وسيلة فعالة لتخليق Peptoids مع مونمرات مختلط ليسين من نوع / ارجينين من نوع وتقييم نشاطهم مكافحة يشماني

Summary

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Abstract

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized 'lysine' and guanido functionalized 'arginine' peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

Introduction

Peptoids (أو بولي N -substituted glycines) هي فئة من الببتيد محاكيات التي تقدم خصائص مشابهة لالببتيدات وعلى هذا النحو بشكل متزايد يجري التحقيق للتطبيقات الطبية والمواد. في الببتيدات، يتم توصيل سلسلة جانب كل من الأحماض الأمينية إلى α الكربون من العمود الفقري أميد. في peptoids وتحول السلاسل الجانبية على ذرة النيتروجين من العمود الفقري. بشكل حاسم، وهذا يعطي peptoids أكبر على مقاومة التحلل البروتيني.

وعادة ما توليفها Peptoids باستخدام طريقة submonomer رائدها Zuckermann وآخرون، حيث أحادية peptoid يمكن بناؤها من قبل haloacetylation متتابعة من ظيفة أمين تعلق على دعم قوي والتشريد لاحق من الهالوجين باستخدام أمين الابتدائي. ¹ مجموعتنا طورت مؤخرا على التكيف مع هذه الطريقة submonomer للسماح lysine- وأرجينين من نوع المخلفات peptoid التي ستدرج ضمن نفس تسلسل peptoid لوأوال الوقت. ² هذا النهج الصلبة مرحلة اليدوي لpeptoid التوليف يستخدم الكواشف المتاحة تجاريا ومعدات المختبرات المشتركة، مما يجعلها في متناول غالبية المختبرات. وقد ثبت Peptoids أن الأنشطة الواعدة ضد طائفة واسعة من البكتيريا سالبة الجرام، غرام الأنواع البكتيرية والفطرية الإيجابية التي يمكن مقارنتها مع العديد من الببتيدات المضادة للميكروبات المعروفة ^3-9

في عملنا، وقد استخدمت peptoids كما مركبات جديدة المضادة للعدوى للعلاج من داء الليشمانيات أمراض المناطق المدارية المهملة. ^5،10 داء الليشمانيات متوطن في أكثر من 80 بلدا في جميع أنحاء العالم، وتشير التقديرات إلى أن أكثر من 12 مليون شخص مصابون على مستوى العالم. ⁽¹¹⁾ ويتسبب المرض عن طريق الطفيليات التي تنتقل عن طريق لدغة ذبابة الرمال. أنواع الليشمانيا يمكن أن يسبب داء الليشمانيات الجلدي، شرط أن يؤدي الى ظهور ندوب والأضرار التي لحقت الأغشية المخاطية، أو ايس الحشوية التي تهدد الحياةhmaniasis، والذي يسبب تلف الجهاز قاتلة. لا يوجد لقاح متاح حاليا لهذا المرض والعلاجات الراهنة تعتمد على عدد قليل من الأدوية التي لها آثار جانبية خطيرة. وبالإضافة إلى ذلك، مقاومة للعقاقير الحالية هي مشكلة الناشئة وخطيرة وهناك حاجة إلى علاجات جديدة بأمس لعلاج داء الليشمانيات فعال في المستقبل. ^12-16

في هذه التطبيقات المضادة للميكروبات، وغالبا ما يتم تصميم peptoids أن تكون متقابلة الزمر بمزيج من الموجبة ومونومرات مسعور. ^3،4 وهذا يمكن أن تعطي peptoids درجة من الانتقائية تجاه الخلايا البكتيرية، والحد من سمية للخلايا الثدييات، وتحسين نشاطهم كما نقل الجزيئية . ^17-20 الغالبية العظمى من peptoids المضادة للعدوى في الأدب تحتوي على سلاسل الجانب الموجبة التي تتألف حصرا إما الأمينية functionalized أحادية يسين من نوع أو أرجينين من نوع المخلفات. الوهم الببتيد peptoid، حيث تتكون سلاسل الموجبة لللمينو الأحماض يسين أو أرجينين، كما تم تصنيعه لدراسة تأثير الجماعات الموجبة على النشاط وسمية ^21-25

peptoids بولي يسين يمكن توليفها بسهولة باستخدام المتاحة تجاريا الأمينات بوك المحمية. ذكرت وpeptoids بولي أرجينين يمكن أن يتم باستخدام الطريقة التي يستخدم بيرازول-1-carboxamidine كعامل guanidinylation. ¹⁸ ومع ذلك، هذا لا يمكن إلا أن تضطلع بعد أن تم المشقوق وpeptoid من الراتنج وحماية بوك على السلاسل الجانبية إزالتها، وذلك يتم تحويل كل يسين من نوع بقايا ضمن تسلسل إلى بقايا أرجينين. في محاولة لضبط الخصائص الكيميائية والبيولوجية للمركبات، وضعنا طريقة تسمح وظيفة الموجبة مزدوجة (على سبيل المثال، N اليس وN الارجنتين) ليتم تضمينها في أي تسلسل peptoid تعطى للمرة الأولى. ²

هنا، نحن تصف التوليف، وتنقية وتوصيف TWس peptoids الرواية التي تحتوي على كل lysine- وأرجينين من نوع المخلفات في نفس تسلسل. يستخدم الأسلوب متعامد N -Boc وN -Dde الحماية على راتنج مع بيرازول-1-carboxamidine بمثابة كاشف guanidinylation. يوصف التقييم البيولوجي لهذه peptoids أيضا في المقايسات السمسة ضد الليشمانية المكسيكية، العامل المسبب لداء اللايشمانيا الجلدي. وهذا يوفر وسيلة عملية للوصول إلى peptoids مع وظيفة الموجبة المزدوجة وتقييم النشاط البيولوجي. ومن المتوقع أن هذه الطريقة سوف تساعد تركيب peptoids متقابلة الزمر من قبل المجتمع peptoid في المستقبل.

Protocol

1. المرحلة الصلبة توليف Peptoids

ملاحظة: يتم تصنيعه Peptoids يدويا باستخدام الإجراء submonomer من الصلبة مرحلة التوليف peptoid. وتسمح هذه الطريقة كفاءة اقتران عالية وجيدة غلة المنتج النهائي. التوليف على المرحلة الصلبة كما يسمح الكواشف الزائدة المراد إزالتها بسهولة في نهاية كل خطوة وتم تعديل طريقة هنا للسماح مختلفة أحادية الموجبة functionalized (أي نوع أرجينين ويسين من نوع المخلفات) ليتم تضمينها داخل نفسه تسلسل ^1،2

1. توليف peptoid الخطي
   تحذير: إجراء تقييمات السلامة قبل بدء التركيب. تنفيذ جميع ردود الفعل في غطاء الدخان وارتداء معدات الحماية الشخصية حسب الاقتضاء (أي قفازات النتريل المتاح، ونظارات السلامة ومعطف المختبر). تولي عناية خاصة عند استخدام الكواشف والمحاليل التالية. ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF) هو مشوه المشتبه بهم ودichloromethane (DCM) هي مادة مسرطنة. N، N '-diisopropylcarbodiimide (DIC) وتأكسد تشكل خطرا على العينين والجلد، عن طريق الاستنشاق التنفسي وقد تسبب حساسية الجلد. الهيدرازين هو مادة مسرطنة مشتبه بهم، قاتلا في حالة استنشاقه ويسبب حروق شديدة في الجلد أو العينين. برومو حمض الخل هو أيضا خطرة على الجلد والعينين والجهاز التنفسي ويمكن أن يسبب حروقا عند الاتصال. حمض Trifluoroacetic (TFA) هو سائل متقلبة ويمكن أن يسبب حروق شديدة جدا التعامل معها بحذر. ينصح القفازات الثقيلة.
   1. إضافة 0.12 ز محمية FMOC الراتنج تزلج أميد (0.1 مليمول والتحميل النموذجي 0.7 مليمول / ز) إلى توج عاء التفاعل 20 مل البولي بروبلين مع اثنين من فريتس. إضافة 5 مل ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF) إلى تضخم الراتنج وترك السفينة على الوقوف لمدة 60 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. استنزاف DMF باستخدام الصلبة مرحلة استخراج فراغ منصة.
   2. لdeprotect مجموعة FMOC على الراتنج منتفخة، إضافة 2 مل من محلول تأكسد (20٪ في DMF ت / ت). وضع السفينة علىمنصة شاكر في درجة حرارة الغرفة (450 دورة في الدقيقة) ويهز لمدة 5 دقائق. إزالة حل عن طريق محطة فراغ.
      1. كرر FMOC deprotection مع 2 مل من محلول تأكسد ويهز لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنزاف الحل كما كان من قبل.
   3. غسل الراتنج بإضافة 2 مل DMF وخلط الراتنج لمدة 30 ثانية. استنزاف DMF وكرر ثلاث مرات أكثر.
   4. لأستلة، إضافة 1 مل من محلول برومو حمض الخل (0.6 M في DMF) و 0.2 مل N، حل N '-diisopropylcarbodiimide (DIC، و 50٪ في DMF ت / ت). ترك السفينة رد فعل لزعزعة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنزاف حل ويغسل الراتنج مع 2 مل DMF ثلاث مرات.
   5. للتشريد، إضافة 1 مل من محلول أمين (1.5 M في DMF). يهز الراتنج لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنزاف حل ويغسل الراتنج مع 2 مل DMF ثلاث مرات.
      1. لإضافة الآرجنين من نوع مونومر، اتبع الخطوة 1.7. تبعا لتسلسل peptoid المطلوب، والأمينات مختلفةسوف تتم اضافته.
   6. كرر الخطوات من 1.1.4 و 1.1.5.
   7. لتشمل غوانيدين functionalized مونومر (أي، N الارجنتين)، إضافة 1 مل من محلول ديامين دون وقاية (1.5 M في DMF) إلى الراتنج ويهز لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      1. استنزاف حل ويغسل الراتنج مع 2 مل DMF ثلاث مرات.
      2. إضافة 2-acetyldimedone (0.2 غرام، 1 مليمول في 0.5 مل DMF، 10 يعادله) لإضافة مجموعة DDE إلى أمين الابتدائي المجاني ويهز لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استنزاف حل ويغسل الراتنج مع 2 مل DMF ثلاث مرات.
   8. مواصلة تجميع submonomer كما هو الحال في 1.1.4 إلى 1.1.7 حتى يتم إجراء تسلسل المرجوة. إضافة 2 مل DMF لغسل الراتنج وكرر ثلاث مرات.
   9. لdeprotect مجموعة DDE على الراتنج، إضافة حل الهيدرازين 4 مل 2٪ (في DMF ت / ت) ويهز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنزاف الحل وكرر ثلاث مرات.
   10. استنزاف حل ويغسل الراتنج مع 2 مل DMF ثلاثة ربرامج تحرير أسلوب الإدخال.
   11. إضافة بيرازول-1-carboxamidine (6 حكمه في الأمينات الحر، أي في أحادية N الارجنتين، في الحد الأدنى للحجم DMF) و N، N -diisopropylethylamine أو DIPEA (6 حكمه في الأمينات الحرة) ويهز في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة .
   12. استنزاف حل ويغسل الراتنج مع 2 مل ثنائي كلورو ميثان ثلاث مرات. ترك الراتنج لتجف في الهواء لمدة 10 دقيقة ثم الراتنج ويمكن تخزين حتى الانقسام (القسم 2).
   13. لإيقاف التوليف، وغسل الراتنج مع 2 مل DMF ثلاث مرات. إضافة 2 مل DMF، سدادة السفينة التوليف وترك في درجة حرارة الغرفة في غطاء الدخان.
       ملاحظة: قد يكون مؤقتا توليف بعد (قد يتم تشكيلها إلا الخطوة النزوح الثانية كما diketopiperazines) أي خطوة النزوح.
2. deprotection جنبا إلى سلسلة والانقسام من الراتنج
   1. إجراء يلتصق اختبار للتحقق من التقدم التوليف (نقاء والكتلة) في أي نقطة خلال التوليف بعد displaوقد اتخذت خطوات الأسمنت، إضافة أو إزالة DDE للحماية من جماعة أو بعد التسلسل النهائي.
      1. نقل ما يقرب من 10 الخرز الراتنج من وعاء التفاعل إلى 8 مل البولي بروبلين جديدة خرطوشة fritted.
      2. إضافة 1 مل من trifluoroacetic كوكتيل حمض الانقسام (التي تحتوي على 95٪ TFA 2.5٪ H ₂ O، و 2.5٪ triisopropylsilane) ويهز لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      3. تصفية انشقاق كوكتيل TFA من الراتنج باستخدام وعاء التفاعل fritted إلى 10 مل القاع جولة قارورة.
      4. تتبخر كوكتيل انشقاق باستخدام المبخر الدوار وتنحل النفط مما أدى إلى 1 مل الأسيتونتريل / المياه لتقديمها إلى LC-MS أو HPLC التحليلية.
   2. للانشقاق النهائي: في نفس fritted خرطوشة رد فعل البولي بروبلين المستخدمة لتركيب، إضافة 4 مل من الانقسام كوكتيل TFA (95٪ TFA 2.5٪ H ₂ O، و 2.5٪ triisopropylsilane) وتغطية السفينة. يهز لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   3. عشر فلترالبريد TFA انشقاق كوكتيل من الراتنج باستخدام وعاء التفاعل fritted إلى 50 مل القاع جولة قارورة.
   4. تتبخر كوكتيل انشقاق باستخدام المبخر الدوار. بعد أن تمت إزالة TFA، ينبغي الحصول على المنتج وللنفط. للمساعدة في إزالة TFA من هذا النفط الخام، إضافة ايثر 2 مل اللامائية وpeptoid ينبغي أن يعجل.
      1. إما إزالة ايثر عبر ماصة وتجاهل أو تتبخر باستخدام المبخر الدوار. كرر اثيل الأثير هطول ثلاث مرات.
   5. حل peptoid الخام في 10 مل الأسيتونتريل / يحمض المحلول المائي (50٪ الأسيتونتريل، TFA 0.1٪ في الماء ت / ت). نقل إلى وعاء وزنه قبل، وتجميد في 20 درجة مئوية، ويجفد إلى مسحوق جاف.

