التصوير من التعديلات خلية الشكل والحركة الخلية في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; المعيدة عن طريق DE-كادهيرين مراسل الذباب المعدلة وراثيا

Summary

Herein we describe a procedure to capture live images of Drosophila gastrulation. This has enabled us to better understand the apical constriction involved in early development and further analyze mechanisms governing cellular movements during tissue structure modification.

Abstract

تكون المعيدة هي أول مجموعة من الفعاليات الحيوية شكليا التي تحدث أثناء التطور الجنيني من الحيوانات متعددة الخلايا مثل ذبابة الفاكهة. يتم التعرف على هذا التغيير الصرفي أيضا الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT). ويرتبط ديسريغولاتيون من EMT يعانون من التليف والانبثاث السرطان. وهناك أدلة الناشئة التي EMT مسيطر عليها من قبل عدد من الآليات الجزيئية. على هذا النحو، فإن العديد من الجينات الرئيسية التي تتحكم في انقباض قمي ومن المعروف أيضا أن يكون من العوامل الهامة في EMT لوحظ في الانبثاث السرطان. مثل EMT خلال ذبابة الفاكهة تكون المعيدة، الخلايا الظهارية يمكن أن يتسبب في تغيير شكلها وإعادة برمجتها لإعادة توجيه مصير خلية تجاه مختلف أنواع الخلايا الأخرى. هنا نقدم طريقة التصوير قوية من ذبابة الفاكهة تكون المعيدة لفحص بدء الحركات الخلوية التخلق وتحديد مصير الخلايا خلال هذه المرحلة من التطور الجنيني. باستخدام هذه الطريقة، أن نحدد جالذراع إعادة ترتيب في وقت تكون المعيدة وإظهار أهمية انقباض قمي خلال المعيدة باستخدام GFP المسمى DE-كادهيرين.

Introduction

تكون المعيدة هي أول مجموعة من الفعاليات الحيوية شكليا التي تحدث أثناء التطور الجنيني من الحيوانات متعددة الخلايا مثل ذبابة الفاكهة ^1،2. ومن المثير للاهتمام، شواهد تشير إلى أن هذه العملية ينظم من خلال التفاعل بين الآليات الميكانيكية والجزيئية ^3. وعلاوة على ذلك، هو تورط الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT)، وهي عملية حاسمة في تكون المعيدة، وأيضا في عمليات الأمراض البشرية مثل سرطان خبيث ^4-8. على هذا النحو، فإن العديد من الجينات التي تتحكم في انقباض قمي ومن المعروف أيضا أن تكون العوامل الرئيسية في EMT لوحظ في سرطان خبيث ^9. وهكذا، انقباض قمي في وقت تكون المعيدة هو نموذج ممتاز للتحقيق في الآليات التنظيمية المشار إليها وتعزيز فهمنا لورم خبيث من السرطان. والاستفادة من هذه التقنية هو أن نتمكن من مراقبة حركة الخلية في وقت تكون المعيدة في الوقت الحقيقي، وبالتالي، سنكونقادرة على فحص الجينات المسؤولة عن تكون المعيدة وكذلك الانبثاث سرطان.

على الرغم من أن غير معروف نسبيا، ويعتقد التصاق الخلية الى خلية للعب دور مركزي في انقباض القمي ^1. علم الوراثة ذبابة الفاكهة هي مناسبة تماما للتحقيقات واحدة على مستوى الخلية استكشاف الآليات الجزيئية التنظيمية. وهذا النموذج سوف تمكننا من كشف أهمية انقباض قمي خلال المعيدة. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لفحص الجينات المسؤولة في الانبثاث السرطان. والتقاط الصور الحية من ذبابة الفاكهة تكون المعيدة مزيد مكنتنا من فهم بمزيد من التفصيل الآليات الجزيئية التي تحكم إعادة ترتيب الأنسجة. هنا، ونحن نقدم وصفا شاملا لطريقة بسيطة لتحقيق ذلك.

Protocol

ملاحظة: الذباب المعدلة وراثيا المستخدمة في هذه الدراسة ما يلي: DE-نذل :: GFP ^10.

1. إعداد أبل لوحة

1. تحضير خليط من 12.5 غ أجار، 125 مل 100٪ المتاحة تجاريا عصير التفاح، 12.5 غرام جلوكوز، و 375 مل H ₂ O. حرارة المزيج في الميكروويف وسكبه في 3 سم طبق ثقافة الخلية. تخزين الخليط في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل.
2. بعد إعداد لوحة التفاح، إضافة طبقة رقيقة من معجون معجون الخميرة على أعلى من ذلك للسماح للالذباب لوضع البيض.

2. الأجنة إعداد وبروتوكول تصوير لايف

1. وضع حوالي 50 الذباب (25 ذكور و 25 إناث) في زجاجة للتزاوج ووضع البيض في وقت لاحق بين عشية وضحاها على لوحة التفاح المشمولة في خميرة تعجن. تعيين لوحة عصير التفاح في فم الزجاجة. إبقاء زجاجة رأسا على عقب في حاضنة. التفاف الزجاجات البلاستيكية الأسهم ذبابة الفاكهة بورق الألمنيوم للمطالبة عشرالبريد الذباب لوضع المزيد من البيض.
2. في صباح اليوم التالي، تحل محل القديمة لوحة عصير التفاح مع واحدة جديدة.
3. اسمحوا الذباب تضع البيض لمدة 3 إلى 4 ساعات بواسطة التفاف زجاجة مع رقائق الألومنيوم.
4. بعد ثلاث إلى أربع ساعات، وجمع الأجنة في مصفاة الجنين من لوحة عصير التفاح باستخدام فرشاة أو القطن سيئة وغسلها مع برنامج تلفزيوني. غسل الأجنة 2-3 مرات مع برنامج تلفزيوني في أطباق ثقافة 12-جيدا.
5. Dechorionate الأجنة مع التبييض 50٪ لمدة 5 دقائق في أطباق ثقافة 12-جيدا.
6. بعد عملية dechorionation، وغسل الأجنة 2-3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
7. نقل الأجنة إلى صحن ثقافة الخلية 3 سم تحتوي على برنامج تلفزيوني ثم اختر المرحلة 5 الأجنة تحت المجهر استنادا إلى مستوى من الشفافية في حدودها. ماصة للأجنة نظموا باستخدام 200 ميكرولتر ماصة.
8. بعد ذلك، وضع اثنين من الأجنة المختارة على ساترة الزجاج، وإزالة الزائد برنامج تلفزيوني مع المناديل الورقية الملتوية ناعما. توجيه الأجنة الجانب الظهري حتى علىساترة باستخدام المناديل الورقية الملتوية ناعما. بعد ذلك، ونعلق الأجنة إلى ساترة الزجاج مع الشحوم السيليكون باستخدام إبرة رفيعة والمناديل الورقية الملتوية.
9. إضافة قطرة صغيرة من زيت الهالوكربون 700 على الأجنة ووضع ساترة تحتوي على أجنة رأسا على عقب على الشريحة بادئة، وترك بعض المساحة في أسفل الشريحة.
10. فحص الأجنة باستخدام نظام متحد البؤر التصوير، والأرجون / 488 ليزر، وهدف النفط الغمر (63X).
    ملاحظة: تحديد الجنين في هذه المرحلة التنموية المناسبة مهمة لالتقاط الصور لهذا الحدث تكون المعيدة. في ظل هذه الظروف، ومراقبة تقريبا جميع الأجنة تتطور عادة ما يصل إلى ما لا يقل عن مرحلة 14. الجنين تحليلها يمكن تربيتها مواصلة تطوير كشخص بالغ.

النتائج

هنا، نقدم لك مجموعة من الأحداث تكون المعيدة للجنين ذبابة الفاكهة ولمحة عامة عن إجراءات إعداد الجنين (الشكل 1). وصفت أغشية الخلايا باستخدام DE-كادهيرين :: GFP وأن يتم التصوير المباشر لحركات الخلية في وقت تكون المعيدة في ذبابة الفاكهة (ا...

Discussion

Although we have previously reported a similar procedure to capture live images of the gastrulation process in Drosophilla¹, the method we describe here is detailed and easy to trace endogenous cadherin expression and thus is quite useful for genetic screening of key factors involved in gastrulation. To maximize success with this imaging procedure, it is essential to use an indented slide. Mechanical pressure sometimes causes embryonic death. Therefore, it is also important to handle the embryos as ge...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Halocarbon oil 700	Sigma	MKBH 5726
Vacuum grease Silicone	Beckman	335148
Glass coverslip	Matsunami glass	Thickness No1	24 - 36 mm
Embryo stariner	Corning	Corning3477
Plastic Drosophilla Stock Bottles	Hitec	MKC-100
DE-Cadherin knock-in flies			REF (10)