نموذج من القلب إعادة عرض من خلال انقباض البطن الأورطي في الجرذان

Summary

A rat model of abdominal aortic constriction that induces cardiac hypertrophy and remodeling is described. An efficient, highly-reproducible, and minimally-invasive method is used to provide a simple yet useful platform for research in myocardial hypertrophy and dysfunction.

Abstract

Heart failure is one of the leading causes of death worldwide. It is a complex clinical syndromethat includes fatigue, dyspnea, exercise intolerance, and fluid retention. Changes in myocardial structure, electrical conduction, and energy metabolism develop with heart failure, leading to contractile dysfunction, increased risk of arrhythmias, and sudden death. Hypertensive heart disease is one of the key contributing factors of cardiac remodeling associated with heart failure. The most commonly-used animal model mimicking hypertensive heart disease is created via surgical interventions, such as by narrowing the aorta. Abdominal aortic constriction is a useful experimental technique to induce a pressure overload, which leads to heart failure. The surgery can be easily performed, without the need for chest opening or mechanical ventilation. Abdominal aortic constriction-induced cardiac pathology progresses gradually, making this model relevant to clinical hypertensive heart failure. Cardiac injury and remodeling can be observed 10 weeks after the surgery. The method described here provides a simple and effective approach to produce a hypertensive heart disease animal model that is suitable for studying disease mechanisms and for testing novel therapeutics.

Introduction

فشل القلب هو متلازمة معقدة السريرية، والأعراض التي تشمل التعب، وضيق التنفس، وممارسة التعصب، واحتباس السوائل في الأنسجة الطرفية. هذا هو السبب الرئيسي للوفاة في الدول المتقدمة ^1. وبصرف النظر عن القلب الموروثة التي تسببها طفرات في بروتينات قسيم عضلي أو القنوات الأيونية ^2، يمكن أن يكون سبب ضعف عضلة القلب عن طريق مجموعة متنوعة من الظروف الطبية، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم، وأمراض صمامات القلب، والسمنة، ومرض السكري ^3. التغييرات في بنية عضلة القلب، التوصيل الكهربائي، والرصاص استقلاب الطاقة إلى عدم كفاية قدرة ضخ القلب لتلبية مطالب الدورة الدموية، مما يؤدي في نهاية المطاف إلى فشل القلب ^3،4. التحقيق في الآليات الكامنة وراء فشل القلب، لذلك، أمر بالغ الأهمية في مجال أبحاث القلب والأوعية الدموية. يمكن تحديد الآليات الجزيئية التي تؤدي إلى فشل القلب تطور المساعدات في نهاية المطاف في اكتشاف أهداف علاجية جديدة أو المؤشرات الحيوية مفيدة 1. ولذلك فمن المهم لتطوير نماذج فشل القلب الحيوانات التي تشترك في السمات السريرية الرئيسية المصابين بقصور في القلب لدى البشر ^5.