2. توصيف وتنقية

ملاحظة: يمكن رصد التوليف peptoid وpeptoid النهائي تقييمها عبر التحليلية عكس المرحلة HPLC باستخدام عمود C18 وايلectrospray الطيفي السائل اللوني (LC-MS). جميع المذيبات HPLC من المذيبات لLC-MS يجب الطازجة.

1. HPLC التحليلية
   1. تزن 1 ملغ من peptoid في قارورة زجاجية صغيرة. إضافة الحد الأدنى لحجم الأسيتونتريل حل وتمييع 1 مل مع الماء. تأكد من أن peptoid قد حلت تماما.
   2. ضخ 10 ميكرولتر إلى HPLC التحليلية (التدرج اقترح 0-100٪ المذيبات ب أكثر من 30 دقيقة، حيث المذيبات A = 95٪ ماء، و 5٪ الأسيتونتريل، 0.05٪ TFA وباء المذيبات = 95٪ الأسيتونتريل والمياه بنسبة 5٪، 0.03٪ TFA) ، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
   3. تصور طيف الأشعة فوق البنفسجية في 220 نانومتر.
2. ESI LC-MS
   1. جعل 1 ملغ / مل حل peptoid كما في الخطوة 2.1.1.
   2. حقن 1 ميكرولتر إلى electrospray LC-MS إلى تحديد ما إذا كان الوزن الجزيئي للpeptoid الهدف هو الحاضر، وذلك باستخدام تعليمات الشركة الصانعة.
   3. تحقق كتلة الهدف من تسلسل peptoid باستخدام peptآلة حاسبة OID، وفقا للتعليمات على آلة حاسبة. ²⁶ كما يسمح هذه الأداة على شبكة الإنترنت تعيين أي حذف المنتجات / إضافة ينظر في الطيف الشامل. ²⁶
3. إعدادي عكس المرحلة HPLC
   1. حل peptoids الخام إلى 2 مل المحمضة المياه / الأسيتونتريل (الماء 95٪، 5٪ MeCN، 0.1٪ TFA) وتنقية من إعدادي RP-HPLC باستخدام بروتوكول الشركة الصانعة. تحديد التدرج في الوقت شطف تم الحصول عليها من HPLC التحليلية والكمية المحقونة سوف تعتمد على أبعاد العمود.
   2. تصور باستخدام كاشف وضعت في 220 نانومتر.
   3. جمع الكسور في 15 مل أنابيب الطرد المركزي، وتجميد في 20 درجة مئوية، ويجفد.
   4. إعادة تحليل الكسور باستخدام LC-MS وHPLC التحليلية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. إعادة تجميع كسور النقاء.

3. اختبار البيولوجية ضد الليشمانية المكسيكية الطفيليات

كاووتصنف يجب أن يتم تقييم السلامة من قبل بدء تركيب المكسيكية الليشمانيا خطرا المجموعة 2 الممرض في المملكة المتحدة وتدابير الرقابة الكافية يجب أن تكون في المكان قبل بدء الاختبار: نشوئها. يجب أن تتم جميع الأعمال في فئة 2 خزانة السلامة الميكروبيولوجية ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة البالية والمناسبة (أي قفازات النتريل، ونظارات السلامة ومعطف المختبر).

1. ثقافة فرعية من الطفيليات
   1. تذويب 1 مل -150 ° C الأسهم المجمدة الليشمانية المكسيكية M379 عن طريق وضع قنينة في 37 ° C حمام الماء لمدة 30 ثانية.
   2. نقل محلول المخزون إلى 10 مل المتوسطة الحشرات شنايدر (في درجة الحموضة 7.0 تستكمل مع 15٪ للحرارة المعطل مصل بقري جنيني و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين) في 25 سم ³ خلية قارورة الثقافة مع سقف عدم تنفيس.
   3. احتضان عند 26 درجة مئوية لمدة 72 ساعة.
   4. دراسة الطفيليات تحت المجهر (400X التكبير) للتحقق الشرط. عشريجب أن تكون إرنست و يونغ السوطي مرحلة الحشرات، وأشكال procyclic في مرحلة سجل مع العديد من الخلايا المنقسمة.
   5. الحفاظ على السوطي procyclic عن الطفيليات زراعة الفرعية إلى تركيز 5 × 10 ⁵ الطفيليات / مل كل ثلاثة أيام. عد الخلايا باستخدام تحسين عدادة الكريات نويباور.
2. التحول من L. المكسيكية مرحلة الحشرات في الثدييات مرحلة ممحوضة شكل يشمانة ²⁷
   1. اليوم 0: إعداد 10 مل ثقافة الطفيليات مرحلة سجل في 5 × 10 ⁵ الطفيليات / مل في المتوسط الحشرات شنايدر (في درجة الحموضة 7.0 تستكمل مع 15٪ للحرارة المعطل الجنين مصل الأبقار و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين) في 25 سم ³ خلية قارورة الثقافة مع غطاء غير تنفيس.
   2. احتضان عند 26 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
   3. يوم 3: نقل 10 مل الثقافة إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في 447 x ج لمدة 5 دقائق.
   4. تخلصي من المتوسط ​​القديم وإضافة 10 مل المتوسطة الحشرات شنايدر (في درجة الحموضة 5.5 تستكمل مع 20٪ حأكل المعطل الجنين مصل بقري و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين). resuspend بلطف بيليه من الطفيليات في هذه الوسيلة الجديدة باستخدام ماصة.
   5. حساب عدد من الطفيليات باستخدام تحسين عدادة الكريات نويباور. تمييع إلى تركيز 5 × 10 ⁵ الطفيليات / مل مع الرقم الهيدروجيني 5.5 المتوسطة ونقل إلى 25 سم ³ خلية قارورة الثقافة.
   6. احتضان عند 26 درجة مئوية لمدة حوالي 6 أيام.
   7. يوم 9: فحص الطفيليات تحت المجهر (400X). ينبغي أن تكون في عدم تكرار، المعدية مرحلة المشيقة metacyclic.
   8. حساب عدد من الطفيليات باستخدام تحسين عدادة الكريات نويباور. تمييع إلى تركيز 5 × 10 ⁵ الطفيليات / مل مع الرقم الهيدروجيني 5.5 المتوسطة.
   9. إزالة 10 مل من زراعة الخلايا ونقل إلى قارورة ثقافة الخلية. احتضان عند 32 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
   10. اليوم 14: تحقق ظهور طفيليات تحت المجهر (400X). ينبغي أن تكون في مرحلة يشمانة المسببة للأمراض، تفتقر إلى الطابع السوطISTIC من السوطي، وعلى استعداد لفحص.
3. فحص السمية الخلوية على L. المكسيكية amastigotes ممحوضة.
   ملاحظة: الاختبارات البيولوجية من peptoids تستخدم فحوصات عالية الإنتاجية التي نفذت في 96 لوحات جيدة. يصف هذا البروتوكول اختبار L. ويمكن أيضا أن يتم المكسيكية amastigotes ممحوضة، لكن فحوصات مماثلة من على الطفيليات مرحلة المشيقة في وسائل الإعلام المناسبة. يتم تحضين المركبات مع الطفيليات بتركيزات 3-100 ميكرون لمدة 60 دقيقة ثم حضنت لمدة 24 ساعة بعد التخفيف 10 أضعاف. وارتفع النتائج وقياس مضان من الآبار بعد الحضانة مع الحل بقاء الخلية على أساس ريسازورين (على سبيل المثال، alamarBlue).
   1. إعداد حلول الأوراق المالية المركبة. تزن من 1 ملغ من المنتج peptoid النقي النهائي باستخدام الميزان التحليلي. إضافة حجم مناسب من البيولوجيا الجزيئية الصف dimethylsulphoxide ([دمس]) إلى تركيز 5 ملم. جعل 6 مكل وتجميد في -20 درجة مئوية.
   2. إعداد حلول المجمع على 96 لوحات جيدة (يمكن أن ينظر إلى تخطيط لوحة الموصى بها في قسم النتائج، الشكل 6) في ثلاث نسخ 100-3 ميكرومتر. إضافة 2 ميكرولتر من 5 ملم حل سهم كل مجمع في الصف العلوي (أي، أ). إضافة 48 ميكرولتر الطازجة المتوسطة الحشرات شنايدر (في درجة الحموضة 5.5 و 20٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / S)) إلى الصف العلوي باستخدام ماصة متعدد القنوات. إضافة 25 ميكرولتر المتوسطة الحشرات شنايدر لجميع الصفوف الأخرى (B - F).
      1. تنفيذ التخفيف المتسلسل من قبل pipetting 25 ميكرولتر حل من الصف العلوي. إضافة إلى الصف التالي وتخلط. تنفيذ التخفيفات حتى الصف الأخير، حيث يجب أن يتم تجاهل الماضي حل 25 ميكرولتر.
      2. استخدام أمفوتيريسين ب (5 أسهم ملم) كعنصر تحكم إيجابية وDMSO (2٪ محلول) كعنصر تحكم السلبية في ثلاث نسخ.
   3. يعد حل الطفيلي: ثقافة نقل إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل وأجهزة الطرد المركزي في447 x ج لمدة 5 دقائق. تخلصي من المتوسط ​​القديم وإضافة 10 مل المتوسطة شنايدر الحشرات (في درجة الحموضة 5.5 و 20٪ FBS، 1٪ P / S).
   4. حل بلطف بيليه من الطفيليات في هذه الوسيلة الجديدة باستخدام ماصة والعد باستخدام تحسين عدادة الكريات نويباور. تمييع الثقافة إلى 8 × 10 ⁶ الطفيليات / مل.
   5. إضافة 25 ميكرولتر L. الثقافة المكسيكية إلى كل بئر. احتضان لوحات لمدة 60 دقيقة في 32 درجة مئوية.
   6. إزالة لوحة من الحاضنة وإزالة حل 40 ميكرولتر من كل جانب.
   7. إضافة 90 ميكرولتر متوسطة جديدة واحتضان لمدة 24 ساعة على 32 درجة مئوية.
   8. إضافة 10 ميكرولتر أساس ريسازورين-حل بقاء الخلية إلى كل بئر. احتضان لمدة 4 ساعات في 32 درجة مئوية.
   9. قياس مضان باستخدام قارئ لوحة (λ _السابق = 540 نانومتر، λ _م = 600 نانومتر)، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحليل البيانات عن طريق إزالة متوسط ​​الخلفية (من المتوسط ​​الآبار فقط) ومقارنة مضان من الآبار بعد تطبيع مع الاحترام لركان دمس الضوابط.

النتائج

نتيجة التمثيلية، والتوليف وتوصيف اثنين 12 peptoids بقايا تحتوي على اثنين أحادية يسين من نوع والنوع الثاني أرجينين أحادية سوف يمكن وصفها كل. وأظهرت أيضا نتائج لاحقة من فحص السمية الخلوية.

اثنين peptoids [(N nArg N جمعية مهندسي البترول N جمعية مهندسي البترول) (N عبد اللطيف N جمعية مهندسي البترول N جمعية مهندسي البترول)] ₍₂₎ (أ) و [(N hArg N جمعية مهندسي البترول N جمعية مهندسي البترول) (N اليس N جمعية مهندسي البترول N جمعية مهندسي البترول)] ₍₂₎ تم توليفها (ب) باستخدام 120 ملغ تزلج أميد الراتنج كل (تحميل = 0.79 مليمول / ز). نفذت جميع الخطوات أستلة والنزوح خارج كما هو موضح أعلاه، مع كل الكواشف التي تم شراؤها تجاريا. لهذه المخلفات، تم استخدام الأمينات التالية في خطوة النزوح: N جمعية مهندسي البترول (S) - (-) - α-methylbenzylamine، N عبد اللطيف N - (ثلاثي -butoxycarbonyl) -1،2-بقطرinoethane، N اليس N - (ثلاثي -butoxycarbonyl) -1،4-diaminobutane. بالنسبة للبقايا مشتقة أرجينين، ويقترن diamines غير المحمية التالية: N hArg 1،4-diaminobutane أو N nArg 1،2-diaminoethane، تليها الحماية على الراتنج مع 2-acetyldimedone (DDE-OH). بعد أن تم توليفها تسلسل كامل، الهيدرازين deprotection من DDE غلة الأمينات حرة في guanidinylate.

الشكل 1. الهياكل Peptoid (أ) [(N nArg N جمعية مهندسي البترول SPE N) (N عبد اللطيف N جمعية مهندسي البترول SPE N)] ₍₂₎ و (ب) [(N hArg N جمعية مهندسي البترول SPE N) (N نانوغرام> اليس N جمعية مهندسي البترول SPE N)] _(2). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. الطريقة المستخدمة لتجميع مختلطة peptoids أرجينين / يسين. ط. خطوة النزوح القياسية في طريقة submonomer مع ديامين. ثانيا. إضافة DDE-OH، 90 دقيقة لحماية أمين الحرة؛ ثالثا. المزيد من الإضافات لتمديد سلسلة peptoid باستخدام طريقة submonomer. د. Deprotection من DDE باستخدام 2٪ الهيدرازين في DMF. الخامس Guanidinylation من أمين الحرة على راتنج مع بيرازول-1-carboxamidine وDIPEA في DMF. السادس. انشقاق الحمضية من الراتنج وdeprotection الجماعات بوك.large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وبعد انشقاق من الراتنج وتجفيد، تم الحصول على منتجات النفط الخام كما مساحيق بيضاء: (أ) 154 ملغ، (ب) 163 ملغ. وتنقيته المنتجات عن طريق RP-HPLC كما هو موضح مع أقصى 50 ملغ الحقن باستخدام مضخة LC مع كاشف الأشعة فوق البنفسجية تجاه (λ = 250 نانومتر) على العمود التحليلي، 250 مم × 10 مم، و 5 ميكرون. معدل التدفق = 2 مل / دقيقة. كسور المقابلة لكتلة الهدف تم الجمع والحصول على مثل مساحيق بيضاء: (أ) 54 ملغ (ب) 65 ملغ، والمحاصيل النهائية من ما يقرب من 30٪ لكسور> 90٪ نقية.

تم تأكيد هوية مجمع النهائية بعد تنقية بواسطة LC-MS (انظر الشكل 3) باستخدام مطياف الكتلة الثلاثي رباعية مزودة UPLC وكاشف الضوئي مجموعة. أجري قياس الطيف الكتلي دقيقة باستخدام نفس مطياف على ر كان [M + 2H] ²⁺ الأيونات. وفيما يلي حساب وعثر على الجماهير الملحوظة في وثيقة الاتفاق (الشكل 4): (أ) تحسب = 896.0026 اتحاد المغرب العربي، لاحظ = 896.0038 اتحاد المغرب العربي. (ب) المحسوبة = 952.0691 اتحاد المغرب العربي، لاحظ = 952.0730 اتحاد المغرب العربي.

الشكل 3. LC-MS لpeptoids النقاء. (أ) م / ض = 1792 و (ب) م / ض = 1903. حيث الجزء العلوي هو TIC والمتوسطة LC-MS الطيف، أسفل اللوني للأشعة فوق البنفسجية في 220 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. دقيقة البيانات مطياف الكتلة لpeptoids (أ) و (ب)."https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تقييم نقاء المنتج باستخدام التحليلية RP-HPLC (مضخة LC مع كاشف الأشعة فوق البنفسجية تجاه على العمود التحليلي، 4.6 مم × 100 مم، 3.5 ميكرون، معدل التدفق = 1 مل / دقيقة)، وتصور في 220 نانومتر، الامتصاصية من أميد العمود الفقري. ويوضح الشكل 5A و5B أن مركبات متجانسة.

الشكل 5. التحليل HPLC لpeptoids النقاء (أ) و (ب). وهناك التدرج 0-100٪ B أكثر من 30 دقيقة، العمود الفرن على 40 درجة مئوية (A = 95٪ H ₂ O، و 5٪ MeCN، 0.05 ٪ TFA؛ B = 95٪ MeCN، 5٪ H ₂ O، 0.03٪ TFA) الرجاء CLإك هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم اختبار peptoids النقاء (أ) و (ب) في المقايسات السمسة ضد L. المكسيكية amastigotes ممحوضة. الأسهم المجمدة من L. وإذابة المكسيكية وتحويلها إلى مرحلة يشمانة جاهزة للفحص. بعد 72 ساعة إزالة الجليد، وينبغي أن تكون الطفيليات السوطي مرحلة الحشرات في شكلها procyclic، في مرحلة سجل مع العديد من الخلايا المنقسمة. في هذه المرحلة يمكن أن تتحول الطفيليات في مرحلة يشمانة باستخدام الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة التحول وصفها. ²⁷ في يوم 9 من التحول، فإن الطفيليات تكون في المرحلة المعدية المشيقة metacyclic غير تكرار. وأخيرا في يوم 14، وينبغي أن تكون الطفيليات في مرحلة يشمانة المسببة للأمراض التي تفتقر فيها الطفيليات وسياط مميزة من السوطي ²⁸

وقدمت 5 الحلول الأسهم ملم من المركبات في الثقافة خلية الصف DMSO واختبارها في يثلث علىتم جمع ما لا يقل عن مرتين للتأكد من مجموعة بيانات قوية. ويرد خطة لوحة 96-جيدا ممثل في الشكل 6. وفي نهاية الفحص، تم إضافة كاشف بقاء الخلية إلى كل بئر ومضان تم قياس كما هو موضح لحساب الجدوى من الطفيليات في كل تركيز اختبار (انظر الشكل 7 ). حسبت ED ₅₀ القيم كما peptoid (أ)> 100 ميكرومتر و (ب) peptoid 37 ميكرومتر على التوالي. أشرطة الخطأ تآمر، وتبين الاختلاف بين الآبار كما انحراف معياري ويمكن أن نرى أن هذه هي معقولة بالنسبة لمعظم الحانات.

الرقم 6. ممثل 96 خطة لوحة جيدا لفحص السمية الخلوية في 2 الحلول peptoid (بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية). ميد + = المتوسطة (شنايدر الحشرات متوسطة، ودرجة الحموضة 5.5، و 20٪ FBS، 1٪ P / S). L. المكسيك. =8 × 10 ⁶ / مل ثقافة الطفيلي في المتوسط +. AmphoB = 5 ملم في DMSO. Peptoid = 5 المحلول ملم في DMSO. وينبغي أن تتضمن آبار فارغة الماء المعقم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7. نتائج من فحص السمية الخلوية ضد L. المكسيكية ممحوضة الطفيليات يشمانة باستخدام peptoid (أ) و (ب). ويمكن أن ينظر إلى أن peptoid (ب) هو أكثر فعالية من peptoid (أ) في خفض نسبة الطفيليات قابلة للحياة، مع كل من المركبات التي لها تأثير تعتمد الجرعة. أشرطة الخطأ تآمر تظهر التباين بين الآبار كما انحراف معياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

يتزايد درس Peptoids داخل البيولوجيا الكيميائية وحقول الكيمياء الطبية في تطبيقات مثل علاجات جديدة ^3-5، وكلاء تسليم خلية ^18،20 وأدوات التشخيص. ²⁹ عادة، وهذه السلاسل هي الموجبة لتوفير قدر من الانتقائية لالممرض على خلايا الثدييات، والقدرة على اختراق أغشية الخلايا، وكذلك مساعدة الذوبان في النظم المائية. وهناك العديد من الأمثلة على peptoids الموجبة التي تحتوي على بقايا lysine- أو أرجينين المحاكاة فقط في الأدب. ومع ذلك، حتى الآن، فقد تأخر تركيب peptoids التي تحتوي على كل من هذه المخلفات الموجبة في نفس تسلسل عدم وجود إجراءات الاصطناعية مناسبة. بروتوكول صفها هنا يسمح peptoids الموجبة المختلطة إلى أن توليفها بطريقة فعالة وغير مرغوب فيه للغاية، حيث أنها توفر طريقا لتعديل الخصائص البيولوجية والكيميائية للpeptoids متقابلة الزمر.

الإقليم الشمالي "> يستخدم أسلوب لدينا على التكيف مع التوليف peptoid submonomer شائعة الاستخدام ويسمح بإضافة كلا أحادية lysine- وأرجينين من نوع في نفس التسلسل. ويستخدم وصلات درجة حرارة الغرفة، وأنشأ حماية الكيمياء مجموعة بحيث من المتوقع أن هذه الطريقة سوف يكون من المفيد بالنسبة لغالبية المجموعات البحثية لإضافة حماية المتعامدة للأرجينين من نوع بقايا، يتم إضافة ديامين دون وقاية في ظل ظروف النزوح القياسية ثم محمية في اقتران لمدة 60 دقيقة مع DDE-OH. مجموعة متنوعة من diamines يمكن أن يكون تستخدم والذي يسمح السلاسل الجانبية من 2 إلى 6 الكربون الكربون طويلة ليتم تثبيتها، أي 1،2-diaminoethane إلى 1،6 diaminohexane على التوالي، وحماية DDE-OH يذوب جيدا في DMF وهي مجموعة فعالة جدا وانتقائية حماية ل الأمينات الأولية. يترك المجموعة DDE حماية الأمينات الثانوية تتأثر، على سبيل المثال، محطة N غير المحمية من سلسلة peptoid ³⁰ واحد الحد هو أن جميع اصطناعيأجري أطروحة يدويا. ومع ذلك، فمن المتوقع أن الظروف اقتران المتقدمة تجعل طريقة قابلة للاستخدام مع الببتيد / تخليق peptoid الآلي.

والاضطلاع على الراتنج deprotection من DDE الجماعات باستخدام محلول الهيدرازين 2٪ في DMF إلى ترك الأمينات الحرة التي يمكن guanidinylated على الراتنج باستخدام بيرازول-1-carboxamidine. وتستخدم ستة حكمه من بيرازول-1-carboxamidine وستة في حكمه من DIPEA في الأمينات الحرة على الراتنج (أي ستة المعادل لكل نوع مونومر N الارجنتين ليتم تثبيتها). مرة أخرى، هذا التفاعل هو أيضا كفاءة وكاشف بيرازول-1-carboxamidine ديه القابلية للذوبان جيد في DMF. وعادة ما ينظر إلى الانتهاء من رد فعل عن طريق LC-MS بعد 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

نظرا لبراعة الأسلوب submonomer، ومجموعة متنوعة واسعة من الأمينات الأولية يمكن أن تستخدم في خطوة النزوح حتى قد تحتاج الظروف أن يكون الأمثل لزيادة اقتران ايفيالمشمول وعائدات المنتج الشاملة أو النقاء. ³¹ لمتواليات التي نوقشت أعلاه، لم تكن هناك أية شروط خاصة اللازمة لصلات ناجحة. ومع ذلك، مرة النزوح أطول أو تركيزات أمين أعلى يمكن أن تستخدم إزاحة إشكالية (أي لالأمينات أليفة النواة أو ضخمة sterically سيئة). قد لا تكون بعض الأمينات القابلة للذوبان تماما في DMF، وفي هذه الحالة ينصح بحل هذه في N -methyl-2-pyrrolidone (NMP)، أو غيرها من المذيبات المناسبة للتفاعلات المرحلة الصلبة بدلا من ذلك كما هو الحال في أسلوب شامل السابق لتخليق submonomer من peptoids ³² لدمج مونومرات التي تحتوي على ذرة غير متجانسة غير المحمية في السلاسل الجانبية، أستلة باستخدام حمض الكلوروأسيتيك وقد تبين أن تكون فعالة من قبل جماعات أخرى. ³³ وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام راتنجات أخرى مع هذه الطريقة لانتاج peptoids مع مختلف functionalization C محطة. وانغ الراتنج وتستخدم راتنجات كلوريد 2-chlorotrityl بشكل روتيني فيالتوليف submonomer من peptoids. على سبيل المثال، تم استخدام هذا الأسلوب بنجاح مع راتنج كلوريد 2-chlorotrityl في مجموعتنا. ^و2 دعامات مختلفة الصلبة تتطلب إجراء تحميل مختلف لمناقشته تزلج أميد هنا (هذا يعتمد على الراتنج المحددة المستخدمة) لذلك هذا يجب أن يتم التحقق مع الأدب قبل التوليف.

على غرار الببتيد التوليف، والظروف للانشقاق النهائي من الراتنج peptoid قبالة يمكن أيضا أن يكون الأمثل لتسلسل معين. في هذا البروتوكول، تم استخدام الانقسام كوكتيل TFA (مع triisopropylsilane والمياه كما الزبالين). وpeptoids المقدمة هنا احتوت فقط حماية بوك وهي مجموعة عطوب الحمضية بشكل معقول. لضمان deprotection كاملة من متواليات مع نسبة أكبر من مخلفات المحمية أو أقل حمض حماية عطوب مجموعات، مرة انشقاق أطول قد تكون ضرورية (أي، ينصح مرات الانقسام ما يزيد على 2 ساعة لمتواليات التي تحتوي على PBF أو العالي-بوTYL استر الجماعات المحمية). ويمكن أيضا أن الزبالين بديلة يمكن استخدامها لسلاسل الجانب المتخصصة (على سبيل المثال، ethanedithiol أو 2 المركابتويثانول غالبا ما تستخدم في الببتيدات التي تحتوي على الكبريت السلاسل الجانبية مثل السيستين أو الميثيونين).

الفحص البيولوجي قدم هو اختبار السمية الخلوية القياسية والتي يمكن تغييرها لتتناسب مع خطوط مختلفة من الخلايا. من المهم أن نلاحظ أن كل لوحة 96-جيدا وينبغي أن تتضمن ضوابط كافية للسماح الثقة في النتائج التي تم الحصول عليها. في هذه الحالة، يتم استخدام الأمفوتريسين B كعنصر تحكم إيجابية كما هو دواء معروف يستخدم لعلاج المرض، ويستخدم DMSO كعنصر تحكم السلبية لأن هذا هو مذيب يستخدم لصنع أسهم مجمع للفحص. إذا كان يتم استخدام خطوط الخلايا الأخرى، ينبغي الحصول البديلة، والضوابط المناسبة والتحقق من صحتها قبل الاستخدام. L. وحضنت المكسيكية مع peptoid بتركيزات تتراوح بين 100 و 2 ميكرومتر لمدة ساعة واحدة، ثم يتم تخفيف الطفيلي / حل peptoid بواسطةعامل عشرة للحضانة بين عشية وضحاها (أي الآبار في البداية مع 100 ميكرومتر الأسهم peptoid مخففة إلى 10 ميكرومتر).

يتم إضافة كاشف بقاء الخلية على كل جانب (10٪ من إجمالي حجم جيد) في نهاية الفحص. وينظر الى تغير لونها واضح بين الآبار مع الطفيليات قابلة للحياة (وردي)، آبار المراقبة مع عدم وجود الطفيليات قابلة للحياة (الأزرق) وطيف واسع بين بأرقام المتوسطة من الطفيليات قابلة للحياة. مضان يتناسب مع عدد من الخلايا الحية ويتوافق مع النشاط الأيضي للخلايا. يتم تحويل ريسازورين صبغ (غير فلوري) إلى resorufin الفلورسنت من خلال ردود الفعل انخفاض في خلايا نشطة عملية الأيض. ³⁴ في هذا الاختبار، وقد تم تحسين فترة حضانة مع كاشف بقاء الخلية لL. المكسيكية. حضانة مرات مع كاشف الجدوى سوف تختلف عن لوحات المصنفة في تركيزات مختلفة من الخلايا أو مع خطوط مختلفة من الخلايا (على سبيل المثال يمكن أيضا استخدام هذا الأسلوبمع خلايا الثدييات). تعتمد على قارئ لوحة المحدد المستخدمة، يجب القيام بها قبل اتخاذ القياسات مضان الاعتبارات. يجب إزالة أي فقاعات الهواء في الآبار لضمان قراءات دقيقة يمكن اتخاذها. بعض القراء لوحة قراءة من الجزء السفلي من لوحات، وفي هذه الحالة القاع المسطح ينبغي أن تستخدم 96 لوحات جيدا. أجهزة أخرى قد يقرأ من الجزء العلوي من لوحة، لذلك يجب إزالة غطاء لوحة قبل القياس.

وأخيرا، في المستقبل، قد يكون هذا البروتوكول متوافق مع المزج الآلي التي هي قادرة على صنع العديد من تسلسل في نفس الوقت. بالإضافة إلى ذلك، توليف peptoids دوري من الممكن أيضا استخدام هذا الأسلوب. هذا البروتوكول ينبغي أن توفر للباحثين إجراء الاصطناعية العملي التي يمكن استخدامها للوصول إلى السقالات peptoid جديدة مع كل من lysine- وأرجينين من نوع أحادية، والتي قد تكون مفيدة في العديد من التطبيقات، بما في ذلك المواد أو المجالات الطبية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits	Crawford Scientific	12131017 and 12131015	20 ml and 6 ml cartridges used in this preparation
Trifluoroacetic acid	Tokyo Chemical Industry (Europe)	T0431-100g	>98%; CAUTION: can cause severe burns and respiratory irritation
N,N'-diisopropylcarbodiimide	Sigma Aldrich	38370-100ML	>98%; CAUTION: hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation
Dimethylformamide	Fischer Scientific	10346180	HPLC grade; CAUTION: suspected teratogen
Acetonitrile	Fischer Scientific	10407440	HPLC grade
Dichloromethane	Fischer Scientific	10354263	99.8%; CAUTION: suspected carcinogen
Bromacetic acid	Sigma Aldrich	17000-100G	>99%; CAUTION: causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract
(S)-(-)-alpha methylbenzylamine	Sigma Aldrich	115568-100G	98%; CAUTION: harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer
N-Boc 1,4-diaminobutane	Tokyo Chemical Industry (Europe)	A1373-25g	>98%; CAUTION: causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer
N-Boc 1,2-diaminoethane	Tokyo Chemical Industry (Europe)	A1371-25g	>97%; CAUTION: causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer
1,2-diaminobutane	Sigma Aldrich	D13208-100G	99%; CAUTION: flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer
1,4-diaminoethane	Sigma Aldrich	03550-250ML	>99.5%; CAUTION: flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer
1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl	Sigma Aldrich	402516-10G	as HCl salt; CAUTION: harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage
Hydrazine monohydrate	Sigma Aldrich	207942-5G	reagent grade; CAUTION: suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes
2-acetyl dimedone	Novabiochem	8510150005	Dde-OH
Rink Amide resin	Novabiochem	8551190005	100-200 mesh, high loading
Piperidine	Sigma Aldrich	411027-1L	>99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION: highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects
Triisopropylsilane	Sigma Aldrich	233781-50G	98%; CAUTION: flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation
alamarBlue	ThermoFischer	DAL1025	Not classified as hazardous
Schneider's Insect Medium	Sigma Aldrich	S9895-1L	Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays
96 well plates	VWR	734-1793	Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated
Solvent reservoirs	VWR	613-1182	Used with multi channel pipette
Multi channel pipette	Eppendorf	3122000043
Pipette tips	Starlab Group	S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810	Volume of tip dependent on pipette used. 10 µl, 10 - 200 µl and 1,000 µl recommended for assays
25 cm3 cell culture flasks	VWR	734-2312
50 ml centrifuge tubes	VWR	525-0791
dimethylsulphoxide (molecular biology grade)	Sigma Aldrich	D8418-50ML	Not classified as hazardous
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	ThermoFischer	10082139-100mL	Gibco
Penicillin/Streptomycin	ThermoFischer	15140148-20mL	Abbreviation: P/S
Amphotericin B	Sigma Aldrich	46006-100mg	Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard