والإسفار الفحص بسيطة لالكمي من الكلاب خارج الخلية العدلات فخ الإصدار

Summary

الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) هي شبكات من الحمض النووي، الهستونات والبروتينات العدلة. على الرغم من أن المكون من الاستجابة المناعية الفطرية، وتورط المستجدة في المناعة الذاتية وتجلط الدم. يصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل العدلات الكلاب وتقدير من المستجدة باستخدام فحص صفيحة مضان.

Abstract

Neutrophil extracellular traps are networks of DNA, histones and neutrophil proteins released in response to infectious and inflammatory stimuli. Although a component of the innate immune response, NETs are implicated in a range of disease processes including autoimmunity and thrombosis. This protocol describes a simple method for canine neutrophil isolation and quantification of NETs using a microplate fluorescence assay. Blood is collected using conventional venipuncture techniques. Neutrophils are isolated using dextran sedimentation and a density gradient using conditions optimized for dog blood. After allowing time for attachment to the wells of a 96 well plate, neutrophils are treated with NET-inducing agonists such as phorbol-12-myristate-13-acetate or platelet activating factor. DNA release is measured by the fluorescence of a cell-impermeable nucleic acid dye. This assay is a simple, inexpensive method for quantifying NET release, but NET formation rather than other causes of cell death must be confirmed with alternative methods.

Introduction

وهناك أكثر من 70 مليون الكلاب الاليفة في الولايات المتحدة وحدها ^1. كأعضاء أسرة الكرام، هذه الحيوانات غالبا ما تلقي الرعاية الطبية خفض الحافة. على قدم المساواة لأنهم مشاركة بيئتنا، يمكن أن الكلاب أن تساعد في فهم المرضية والعلاج من الأمراض التي تصيب البشر ^1. ومع ذلك، ما إذا كانت ترجمة الاكتشافات في الطب البشري في العلاجات البيطرية أو العكس بالعكس، فمن المهم أن تميز الاختلافات الأنواع حتى في أنظمة الحفظ للغاية تماما مثل الاستجابة المناعية الفطرية. وتشمل الأمثلة على الاختلافات بين الكلاب ونظام المناعة الفطري البشري العالي التعبير CD4 على العدلات الكلب ^2. غياب homolog الوظيفي للاستشعار فلاجيلين حشوية IPAF في الكلاب ³ والتعبير عن هجين كاسباس 1/4 في الحيوانات آكلة اللحوم ^(4).

الفخاخ خارج الخلية العدلات (المستجدة) هي عنصر المكتشفة حديثا نسبيا من مناعة فطرية ^5. المستجدة هي شبكةالصورة من الحمض النووي والبروتينات النووية والحبيبية صدر ردا على مجموعة واسعة من التهابات أو المعدية المحفزات ^6. وقد أثبتت يشبه الهياكل NET عبر العديد من الأنواع بما في ذلك الدجاج ^{7، 8} الأسماك والرخويات ⁹ و ¹⁰ acoelomates، ولكن هناك اختلافات الأنواع. على سبيل المثال، العدلات الفئران تستجيب ببطء أكثر للمؤثرات NETosis من العدلات الإنسان، وتشكل المستجدة أقل منتشر ^11. وهناك مجموعة كبيرة من الأدلة من الأنواع المتعددة التي المستجدة إيقاع الميكروبات، وأكثر إثارة للجدل يمكن أن تشارك مباشرة في قتل مسببات الأمراض ^12،13. ومع ذلك، مكونات NET أيضا تعزيز تلف الأنسجة، وتشجيع تخثر الدم ويكون بمثابة مستضدات الذاتية ^14،15. قد تختلف التوازن بين الآثار المفيدة والضارة للالمستجدة بين الأمراض المختلفة والأنواع المختلفة، مما يدل على أنه من المهم للتحقيق المستجدة في كل من الأنواع وحالة من الفائدة.

نحن هناوصف بروتوكول بسيط لإحداث وقياس الافراج عن المستجدة التي كتبها العدلات الكلاب. هذه الطريقة مشابهة لتلك المستخدمة لعزل العدلات ¹⁶ و حمل NETosis في الأنواع الأخرى، ولكن الظروف مثل تركيز ناهض وفترة حضانة وقد تم تحسين لالعدلات الكلاب. كما تم وصف مماثل NET الكمي الحمض النووي الإفراج فحص في الأنواع الأخرى ولكن الطريقة المعروضة هنا هو الأمثل أيضا للكلاب ^8،17،18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

أجريت جميع التجارب بإذن الأخلاقي من لجنة جامعة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام ولاية أيوا.

مجموعة 1. الدم

1. رسم 9 مل من الدم من الصافن، وريد رأسي أو الوداجي مباشرة إلى تخثر (على سبيل المثال، ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، و 1.8 ملغم ك ₂ EDTA / ملليتر دم) vacutainers، أو إلى حقنة مع نقل على الفور إلى أنابيب الدم التي تحتوي على EDTA. لفة بلطف أو عكس أنابيب الدم لضمان خلط كافية من الدم ومكافحة تجلط الدم.

2. العدلات عزل

1. في أنبوب مخروطي 50 مل، مزيج الدم مع حجم مساو من درجة حرارة الغرفة المعقمة 3٪ ديكستران-500 (تتكون في 0.9٪ محلول ملحي) من خلال انعكاس لطيف. ترك واقفا منتصبا ل18-20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل القش الملونة الطبقة العليا إلى أنبوب جديد حتى لم يعد من الممكن جمعها دون تلوث طبقة حمراء أقل. كريات الدم الحمراء في اله أنبوب الأصلي يمكن التخلص منها.
2. أجهزة الطرد المركزي لطاف في 500 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. رسم الخروج وتجاهل طاف. يدويا إعادة تعليق بيليه خلية في 10 مل درجة حرارة الغرفة معقمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). لاحظ أن vortexing للا ينبغي أن تستخدم لإعادة تعليق العدلات في أي مرحلة من مراحل هذا البروتوكول. رسم يدويا قبالة، بدلا من صب قبالة supernatants ويوصى أيضا في جميع أنحاء بروتوكول لتعظيم العائد الخلية.
3. إضافة 10 مل من محلول فصل الخلية polysucrose درجة حرارة الغرفة ودياتريزوات الصوديوم (على سبيل المثال، Histopaque 1077) إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. طبقة بعناية الحل التي تحتوي على خلية على حل فصل الخلية. لاحظ أن استخدام حل فصل الخلايا التي لم معايرتها إلى درجة حرارة الغرفة قد يقلل العائد الخلية.
4. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع قبالة الفرامل.
5. كما العدلات هي في أدنى طبقة من التدرج، ورسم الخروج وتجاهل uppeص 3 طبقات، تتألف من طبقة العليا من البلازما والصفائح الدموية، والشريط الأبيض الضيقة للخلايا وحيدة النواة وطبقة واضحة من متوسطة الكثافة التدرج.
6. ليز أي الكريات الحمراء المتبقية، وإعادة تعليق بيليه العدلات في 10 مل من الماء درجة حرارة الغرفة.
7. بعد 30 ثانية، واستعادة تحظرب بإضافة 10 مل من معقم درجة حرارة الغرفة 1.8٪ كلوريد الصوديوم وتخلط بواسطة قلب لطيف.
8. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. رسم قبالة طاف وتجاهل.
9. إذا كان بيليه لا تزال حمراء، كرر الخطوة تحلل. إذا كان بيليه الأبيض (أو إذا كان قد تم إجراء تحلل مرتين)، بلطف اعادة تعليق الخلايا في 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة.
10. عد الخلايا باستخدام عداد الآلي أو عدادة الكريات. غلة النموذجية هي 10 على الأقل ⁶ خلايا لكل مليلتر من الدم.
11. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. رسم قبالة طاف وتجاهل.
12. إعادة تعليق الخلايا إلى التركيز المطلوب في العقيمة درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني. فوص فحص الحمض النووي إطلاق وصف في الباب 2، و resuspend في 5 × 10 ⁶ خلايا لكل مل.
13. إذا رغبت في ذلك، ونقل كمية صغيرة من الخلايا مباشرة أو باستخدام cytocentrifuge إلى شريحة زجاجية. تسمح للخلايا حتى يجف وصمة عار يستخدم التثبيت وتلطيخ السريعة عدة وفقا لتصنع "تعليمات. إذا كانت العزلة العدلات ناجحة، عندما فحصها تحت المجهر يجب أن يكون 95٪ على الأقل من الخلايا الأنوية المحببة (العدلات، الخلايا القاعدية، الحمضات) مع التلوث كرات الدم الحمراء الحد الأدنى.

3. الحمض النووي الإصدار الفحص

1. إعداد مقايسة إطلاق الحمض النووي مباشرة بعد العزلة العدلة.
2. إذا تكتل خلية موجود على فحص المحلول بواسطة المجهر الضوئي، وتمرير تعليق الخلية من خلال 70 ميكرون تصفية عقيمة عقيمة على الفور قبل إعداد الفحص.
3. إلى كل بئر اختبار العقيمة 96 لوحة جيدا، إضافة 5 × 10 ⁴ خلايا / جيد. ناهض وروزويل بارك مذكرةالريال معهد-1640 (RPMI) وسيط وبدون الفينول الأحمر وتستكمل مع 0.5٪ الحرارة المعطل مصل العجل الجنين إلى الحجم النهائي من 100-200 ميكرولتر. تشمل اثنين على الأقل من الآبار فارغة في ناهض الذي يتم استبدال المحلول العدلة من حجم مساو من برنامج تلفزيوني. لاحظ أن إنشاء الآبار فارغة لكل ناهض المهم في استبعاد تلوث الحمض النووي من ناهض أو تدخل من قبل ناهض مع مقايسة مضان.
4. احتضان عند 39 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون (4٪).
5. إضافة منبهات بتركيزات المطلوبة وخلية منفذة صبغ الحمض النووي. ملاحظة سوف تختلف بين مختلف الأصباغ الحمض النووي تركيز الأمثل للخلية الصبغة غير منفذة. ينبغي أن تدرج غير حفز ضوابط التي يتم استبدال منبهات التي كتبها حجم مساو من وسائل الإعلام في كل تجربة.
   ملاحظة: من المستحسن أن تخفف منبهات في كميات مماثلة من مستنبت للحفاظ على ظروف ثابتة بين الآبار. أحجام جيدا النهائية من 200 ووقد استخدمت ل بنجاح وإذا تم تغيير هذا، وأيضا كميات ينبغي أن تظل مطابقة لجميع الشروط؛ # 181. يمكن استخدام Phorbol-12-ميريستيت-13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) (تركيز النهائي ≥0.1 ميكرومتر) أو الصفيحات تفعيل عامل (القوات الجوية الباكستانية) (تركيز النهائي ≥31 ميكرومتر) كما الضوابط الإيجابية. وينبغي قياس منبهات على الأقل في مكررة.
6. احتضان عند 39 درجة مئوية. قياس مضان باستخدام قارئ صفيحة بعد 2 ساعة أو على فترات المطلوب. لاحظ أن الفترات الزمنية المثلى سوف تختلف مع منبهات المستخدمة.
   ملاحظة: الطول الموجي يعتمد على الصبغة المستخدمة.
7. طرح مضان فارغة قبل احتساب متوسط ​​مضان.
8. للسماح للمقارنة بين الأفراد وبين لوحات، وحساب تغيير أضعاف في مضان بقسمة متوسط ​​مضان من الآبار يحفزه على مضان يعني من الآبار غير حفز.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول، يجب أن يكون هناك تغيير أضعاف القوي في مضان بعد تحفيز العدلات مع الضوابط الإيجابية، سلطة النقد الفلسطينية والقوات الجوية الباكستانية. كما هو موضح في الشكل 1B، وتحفيز العدلات الكلاب مع 31 ميكرومتر القوات الجوية الباك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

فحص الحمض النووي الإفراج قدم هو فحص للقياس بسهولة للالحمض النووي خارج الخلية. تم تعديل طريقة من تقنيات مشابهة تستخدم لتقييم تشكيل NET في الأنواع الأخرى، ولكن تم تغيير السرعات الطرد المركزي، وتركيزات ناهض وحضانة مرات لتحسين طريقة للاستخدام مع العدلات الكلاب ^8،17،18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA	BD	367835
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Dextran-500	Accurate chemical and scientific corp.	AN228410
Phosphate buffered saline	ThermoFisher scientific	20012043
Fetal bovine calf serum, heat inactivated	ThermoFisher scientific	10100139
RPMI Media 1640, without phenol red or L-glutamine	ThermoFisher scientific	32404-014	Should be free from phenol red
96 well flat bottomed sterile polystyrene plate	Falcon	353072
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P1585
Platelet activating factor	Sigma-Aldrich	P4904
SYTOX Green Nucleic Acid Stain	ThermoFisher scientific	S7020
Synergy 2 Multi-Mode Reader	BioTek	NA