تضخم القلب وإعادة يلعب دورا حاسما في تطوير قصور القلب. أمراض القلب ارتفاع ضغط الدم هو العامل الرئيسي لتضخم القلب وإعادة التأقلم ينظر في المرضى من البشر ¹ المساهمة. لتقليد هذه الشروط الإنسان، وغالبا ما يتم وضع النماذج الحيوانية من خلال العمليات الجراحية. على وجه الخصوص، الشريان الأورطي عرضية أو البطن يمكن أن تتقلص إلى زيادة المقاومة ضد البطين الأيسر، الأمر الذي يؤدي في نهاية المطاف إلى الحمل الزائد الضغط في القلب. هذه الظاهرة عادة ما ينتج في تضخم القلب، تعويضا الفسيولوجية للالعضلية لتلبية الطلب الوظيفي للنظام القلب والأوعية الدموية. ومع ذلك، يتجاوز الطلب الوظيفي الآليات التعويضية فسيولوجية طبيعية، مما يؤدي إلى تليف القلب والعقود مع القطاع الخاصبلاط انخفاض القيمة. عرضية انقباض الشريان الأبهر (TAC) لعملية جراحية غالبا ما ينطوي على إجراءات معقدة، بما في ذلك بضع الصدر، والتهوية الميكانيكية، والفصل بين الغدة الصعترية والأنسجة الدهنية من قوس الأبهر. في المقابل، انقباض الشريان الأورطي البطني يتطلب تقنيات تجريبية أبسط ^6-8. الشريان الأورطي البطني، بين اليسار والشرايين الكلوية اليمنى، هو ضيق خلال عملية جراحية. تضخم القلب وإعادة عرض يمكن ملاحظة عدة أسابيع بعد جراحة البطن انقباض الشريان الأورطي ^6-8. أنها تنتج ارتفاع ضغط الدم وأمراض القلب القوي مماثلة لتلك التي تم إنشاؤها بواسطة عرضية الأورطي جراحة انقباض ^9،10. هنا، نحن تصف بروتوكول لإجراء انقباض الشريان الأورطي البطني في الفئران باستخدام وسيلة فعالة، عالية قابلة للتكرار، والحد الأدنى الغازية. وضيقت الشريان الأورطي البطني المتاخمة للشرايين الكلوية بواسطة حلقة 0.72 مم تتكون من خيط الحرير 4-0. بعد عشرة أسابيع من الجراحة، وتضخم القلب واعادة عرضز يمكن ملاحظتها. نموذج الفئران من البطن الأبهري تضخم القلب الناجم عن انقباض يوفر منصة لدراسة آليات المرض والفيزيولوجيا المرضية، فضلا عن تطوير علاجات محتملة.

Protocol

وأجريت التجارب على الحيوانات فقط وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، التي نشرت من قبل المعاهد الوطنية الأميركية للصحة (NIH المنشور رقم 85-23، نقح 1996). وقد وافق هذا البروتوكول من قبل وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدم في جامعة تايوان الوطنية.

1. جراحة الحيوان

1. إعداد 22 G حقنة إبرة عن طريق إضعاف غيض من الإبرة على حجر شحذ. باستخدام كماشة، يغضن الإبرة إلى الزاوية اليمنى.
2. قبل الجراحة، وإعداد الأدوات اللازمة الجراحية والمواد، فضلا عن قفص الانتعاش. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية قبل الاستخدام.
3. الحفاظ على الفئران حوالي 200 غرام وإبقائهم تحت 12 ساعة ضوء / دورات الظلام عند درجة حرارة للرقابة (21 ± 2 درجة مئوية) مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء. يشمل على الأقل 6 الفئران في كل مجموعة. تخدير الفئران مع بنتوباربيتال(75 ملغ / كغ في 0.5 مل، والملكية الفكرية) أو وكيل مخدر آخر مناسب. تأكيد عمق التخدير عن طريق اختبار رد الفعل الذيل.
   ملاحظة: إن غياب رد الفعل ذيل مؤشرا التخدير المناسب.
4. وضع الفئران في موقف ضعيف على منصة جراحة مع وسادة التدفئة للحفاظ على درجة حرارة الجسم. حلق منطقة البطن من الفئران مع المقص وبر وشعر مزيل غسول لتجنب التلوث الجراحية. فرك البطن نظيفة حليق مع betadine أو كاشف التطهير آخر قبل الجراحة.
   ملاحظة: من المهم الحفاظ على مجال معقم طوال الإجراء.
5. جعل شق 2 سم على طول خط الوسط من البطن مع مشرط. باستخدام محلول ملحي، والحفاظ على جهاز البطن رطبة أثناء الجراحة. تهجير الجهاز الهضمي بعناية إلى الجانب باستخدام كرات القطن لفضح الوريد الأجوف السفلي التي تقع في المنطقة البريتوني الخلفية. تحديد الشريان الأورطي البطني، والتي تقع جنبا إلى جنب لوعادة ما تكون علىتبقى من الوريد الأجوف السفلي.
   ملاحظة: إن الأبهر البطني هو الوعاء الذي ينبض في الوقت المناسب مع معدل ضربات القلب.
6. تخترق الغشاء البريتوني مع زوج من ملقط للكشف عن السفن تحت. عزل بلطف الشريان الأورطي البطني المتاخمة للشرايين الكلوية وتمرير 8 سم طويلة 4-0 خياطة الحرير تحت الشريان الأورطي البطني بين أصول الحق والشرايين الكلوية نقاط.
7. جعل عقدة مزدوجة فضفاض مع خياطة. ترك قطر حلقة 3 مم، ووضع أضعفت وعازمة 22 G إبرة داخل الحلقة. تشديد عقدة حول الشريان الأورطي والإبرة، ثم قم بإزالة الإبرة فورا لتحقيق قطرها انقباض 0.7 مم.
8. إغلاق تجويف البطن مع 6-0 المواد خياطة للامتصاص. خياطة العضلات أو الجلد شقوق مع خيوط متقطعة بسيطة. للوقاية من العدوى، فرك موقع الجراحية مع صبغة اليود.
9. مراقبة الحيوانات بعناية حتى يستعيد وعيه كافية، كما يتضح من حرية الحركةوتناول الطعام. لا تترك حيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. لمنع الألم بعد الجراحة، وعلاج الفئران مع اسيتامينوفين (300 ملغ / كغ في 0.5 مل، والملكية الفكرية).
   ملاحظة: يجب على المستخدمين بإدارة المسكنات التي وافقت عليها السياسات المؤسسية.

2. الأنسجة وجمع عينة الدم

1. في 10 أسابيع بعد الجراحة، وزن الفئران وتخدير مع بنتوباربيتال (75 ملغ / كغ في 0.5 مل، والملكية الفكرية). قبل الجراحة، تأكيد عمق التخدير عن طريق اختبار رد الفعل ذيله. وضع فأر على صينية معدنية.
2. جعل شق 2 سم على طول خط الوسط من الرقبة باستخدام مشرط. تهجير العضلات بعناية مع ملقط لفضح القصبة الهوائية. لاحظ بعناية لتحديد الشرايين السباتية، وهي موازية للالقصبة الهوائية وخفق في الوقت المناسب مع معدل ضربات القلب.
3. جمع الدم من الشريان السباتي في أنبوب جمع الدم المغلفة مع EDTA. على الفور أجهزة الطرد المركزيالدم لمدة 15 دقيقة في 2000 x ج وجمع البلازما. تخزين بلازما الدم عند -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
4. جعل شق 5 سم في منطقة الصدر، وحول خط الوسط من عملية سيفي الشكل. تخترق الحجاب الحاجز مع ملقط حادة. باستخدام زوج من مقص، وقطع وإزالة القفص الصدري على طول خطوط منتصف الترقوة على كلا الجانبين لفضح القلب. استئصال القلب بعناية على طول الحدود القلب والأوعية الدموية. إزالة القلب بلطف دون الاستيلاء على الأنسجة.
5. جبل قلب على جهاز نضح Langendorff المعدلة من خلال ربط جذع الشريان الأورطي إلى إبرة نضح. يروي القلب مع العازلة كريبس (التي تحتوي على 110 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.6 ملي بوكل، 1.2 ملي KH ₂ PO _4، 1.2 ملي MgSO _4، 25 مم NaHCO _3، و 11 ملي الجلوكوز [7.4 درجة الحموضة]) لغسل الدم. وزن القلب وحساب نسبة القلب الوزن إلى وزن الجسم. إصلاح القلب مع 4٪ لامتصاص العرق على الجليد. تذكر أن ارتداء قناع، منذ امتصاص العرق بخار توإكسجيم.

3. الأنسجة الكيسي الكمي

1. وضع أنسجة القلب الثابتة امتصاص العرق على جهاز باجتزاء الأنسجة وخفض 2 مم أبواب سميكة. وضع المقاطع الأنسجة في الكاسيت التضمين. يذوى الأنسجة من خلال سلسلة من الحمامات الكحول متدرج (50٪، 75٪، 95٪، و 100٪ لمدة 1 ساعة لكل منهما).
2. اختراق الأنسجة مع الزيلين لمدة 1 ساعة، وأخيرا في الشمع لمدة 1 ساعة. وضع الأنسجة تسلل إلى كاسيت دمج وتضمين مع شمع البارافين. تخزين الأنسجة جزءا لا يتجزأ من كتل البارافين في درجة حرارة الغرفة حتى microtoming.
3. شريحة الأنسجة جزءا لا يتجزأ في 4 ميكرون أبواب سميكة. وضع المقاطع في حمام الماء 45 درجة مئوية. تراجع شريحة زجاجية في حمام مائي عند زاوية والاقتراب تدريجيا حواف قسم البارافين للسماح مرفق جزئيا إلى الشريحة.
4. نقل الشرائح داخل وخارج الحمام لإزالة الجيوب الهوائية المحتملة تحت قسم الأنسجة وتسهيل مرفق أفضل. ر الجافانه ينزلق في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لتلطيخ النسيجي.
5. ضع الشريحة في خزان. Deparaffinize الشريحة مع الزيلين لمدة 30 دقيقة وترطيب في بالتتابع الكحول المخفف (95٪، 75٪، و 50٪ لمدة 3 دقائق لكل منهما)، وأخيرا في الماء المقطر. استخدام كاف picrosirius حل الأحمر لتغطية كامل أقسام الأنسجة لمدة 1 ساعة. شطف الشرائح في محلول حمض الخليك 0.5٪ لمدة التغييرات، ثم قم بإجراء اثنين يشطف في الكحول المطلق.
6. الهواء الجاف الشريحة وجبل الشريحة في الراتنجات الاصطناعية مع ساترة. تصوير الشريحة في مجال الضوء المرئي.
   ملاحظة: المنطقة الحمراء في الصورة يظهر المنطقة الموجبة الحمراء picrosirius تحت المجهر في 200X التكبير. حساب النسبة المئوية من المنطقة الموجبة الحمراء picrosirius على المساحة الكلية، مما يدل على مدى التليف ^11.

4. الدم تروبونين الكمي

1. تحديد مستويات التروبونين البلازماباستخدام الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). مقايسة كل عينة في مكررة. تحميل 50 ميكرولتر من بلازما الدم و50 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة في آبار المناسبة. ختم لوحة واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر لوحة في 400 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: تروبونين القلب في البلازما هو علامة للإصابة القلب.
2. نضح السائل وغسل كل بئر مع 250 ميكرولتر من العازلة غسل ثلاث مرات. بعد غسل الماضي، عكس لوحة وصمة عار ضد مناشف ورقية نظيفة لإزالة السائل الزائد.
3. إضافة 100 ميكرولتر من الركيزة tetramethylbenzidine إلى كل بئر واحتضان لمدة 10 دقيقة في الظلام على شاكر لوحة في 400 دورة في الدقيقة. إضافة 100 ميكرولتر من توقف حل كل بئر. يهز لوحة على شاكر لوحة لمدة 1 دقيقة لخلط. تسجيل الكثافة الضوئية (OD) في 450 نانومتر.
   ملاحظة: إن تركيز التروبونين غير متناسبة مع قيمة OD.

النتائج

بعد 10 أسابيع من البطن جراحة انقباض الشريان الأبهر، تم تحليل أمراض القلب الناتجة عن ذلك. تم قياس الأنسجة القلبية عن طريق حساب نسبة وزن القلب لوزن الجسم وعن طريق الكشف عن كمية الكولاجين في القلب. وأكد إصابة القلب عن طريق قياس البلازما تركيز التروبونين...

Discussion

Hypertensive heart disease, a major health problem that contributes greatly to morbidity and mortality, can lead to cardiac hypertrophy and heart failure⁵. The pathogenesis and progression of hypertensive heart disease in humans is complex, so an appropriate animal model is critical to investigate the underlying mechanisms and to test novel therapeutics that aim to improve cardiac structure and function⁵. The abdominal aortic constriction model, which simulates chronic heart disease, is an effective...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
22 G syringe needle	BD Biosciences	309572
EDTA Blood Collection Tubes	BD Biosciences	REF365974
4-0 silk suture	Sharpoint™ Products	DC-2515N
6-0 silk suture	Sharpoint™ Products	DC-2150N
Pentobarbital	Sigma Aldrich	1507002
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	441244
Acetaminophen	Sigma Aldrich	A7085
Picrosirius red solution	Abcam	ab150681
Cardiac troponin kit	Abcam	ab200016
Imagequant	Molecular Dynamics
Langendorff	ADInstruments	ML870B2