الوريد الإعتراض نموذج: نموذج مناسب لدراسة الالتفافية الكسب غير المشروع الإنفتاح

Summary

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Abstract

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

Introduction

أمراض الشرايين التاجية ومضاعفاتها هي من بين الأسباب الرئيسية للوفاة في جميع أنحاء العالم. الاستراتيجيات العلاجية الحالية تركز على إعادة تأسيس تدفق الدم، إما عبر توسيع الأوعية ضاقت أو عن طريق إنشاء الالتفافية. وصفت التاجي تطعيم مجازة الشريان (التاجي) باستخدام طعم ذاتي الوريد لأول مرة في عام 1968 ونقحت على مر السنين. وبصرف النظر عن إعادة التوعي من الجزء الأمامي الأيسر النازل الشريان التاجي، وتستخدم القنوات الوريد الصافن الأكثر شيوعا ^1. ومع ذلك، لا يزال الكسب غير المشروع المباح كعب أخيل الطعوم الوريد الصافن (SVG). بعد سنة واحدة لعملية جراحية، الكسب غير المشروع المباح هو 85٪، وانخفض إلى 61٪ بعد عشر سنوات ^2،3. وبالتالي الكشف عن الآليات والأسباب المرضية من SVG فقدان المباح هو مهمة هامة.

يوضح هذا الفيديو الوريد نموذج مداخلة الفئران للتحقيق في الوريد فقدان الكسب غير المشروع. الأهداف العامة لهذه الطريقة هي لاستكشاف pathobiological الكامنةوالعمليات -physiological أثناء تطور المرض وتطوير نموذج مناسب لمكافحة المخدرات أو العلاجية اختبار الخيار. عن طريق زرع الوريد الشرسوفي السطحي في النظام الشرياني، وهذا نموذج يحاكي عن كثب السريرية من التاجي تطعيم مجازة الشريان. الصدمة الجراحية، نقص التروية، والإجهاد الجدار هي محفزات هامة للتغيرات الأوعية الدموية المرضية وتقليد في النموذج الذي وصفها.

تتوفر للتحقيق في الوريد الكسب غير المشروع خسارة المباح النماذج والأنواع المختلفة. نماذج حيوانية كبيرة، مثل الخنازير ⁴ والأغنام ^{5، 6} كلاب، والقرود ^7، تشبه سفينة البشرية والهياكل التشريحية، وبالتالي تمكين الاستراتيجيات العلاجية المعقدة، مثل الدعامات تجاوز أو تقنيات جراحية جديدة، لفحصها ^8. ومع ذلك، هناك حاجة المساكن الخاصة، والمعدات، والموظفين. وبالإضافة إلى ذلك، ارتفاع التكاليف والحاجة إلى التخدير أثناء الجراحة إضافية تعيق تطبيقها على نطاق أوسع بهم. خجميع الحيوانات، بما في ذلك الفئران، من السهل التعامل معها، لا تحتاج إلى مساكن خاصة، ولها تكاليف إدارتها. مقارنة نماذج الماوس ^9،10، ونماذج الفئران لديها ميزة أفضل عمليات التشغيل وتقلب بالتالي أقل في النتيجة. الفئران هي من الناحية الفسيولوجية وراثيا أكثر مماثلة على البشر من الفئران ^11،12. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم الفئران من النوع البري تطوير فقط محدودة myointima ^13، والتي تجعل نماذج الماوس عرضة لكتابة الأخطاء الثاني. الأنسجة الأوردة الماوس الرئيسية، مثل الوريد الأجوف السفلي، ويتكون فقط من عدد قليل من طبقات الخلايا ويجعل تقييم في وقت مبكر من الصعب ^13. والعيب آخر هو كمية صغيرة من نسيج المتاحة لتحليلها لاحقا بعد الشفاء الكسب غير المشروع.

النموذج الذي وصفها في هذا الفيديو هو تكرار، وغير مكلفة، والسهل القيام بها، وأنه يمكن أن تنشأ بسرعة وبشكل موثوق. انها مناسبة خاصة لتقييم العوامل العلاجية التجريبية باهظة الثمن، مثل ناقلات فيروسيةللعلاج بالجينات، بطريقة اقتصادية.

Protocol

تلقى الحيوانات الرعاية الإنسانية وفقا لدليل لمبادئ الحيوانات المختبرية، من معهد الثروة الحيوانية مختبر أعد ونشر من قبل المعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوان من قبل السلطة المحلية المسؤولة ( "FÜR مبلغ الدفعة Gesundheit اوند Verbraucherschutz، Hansestadt (مكتب الصحة وحماية المستهلك) هامبورغ").

1. رعاية الحيوان

1. الحصول على الفئران لويس (LEW / CRL) الجرذان وROSA /-وسيفيراز ليو الفئران المعدلة وراثيا وزنها 300-350 غرام من معهد الحيوانات المختبرية.
2. الحفاظ على الفئران في ظل الظروف التقليدية في خزانات التهوية وإطعامهم طعام الفئران القياسية وتعقيمها المياه libitum الإعلانية.
3. إجراء زرع الكسب غير المشروع باستخدام ROSA /-وسيفيراز ليو الفئران المعدلة وراثيا مثل الجهات المانحة وsyngenic الفئران LEW / CRL كما المتلقين.

2. إعداد الجرذ المانحة

1. استخدام جندأيون غرفة لتخدير الفئران مع isoflurane (2.5-3٪).
2. وضع فأر على ظهرها والحفاظ على التخدير مع قناع يغطي الفم والأنف. تحقق من عمق كاف من التخدير بواسطة معسر القدمين الخلفيتين والتحقق من عدم وجود ردود الفعل. تطبيق بعض مرهم التعليم والتدريب المهني للعيون لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
3. نشر رجليه الخلفيتين وتحديد موقفهم باستخدام الشريط.
4. حلق شعر الإربي مع الانتهازي الشعر وتطهير المنطقة بأكملها باستخدام بوفيدون اليود تليها الايثانول 80٪. كرر الخطوة تطهير مرتين.
   ملاحظة: منطقة العمليات الجراحية والشاش، والأدوات الجراحية ويجب تعقيم. الحفاظ على مجال معقم طوال الإجراء وارتداء استخدام مرة واحدة، والقفازات الجراحية المعقمة، والأقنعة، والقبعات.
5. تحت المجهر، إجراء شق عمودي على طول الخط الأربي. استخدام اثنين من ملقط لفصل بلطف الأنسجة تحت الجلد وفضح الوريد الشرسوفي السطحي من أوري لالجن في الوريد الفخذي. بعناية عزل الوريد الشرسوفي السطحي من الأنسجة المحيطة بها.
6. وقف تدفق الدم في الوريد الشرسوفي السطحي باستخدام اثنين من المشابك الصغيرة.
7. حصاد شريحة حوالي 0،5-1 سم من الوريد عن طريق رفع بعناية الوريد معزولة مع ملقط وقطع طريق السفينة مع microscissors. ترك المشابك الصغيرة على الجذع السفينة لمنع فقدان الدم. ضع قطعة إزالة الوريد على شاش معقم. وضع بعناية إبرة 30 G داخل واحدة من نهاية الوريد حصادها وطرد السفينة مع الهيبارين (50 وحدة / مل).
   ملاحظة: التعامل مع الوريد مع الرعاية وتجنب الضرر أثناء رفع، والقطع، والتنظيف. تأكد من مسح الكسب غير المشروع مع كمية مناسبة من الهيبارين.
8. إبقاء جزء السفينة في 1٪ ليدوكائين على الجليد حتى زرع في الفئران المتلقي لمنع تشنج الأوعية.
9. الموت ببطء الفئران المانحة عن طريق زيادة التخدير إلى 5٪ الأيزوفلورين. بعد 2-3 دقائق، مرجع سابقأون البطن على طول الخط الأبيض، وقطع من خلال الحجاب الحاجز، وإزالة القلب لوقف التداول.

3. إعداد الجرذ مستلم

1. تخدير وعلاج هذه الفئران المتلقي في نفس الطريقة كما في الفئران المانحة.
2. حلق الجانب الإنسي في الساقين مع الانتهازي الشعر وتطهير ثلاث مرات باستخدام بوفيدون اليود و 80٪ من الإيثانول.
3. رصد عمق التخدير والتأكد من أنها غير كافية من خلال التحقق من عدم وجود ردود الفعل عندما معسر القدمين الخلفيتين.
4. إجراء شق الفخذ متوسط ​​من الركبة إلى حظيرة الإربي. تحت المجهر، واستخدام ملقط 2 لفصل الشريان الفخذي عن محيطها.
5. استخدام المشابك الصغيرة لوقف تدفق الدم. وضع المشبك الداني الأولى، تليها المشبك البعيدة.
6. قطع قطعة صغيرة من الشريان الفخذي فرضت مع microscissors وتخلص منه. تقصير الجذع الشرياني المتبقية مع microscissors، وخلق فجوة وهذا هو1-2 ملم أكبر من الكسب غير المشروع الوريد. تدفق الجذع الشرياني مع الهيبارين باستخدام إبرة 30 G.
   ملاحظة: إذا كان يبرز البرانية قليلا خارج الجذع السفينة، واستخدام الملقط لسحب ما يزيد قليلا عن نهاية السفينة وإزالة قطعة.
7. وضع الوريد المقطوع من الخطوة 2.8 بين جذوعها الشرايين وضبط طول بحيث يناسب بشكل مناسب في هذه الفجوة. ملاحظة اتجاه الوريد.
8. إجراء مفاغرة الداني أولا باستخدام خياطة 10-0 البرولين. إجراء غرز واحدة في الترتيب الظاهر (1D الشكل). تبدأ مع خياطة على كل الجانب الوحشي قبل أن يضيف ثلاثة خيوط أكثر على الجانب البطني. بعد ذلك، وضع ثلاث غرز على الجانب الظهري من السفينة لاستكمال مفاغرة.
9. ربط السفن البعيدة مع الكسب غير المشروع باستخدام نفس الأسلوب بالنسبة للمفاغرة الداني هو موضح في الخطوة 3.8. مرة أخرى، وتبدأ مع خياطة على كل جانب الجانبي، ثم ضع ثلاثة الغرز على سيد بطنيه والجانب الظهري.
10. تحميل اثنين من المحاقن 1 مل مع عنصر الليفين الغراء 1 و 2. رفع بعناية الكسب غير المشروع مع ملقط وإسقاط ما يقرب من 100 ميكرولتر من الفيبرين عنصر الغراء 1 تحت الكسب غير المشروع، يليه عنصر 2.
    ملاحظة: تأكد من أن المكونات 1 و 2 وتطبق في نسبة 1: 1.
11. وضع الكسب غير المشروع مرة أخرى في موقفها وإسقاط 100 ميكرولتر إضافية من المكونات 1 و 2 على رأس الكسب غير المشروع. مما لا شك فيه أن الصمغ يغطي كلا من الكسب غير المشروع ومفاغرة لمنع قصور تفاغري وأكثر من انتفاخ من الكسب غير المشروع الوريد.
12. بعناية فتح المشبك البعيدة، تليها الداني.
13. تأكيد عملية جراحية ناجحة عن طريق التحقق من نبض المرئي في الوريد المزروعة والشريان البعيدة من الكسب غير المشروع.
14. إزالة الغراء الزائد، مما يعوق إغلاق الجلد. استخدام ملقط لرفع الغراء الشفاء وإزالة الزائدة مع microscissors. إغلاق طبقات الجلد مع 5-0 الغرز البرولين.
15. حقن 4-5 مجم / كجم كاربروفين تحت الجلد قبل السماح الفئران ليستيقظ. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى استعاد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية. حفاظ على الحيوانات في قفص واحد حتى يتم الشفاء منها تماما.
16. إضافة ميتاميزول لمياه الشرب (50 ملغ ميتاميزول لكل 100 مل)، ومسكنات للألم لمدة 3 أيام بعد ورصد حيوان يوميا.

4. دوبلكس بالموجات فوق الصوتية

ملاحظة: استخدام التصوير فوق الصوتي duxplex لتصور تدفق الدم غير جراحية في الفئران ^(14).

1. تخدير الفئران في غرفة الاستقراء (الأيزوفلورين 2٪). وضع فأر على ظهرها والحفاظ على التخدير مع قناع يغطي الأنف.
2. استخدام قص الشعر وكريم إزالة الشعر لإزالة الشعر في جميع أنحاء منطقة الفخذ.
3. تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية في الفخذ. تأكد من عدم وجود أي فقاعات الهواء. الحصول على صور بالموجات فوق الصوتية المزدوجة باستخدام MS 400 محول (مركز تردد: 30 مهرتز) مع معدل إطارات من 230-400 لقطة / ثانية.

5. التشريح المرضي

ملاحظة: الحصاد وصمة عار على السفينة مع تلطيخ ثلاثي الألوان ماسون لتحليل المورفومترية ^15.

1. إصلاح السفينة التي تحصد في 4٪ بارافورمالدهيد بين عشية وضحاها ويذوى في زيادة تركيزات الإيثانول. تضمين نموذج في البارافين وتقطيعه إلى 5 ميكرون شرائح سميكة باستخدام مشراح.
   ملاحظة: لامتصاص العرق هي سامة، وينبغي التعامل مع رعاية خاصة.
2. Deparaffinize الشرائح قبل تلطيخ لهم ثلاثي الألوان حل تلطيخ. يذوى الشرائح ملطخة، واضحة لهم مع زيلين، وجبل لهم في تصاعد المتوسطة. بعد تجفيف الشرائح، وعرض العينات مع المجهر.

6. ضوء بارد التصوير (BLI)

وقد تعقب الكسب غير المشروع بعد العملية الجراحية على مر الزمن في الجسم الحي عن طريق قياس إشارة للإضاءة الحيوية ^1: ملاحظة6.

1. حل 1 غرام من مد وسيفيرين الملح والبوتاسيوم في 22 مل من برنامج تلفزيوني وحقنه داخل الصفاق في الفئران (375 ملغم / كغم من وزن الجسم). انتظر 15 دقيقة لوسيفيرين أن تعمم في الحيوان.
2. وضع الفئران في الوقت الحقيقي نظام القياس الكمي للإضاءة الحيوية والوصول إلى إشارة تلألؤ بيولوجي.

النتائج

نموذج مداخلة الفئران الوريد هو مناسب لدراسة تطوير تضخم myointima والفشل الوريد الكسب غير المشروع. الحيوانات على التعافي بشكل جيد من الجراحة وتظهر حالة ممتازة البدنية بعد العملية. ويبين الشكل 1 الخطوات الجراحية الرئيسية. بعد شق الجلد على طول الخط الأربية، ويتم ت?...

Discussion

يوضح هذا الفيديو الوريد نموذج مداخلة الفئران للتحقيق في الوريد فقدان الكسب غير المشروع والسماح للتنقيب عن العمليات المرضية الكامنة واختبار الأدوية الجديدة أو الخيارات العلاجية.

التخدير هو جانب هام من العمليات الجراحية. ينصح نظ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat LEW/Crl	Charles River	Stock number 004
Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan	NBPR rat number 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	AbbVie	PZN 10182054 Art.Nr.: B506	Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
hair removal creme	Rufin cosmetic	27618
Povidone-Iodine	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
10-0 Ethilon suture	Ethicon	2814G
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	Carprofen
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Heparin	Rotexmedica	PZN: 3862340	25.000 I.E./ ml
Xylocain 1%	AstraZeneca	PZN: 1137907	Lidocain
EVICEL	J&J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE	fibrin glue
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system	VisualSonics		duplex sonography
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-med	30GB
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Biosynth	L-8220
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	Perkin Elmer		bioluminescence imaging
Weigerts iron hematoxylin Kit	Merck	1.15973.0002	Trichrome staining
Resorcine-Fuchsine Weigert	Waldeck	2.00E-30	Trichrome staining
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129-25G	Trichrome staining
Ponceau S solution	Serva Electrophoresis	33427	Trichrome staining
Azophloxin	Waldeck	1B-103	Trichrome staining
Molybdatophosphoric acid hydrate	Merck	1.00532.0100	Trichrome staining
Orange G	Waldeck	1B-221	Trichrome staining
Light Green SF	Waldeck	1B-211	Trichrome staining
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	537020
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Xylene	Th. Geyer	3410
Paraffin	Leica biosystems	REF 39602004
Ethanol absolute	Th. Geyer	2246
Ethanol 96%	Th. Geyer	2295
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Slide Rack	Ted Pella	21057
Staining dish	Ted Pella	21075
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment