A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
إزالة
In This Article
Summary
تفيد الدراسات التشكل الخلايا العصبية باستخدام ذبابة الفاكهة تشجر شجيري اليرقات (دا) الخلايا العصبية من في التصور الموقع من البروتينات العصبية والبشرة المناعي. نحن تصف الإجراء الذي يحسن التحليل المناعي دا الخلايا العصبية والخلايا المحيطة البشرة عن طريق إزالة الأنسجة العضلية من جدار الجسم اليرقات.
Abstract
ذبابة الفاكهة اليرقات تشجر شجيري (دا) الخلايا العصبية هي نموذج شعبية للتحقيق في آليات التشكل الخلايا العصبية. دا الخلايا العصبية تتطور في اتصال مع خلايا البشرة التي يعصب وبالتالي فوائد تحليلهم من التصور في مواقعها الطبيعية في كل من البروتينات وأعرب neuronally وepidermally المناعي. الطرق التقليدية في تحضير شرائح اليرقات لتجارب المناعي على حالها الأنسجة العضلية التي تغطي أكثر من جدار الجسم، وتقديم العديد من التحديات لتصوير الخلايا العصبية والبشرة البروتينات. نحن هنا تصف طريقة لإزالة الأنسجة العضلية من ذبابة الفاكهة شرائح اليرقات. يتيح هذا البروتوكول التصوير من البروتينات التي يتم حجب خلاف ذلك أنسجة العضلات، ويحسن إشارة إلى نسبة الضوضاء، ويسهل استخدام فائقة الدقة المجهر لدراسة دا تنمية الخلايا العصبية.
Introduction
توفر ذبابة الفاكهة اليرقات تشجر شجيري (دا) الخلايا العصبية نموذجا قيما لدراسة تطوير الخلايا العصبية بسبب قابليته لالتلاعب الجيني والسهولة التي يمكن تصويرها. وكانت هذه الخلايا العصبية الحسية دور فعال في تحديد العديد من مسارات التي تتحكم في التغصنات التشكل 1-3.
أربع فئات من دا الخلايا العصبية (الصف الأول - الرابع) يعصب البشرة اليرقات. هذه الخلايا العصبية تقع بين الغشاء القاعدي والبشرة، مع التشعبات الذين يشكلون صفائف إلى حد كبير ثنائية الأبعاد 4،5. من الفئات الأربع، والطبقة الرابعة دا الخلايا العصبية لديها العرش الأكثر تشعبت للغاية، ومثل الخلايا العصبية الحسية من الحيوانات الأخرى، ووضع هذه العرش يتطلب العوامل الجوهرية وكذلك العظة من الأنسجة المجاورة، وخاصة البشرة، لتنميتها 6-9 .
دراسات لتحديد كيف يمكن لهذه الخلايا العصبية والواقع خارج الخلايا العصبيةالأملاح السيطرة صالح التشكل تغصناته من القدرة على الكشف عن بروتين تعبير في الموقع المناعي. بشرة الخارجية لليرقة هو منيع لالأجسام المضادة، ولكن التغلب على هذا العائق بسهولة عن طريق إعداد شرائح اليرقات من خلال وسائل تشريح راسخة 10،11. ومع ذلك، فإن الأنسجة العضلية جدار الجسم التي تقع على بعد الداخلية إلى الغشاء القاعدي تقدم العديد من التحديات نحو التصور من الخلايا العصبية دا وخلايا البشرة. أولا، الأنسجة العضلية، والتي خطوط معظم من جدار الجسم، يحجب كثيرا إشارات الفلورية المنبعثة من الأنسجة العصبية أو البشرة. هذا يقلل بشكل كبير من إشارة إلى نسبة الضوضاء في العينة. ثانيا، يمكن التعبير عن العديد من البروتينات ذات الصلة في الأنسجة العضلية وكذلك في الخلايا العصبية أو البشرة. ومن المرجح أن مزيدا من الكشف غامضة إشارة مضان من الخلايا العصبية أو البشرة هذه الإشارة مضان مأخوذة من العضلات. وأخيرا، فإن التقدم في تقنيات المجهر لاث التصوير تصريح العينات في قرار دون حيود وقد تكون مفيدة خاصة في تمييز توطين البروتينات التي يتم التعبير عنها في الخلايا العصبية والخلايا المحيطة البشرة 12،13. ومع ذلك، والتصوير عبر فوائد المجهر فائقة الدقة من إشارة قوية إلى نسبة الضوضاء وبالقرب من العينة إلى ساترة. بالإضافة إلى الحد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء، واليرقات جدار الجسم مسافات العضلات دا الخلايا العصبية من ساترة، مما يحد من دقة وضوح الصورة المحسنة التي يمكن تحقيقها مع أساليب الفحص المجهري فائقة الدقة. وبالاضافة الى التحديات التي تواجه التحليل المناعي، تقدم الأنسجة العضلية عائقا أمام تسجيل الكهربية من الخلايا العصبية الحسية في جدار الجسم اليرقات. وبالتالي زواله يفيد التلاعب العصبي الخلايا العصبية الحسية 14.
هنا يتم وصف طريقة لإزالة يدوية من ذبابة الفاكهة الأنسجة العضلية اليرقات. علينا أن نبرهن أن لدينا بروتوكول صermits التصوير المناعي من البروتينات التي يتم حجب خلاف ذلك أنسجة العضلات، ويحسن إشارة إلى نسبة الضوضاء لرؤية الدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية، ويمكن استخدام فائقة قرار المجهري للتمييز أفضل العلاقات المكانية للبروتينات والهياكل الخلوية في دا الخلايا العصبية و البشرة.
Protocol
ملاحظة: الإجراء لإزالة العضلات (الشكل 1) هو تعديل من الأساليب المذكورة سابقا لإعداد شرائح اليرقات. وترد الخطوات التي تسبق واتبع إزالة العضلات لفترة وجيزة ويشار إلى القارئ إلى الأعمال السابقة 10 و 11 لوصف أكثر تفصيلا.
1. تشريح اليرقة في المياه المالحة الباردة
- إعداد تخفيف العمل الباردة HL3.1 المالحة 15 أو الكالسيوم البارد 2+ خالية HL3.1 المالحة 11 (الجدول 1). مكان اليرقة في طبق المطاط الصناعي السيليكون مع ما يكفي المالحة الباردة لتغطية الجزء السفلي من الطبق.
ملاحظة: انظر مناقشة فيما يتعلق باختيار من المياه المالحة.
| 1X المالحة HL3.1 (درجة الحموضة 7.2) |
| 5 ملي HEPES |
| 70 ملي كلوريد الصوديوم |
| 5 ملي بوكل |
| 1.5 ملي CaCl 2 (حذف ل Ca 2+ المالحة خالية) |
| 4 ملي MgCl 2 |
| 10 ملم NaHCO 3 |
| 5 ملي طرهالوز |
| 115 ملي السكروز |
| تعقيم تصفية وتخزينها في 4 درجات مئوية |
| يقلد تكوين الحشرة الدملمف: مذكرة |
الجدول 1. تكوين الباردة المالحة.
- وضع اليرقة مع الجانب حتى بطني. السطح البطني لليرقة يمكن تحديدها عن طريق الأحزمة dentical البطن والجانب الظهري من أنابيب القصبة الهوائية اليرقات الأولية يمتد من الأمامي إلى الخلفي. تمتد اليرقة في الاتجاه الأمامي الخلفي ويعلقون الرأس والذيل لسيليكون المطاط الصناعي طبق تشريح باستخدام دبابيس الحشرات. استخدام مقص تشريح غرامة لقطع على طول خط الوسط بطني، ابتداء من نهاية واحدة وتتقدم في اتجاه آخر.
ملاحظة: هذا التوجه يحفظ الكتلة الظهرية درس عادة من دا الخلايا العصبية. - بعد قطع اليرقة مفتوحة، دبوس الأركان الأربعة للطبق تشريح كما لو فتح الكتاب. استخدام ملقط لانتزاع وإزالة الأعضاء الداخلية بما فيها الجهاز العصبي المركزي، القناة الهضمية، والقصبة الهوائية. ضبط دبابيس الحشرات بحيث فيليه هو مشدود ولكن لا تمتد الى اقصى حد ممكن.
وترسو العضلات لجدار الجسم في حدود القطاعية: ملاحظة. على الرغم من أن عضلات تغطي معظم جدار الجسم، فهي غائبة في منطقة ضيقة بالقرب من خط الوسط الظهرية.
إزالة 2. العضلات
- تحديد خط الوسط الظهري لليرقة، حيث الأنسجة العضلية هي غائبة. وضع ملقط الشق واحد بحيث يمكن إدراجها تحت الأنسجة العضلية في تسطحا التوجه ممكن.
- يبدأ منخط الوسط الظهرية، بالقرب من الحدود الأمامي من الجزء، الشريحة بعناية الشق ملقط بين العضلات والبشرة، مع الحرص على تقليل الاتصال بين ملقط والبشرة.
- سحب ملقط صعودا لكسر الحجز على العضلات لجدار الجسم في مرساة نقطة واحدة. كرر هذه العملية لباقي نصفي جزء (ق) من الفائدة.
ملاحظة: هذا البروتوكول يحسن الحفاظ على الخلفي من كل حقل التغصنات دا الخلايا العصبية. للحفاظ على الجزء الأمامي من الملعب في التغصنات، فمن الأفضل لإدراج الشق ملقط في نهاية الخلفي من كل قطعة. - إعادة ضبط دبابيس الحشرات مثل أن شرائح اليرقات ويمتد الحد الأقصى في جميع الاتجاهات.
- إصلاح فيليه في حين انها لا تزال معلقة على طبق تشريح باستخدام الباردة، طازجة الفورمالديهايد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 25 دقيقة.
- شطف 5 مرات في برنامج تلفزيوني.
- استخدام الملقط لسحب بعناية بعيدا الأنسجة العضلية من نقاط الربط المتبقية، مع الحرص على تقليل حساب المشتركط م مع البشرة.
- بفصل وإزالة شرائح من الطبق تشريح لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل. أداء جميع الغسيل، حظر، والخطوات المناعي تلطيخ لاحقة، كما هو موضح سابقا (11).
3. جبل اليرقات فيليه
- أولا إزالة الرأس والذيل باستخدام مقص تشريح غرامة من أجل جعل عينة شقة ممكن. تركيب شرائح على ساترة في antifade مرس مع السطح الداخلي للشرائح التي تواجه ساترة.
- ضع شريحة المجهر على ساترة واضغط برفق لتفريق المتوسطة المتزايدة. الوجه شريحة المجهر مرارا وختم ساترة على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر. ويمكن تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
النتائج
ونحن لشرح فائدة هذا الإجراء إزالة العضلات لتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء في التجارب المناعي للمشاركة في تصور البروتينات محوجزة تقاطع Coracle (كورا) وقرص واسع (أجهزة ...) جنبا إلى جنب مع الصنف الرابع دا الخلايا العصبية المسماة مع علامة غشاء CD4- tdTomato.
Discussion
هنا يوصف بروتوكول للالإزالة اليدوية من الأنسجة العضلية من ذبابة الفاكهة شرائح اليرقات. هذا البروتوكول يعدل الموصوفة سابقا تقنيات تشريح اليرقات 10،11. بعد تشريح اليرقة في طبق المطاط الصناعي السيليكون، يقع خط الوسط الظهرية. وملقط الشق واحد، في تسطحا توجهها ا...
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgements
نشكر غاري Laevsky لإجراء مناقشات مفيدة حول المجهري. بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة هذا العمل يمنح R01GM061107 وR01GM067758 إلى أرج
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
References
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111 (2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
Reprints and Permissions
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved