706
Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine (TBTA)Sigma Aldrich678937
Triton-x100Sigma AldrichX100Toxic
Tween-20Sigma AldrichP9416
Tween-80Sigma AldrichP1754
Ultra turrax IKA T18 basic tissue homogenizerIKA
Undec-10-yn-1-olFluorochem13739Harmful
UreaSigma AldrichU5378Toxic, warm at 50 °C to dissolve

References

  1. Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
  2. Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R. Large-scale analysis of the yeast proteome by multidimensional protein identification technology. Nat Biotechnol. 19, 242-247 (2001).
  3. Zhu, H., Bilgin, M., Snyder, M. Proteomics. Annu Rev Biochem. 72, 783-812 (2003).
  4. Ito, T., et al. Roles for the two-hybrid system in exploration of the yeast protein interactome. Mol Cell Proteomics. 1, 561-566 (2002).
  5. Evans, M. J., Cravatt, B. F. Mechanism-based profiling of enzyme families. Chem Rev. 106, 3279-3301 (2006).
  6. Cravatt, B. F., Wright, A. T., Kozarich, J. W. Activity-based protein profiling: from enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu Rev Biochem. 77, 383-414 (2008).
  7. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).
  8. Meldal, M., Tornoe, C. W. Cu-catalyzed azide-alkyne cycloaddition. Chem Rev. 108, 2952-3015 (2008).
  9. Speers, A. E., Adam, G. C., Cravatt, B. F. Activity-based protein profiling in vivo using a copper(i)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition. J Am Chem Soc. 125, 4686-4687 (2003).
  10. Saxon, E., Bertozzi, C. R. Cell surface engineering by a modified Staudinger reaction. Science. 287, 2007-2010 (2000).
  11. Kohn, M., Breinbauer, R. The Staudinger ligation-a gift to chemical biology. Angew Chem Int Ed Engl. 43, 3106-3116 (2004).
  12. Romeo, E., et al. Activity-Based Probe for N-Acylethanolamine Acid Amidase. ACS Chem Biol. 10, 2057-2064 (2015).
  13. Ueda, N., Yamanaka, K., Yamamoto, S. Purification and characterization of an acid amidase selective for N-palmitoylethanolamine, a putative endogenous anti-inflammatory substance. J Biol Chem. 276, 35552-35557 (2001).
  14. Tsuboi, K., et al. Molecular characterization of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a novel member of the choloylglycine hydrolase family with structural and functional similarity to acid ceramidase. J Biol Chem. 280, 11082-11092 (2005).
  15. Tsuboi, K., Takezaki, N., Ueda, N. The N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase (NAAA). Chem Biodivers. 4, 1914-1925 (2007).
  16. Ribeiro, A., et al. A Potent Systemically Active N-Acylethanolamine Acid Amidase Inhibitor that Suppresses Inflammation and Human Macrophage Activation. ACS Chem Biol. 10, 1838-1846 (2015).
  17. Zhao, L. Y., Tsuboi, K., Okamoto, Y., Nagahata, S., Ueda, N. Proteolytic activation and glycosylation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase, a lysosomal enzyme involved in the endocannabinoid metabolism. Biochim Biophys Acta. 1771, 1397-1405 (2007).
  18. Wang, J., et al. Amino acid residues crucial in pH regulation and proteolytic activation of N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. Biochim Biophys Acta. 1781, 710-717 (2008).
  19. West, J. M., Zvonok, N., Whitten, K. M., Wood, J. T., Makriyannis, A. Mass spectrometric characterization of human N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase. J Proteome Res. 11, 972-981 (2012).
  20. Bandiera, T., Ponzano, S., Piomelli, D. Advances in the discovery of N-acylethanolamine acid amidase inhibitors. Pharmacol Res. 86, 11-17 (2014).
  21. Sasso, O., et al. Antinociceptive effects of the N-acylethanolamine acid amidase inhibitor ARN077 in rodent pain models. Pain. 154, 350-360 (2013).
  22. Duranti, A., et al. N-(2-oxo-3-oxetanyl)carbamic acid esters as N-acylethanolamine acid amidase inhibitors: synthesis and structure-activity and structure-property relationships. J Med Chem. 55, 4824-4836 (2012).
  23. Ponzano, S., et al. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) of 2-methyl-4-oxo-3-oxetanylcarbamic acid esters, a class of potent N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. J Med Chem. 56, 6917-6934 (2013).
  24. Solorzano, C., et al. Synthesis and structure-activity relationships of N-(2-oxo-3-oxetanyl)amides as N-acylethanolamine-hydrolyzing acid amidase inhibitors. J Med Chem. 53, 5770-5781 (2010).
  25. Vitale, R., et al. Synthesis, structure-activity, and structure-stability relationships of 2-substituted-N-(4-oxo-3-oxetanyl) N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors. ChemMedChem 9. 9, 323-336 (2014).
  26. Fiasella, A., et al. 3-Aminoazetidin-2-one derivatives as N-acylethanolamine acid amidase (NAAA) inhibitors suitable for systemic administration. ChemMedChem 9. 9, 1602-1614 (2014).
  27. Armirotti, A., et al. beta-Lactones Inhibit N-acylethanolamine Acid Amidase by S-Acylation of the Catalytic N-Terminal Cysteine. ACS Med Chem Lett. 3, 422-426 (2012).
  28. Nuzzi, A., et al. Potent alpha-amino-beta-lactam carbamic acid ester as NAAA inhibitors. Synthesis and structure-activity relationship (SAR) studies. Eur J Med Chem. 111, 138-159 (2016).
  29. Bonezzi, F. T., et al. An Important Role for N-Acylethanolamine Acid Amidase in the Complete Freund's Adjuvant Rat Model of Arthritis. J Pharmacol Exp Ther. 356, 656-663 (2016).
  30. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  31. Speers, A. E., Cravatt, B. F. Activity-Based Protein Profiling (ABPP) and Click Chemistry (CC)-ABPP by MudPIT Mass Spectrometry. Curr Protoc Chem Biol. 1, 29-41 (2009).
  32. Rybak, J. N., Scheurer, S. B., Neri, D., Elia, G. Purification of biotinylated proteins on streptavidin resin: a protocol for quantitative elution. Proteomics. 4, 2296-2299 (2004).
  33. Penna, A., Cahalan, M. Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (264), (2007).
  34. Giuffrida, A., Piomelli, D. Isotope dilution GC/MS determination of anandamide and other fatty acylethanolamides in rat blood plasma. FEBS Lett. 422, 373-376 (1998).
  35. Buczynski, M. W., Parsons, L. H. Quantification of brain endocannabinoid levels: methods, interpretations and pitfalls. Br J Pharmacol. 160, 423-442 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

117 N acylethanolamine

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved