المعالجة سيفوبيرازون ماوس نموذج سريريا ذات صلة<em&gt; المطثية العسيرة</em&gt; سلالة R20291

Summary

ويحدد هذا البروتوكول نموذج الفأر سيفوبيرازون من كلوستريديوم العدوى العسيرة (CDI) باستخدام سلالة سريريا ذات الصلة وراثيا لين العريكة، R20291. وفيما يلي تفصيل التركيز على رصد السريري المرض، C. التعداد البكتيري العسيرة السمية الخلوية السم، والتغيرات التشريحية المرضية في جميع أنحاء CDI في نموذج الفأر في البروتوكول.

Abstract

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

Introduction

المطثية العسيرة هو اللاهوائية، إيجابية الجرام، تشكيل بوغ عصية أن يسبب تهدد الحياة الإسهال ^1. ويرتبط C. عدوى العسيرة (CDI) مع زيادة معدلات الاعتلال والوفيات البشرية والنتائج في أكثر من 4.8 مليار $ في تكاليف الرعاية الصحية سنويا ^1-4. في عام 2013، ومراكز السيطرة على الأمراض والوقاية منها تصنف C. صعب بمثابة خطر المقاومة للمضادات الحيوية عاجل، مشيرا إلى أنه يشكل تهديدا عاجلا للصحة العامة ^1. حاليا، تعتبر العلاج بالمضادات الحيوية مع فانكومايسين وميترونيدازول مستوى الرعاية لCDI ^5. للأسف، تكرار CDI بعد نجاح العلاج بالمضادات الحيوية عالية، وتحدث في 20-30٪ من المرضى ^2،5-7. ولذلك، فإن اكتشاف علاجات جديدة ضد هذا الممرض المعوي هو ضروري. لتقييم العلاجات ضد C. صعب، نموذج حيواني تقارب الأمراض التي تصيب البشر في ميلانوهناك حاجة سلالة linically ذات الصلة.

في البداية، تم إنشاء فرضيات كوخ لC. صعب في عام 1977 باستخدام نموذج الهامستر السوري المعالجة الكليندامايسين ^8. لا تزال تستخدم هذا النموذج اليوم للتحقيق في آثار جيم السموم صعب على التسبب ^9،10. ومع ذلك، CDI في النموذج الهامستر يؤدي إلى ارتفاع معدلات الوفيات ولا تقريب مظاهر المرض الخبيث المزمنة التي يمكن رؤيتها في البشر مع CDI ^10،11. واستنادا إلى سهولة الوصول وكاشف توفر منصات الفئران في البحث، وهذا نموذج الفأر من CDI هو ذات الصلة.

في عام 2008، تم إنشاء نموذج الفأر قوية من CDI عن طريق علاج الفئران بخليط من المضادات الحيوية في مياه الشرب (كانامايسين، جنتاميسين، كوليستين، ميترونيدازول، وفانكومايسين) لمدة 3 أيام تليها حقن داخل الصفاق من الكليندامايسين ^12. هذه الفئران المقدمة عرضة لالتهاب القولون CDI وشديد. تعتمدجي على جرعة اللقاح تديرها مجموعة من العلامات السريرية والفتك ويمكن ملاحظة باستخدام هذا النموذج. منذ هذا الوقت، وقد تم التحقيق في مختلف الصادات التي تغير الجراثيم الأمعاء الفئران، وخفض مقاومة الاستعمار إلى النقطة التي يمكن C. صعب استعمار الجهاز الهضمي (إعادة النظر في أفضل وآخرون. وLawley ويونغ) ^13،14.

وفي الآونة الأخيرة، والسيفالوسبورين واسعة، سيفوبيرازون، التي وردت في مياه الشرب لمدة 5 أو 10 يوما يجعل بتكاثر الفئران عرضة للCDI ^15. منذ ترتبط إدارة السيفالوسبورين الجيل الثالث مع زيادة خطر CDI في البشر، واستخدام نموذج سيفوبيرازون تعكس بشكل أدق تحدث طبيعيا ومرض ^16. وقد تم الطعن الفئران عرضة للجيم صعب المعالجة سيفوبيرازون مع كل من جيم جراثيم صعب والخلايا النباتية من مجموعة متنوعة من السلالات التي تتراوح في سريريأهمية والفوعة ^17. وعلى الرغم من بعض الدراسات الأصلية باستخدام جيم الخلايا النباتية صعب كما شكل المعدية، تعتبر جيم جراثيم صعب الوسيلة الرئيسية لنقل ^18.

في العقد الماضي، C. صعب R20291، وNAP1 / BI / 027 سلالة، ظهرت، مما تسبب أوبئة CDI ^19،20. سعينا لتحديد المسار السريري للمرض عندما طعن في الفئران المعالجة سيفوبيرازون مع جيم سلالة العسيرة سريريا ذات الصلة وراثيا لين العريكة، R20291. تفاصيل هذا البروتوكول على المسار السريري، بما في ذلك فقدان الوزن، والاستعمار الجرثومي، سمية الخلايا السمية، والتغيرات التشريحية المرضية في الجهاز الهضمي من الفئران تحدى مع جراثيم جيم صعب R20291. وعموما، هذا نموذج الفأر يبرهن على أن تكون منصة تجريبية قيمة لCDI تقارب الأمراض التي تصيب البشر. هذا نموذج الفأر يتميز بالتالي يمكن استخدامها لتقييم آثارعلاجات جديدة على تحسن المرض السريري وعلى استعادة مقاومة الاستعمار ضد C. صعب.

Protocol

بيان الأخلاقي:
وافقت اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في ولاية كارولينا الشمالية كلية جامعة ولاية الطب البيطري (NCSU) هذه الدراسة. وNCSU رعاية الحيوان واستخدام سياسة تطبق المعايير والمبادئ التوجيهية الواردة في قانون قانون والإرشاد الصحي بحوث رعاية الحيوان من عام 1985. مرافق حيوان مختبر في NCSU تلتزم المبادئ التوجيهية الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. تم تقييم الأوضاع الصحية للحيوانات يوميا، وكانت الحيوانات تحتضر الموت الرحيم إنسانية من قبل CO ₂ الخنق تليها تدابير الثانوية. الفنيين الحيوانات المدربة أو طبيب بيطري إجراء تربية الحيوانات في منشأة معتمدة AAALAC خلال هذه الدراسة.

1. الإدارة من المضادات الحيوية سيفوبيرازون في مياه الشرب على تحقيق القابلية للC. صعب الاستعمار والأمراض

ملاحظات: C57BL العمر 8 أسابيع 5- ل/ 6 الفئران WT (الإناث والذكور)تم شراؤها والحجر الصحي لمدة 1 أسبوع قبل بدء إدارة المياه للمضادات الحيوية. وبعد الحجر الصحي، وتم إيواء الفئران مع الغذاء تعقيمها، والفراش، والماء. تم إجراء تغييرات قفص الأسبوعية من قبل موظفي المختبر في غطاء تدفق الصفحي.

1. إعداد سيفوبيرازون (0.5 ملغ / مل) في الماء المقطر المعقم قبل 7 أيام من اليوم مستهدفة من التحدي (الشكل 1).
2. ملء زجاجات المياه وتعقيمها بالماء سيفوبيرازون (0.5 ملغ / مل)، ووضعها في كل قفص الماوس.
   ملاحظة: يجب أن تكون المياه سيفوبيرازون الطازجة وتغير من كل أيام 2 خلال فترة 5 أيام، كما تدل في الخطوات 1.1 و 1.2. ويوصى التخلص السليم من المياه سيفوبيرازون التالية المبادئ التوجيهية للصحة البيئية والسلامة المؤسسية.
3. بعد 5 أيام على المياه سيفوبيرازون، استبدال زجاجات زجاجات المياه تعقيمها مملوءة بالماء المقطر المعقم. إعطاء الفئران هذا مياه الشرب لمدة التجربة.

2. إعداد C. صعب سبور اللقاح وبالتزقيم عن طريق الفم من الفئران

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يتم وضع العناصر التالية في غرفة اللاهوائية لا يقل عن 24 ساعة ما يلي: 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، وانظر المواد)، سيكلوسيرين توروكولات سيفوكسيتين الفركتوز أجار (TCCFA) لوحات (انظر المواد وملف التكميلي )، والعقيمة على شكل حرف L رش.

ملاحظة: الفئران تحدى مع جيم جراثيم صعب يجب أن يضم في منشأة الحيوان السلامة الأحيائية المستوى 2.

1. الحصول على جيم الأسهم بوغ العسيرة من سلالة المطلوب (في هذه الحالة، R20291) التي أعدت في وقت سابق وتخزينها في 4 درجات مئوية في الماء المعقم ^21،22. تحديد تعداد هذه الأسهم بوغ قبل استخدامها.
2. استنادا إلى تركيز المعروفة (جراثيم / مل) من الأسهم بوغ، وحساب التخفيف المطلوب للحصول على 10 ⁵ الجراثيم في 25 ميكرولتر. ضمان حجم اللقاح غير كافية لتطعيم جميعالفئران في التجربة (25 ميكرولتر في الماوس)، لأداء التعداد من اللقاح (حوالي 30 ميكرولتر)، ولحساب الخطأ pipetting ل.
3. دوامة الأصلي جيم الأسهم بوغ العسيرة. ثم، resuspend وحجم محسوب (من الخطوة 2.2) من جيم الأسهم بوغ العسيرة الأصلي في الماء المعقم داخل أنبوب microcentrifuge المغطاة المسمار. تنفيذ هذا هوائيا في غطاء تدفق الصفحي. تحديد هذا الخليط المخفف باسم "اللقاح بوغ".
4. وضع اللقاح بوغ في حمام الماء 65 درجة مئوية والحرارة لمدة 20 دقيقة.
   ملاحظة: هذه الخطوة أن تضمن النشطة فقط C. جراثيم صعب تبقى بعد المعالجة الحرارية.
5. داخل غطاء تدفق الصفحي، واتخاذ 50 ميكرولتر من اللقاح بوغ ساخنة، ووضعه في أنبوب microcentrifuge العقيمة، وتمريرها الى غرفة اللاهوائية ^23. استخدام هذه العينة لتعداد الجراثيم.
6. داخل غطاء تدفق الصفحي، تحميل بوغ ساخنة اللقاح كثافة العمليات المتبقيةالزراعة العضوية حقنة 1 مل يعلق على ذات الرؤوس لمبة العقيمة أنبوب تغذية في المعدة إبرة. استخدام حقنة السائر اليدوي لضمان تكرار دقيق وسريع الجرعات بين الفئران. ضمان أن يتم شغل الإبرة أنبوب تغذية مع اللقاح بوغ ساخنة قبل استخدامها.
   ملاحظة: معقمة جديدة إبرة بالتزقيم لكل الماوس غير مطلوب. ومع ذلك، إذا تم الجرعات المختلفة من جيم جراثيم صعب، فمن المستحسن إبرة أنبوب تغذية جديدة لكل جرعة.
   ملاحظة: C. جراثيم صعب هي شديدة المقاومة للمطهرات التقليدية. ولذلك، فإن استخدام مطهر مبيد الأبواغ، مثل رقم 62 Perisept مبيد الأبواغ مطهر، أمر ضروري. الشركة المصنعة توصي وقت الاتصال 2-دقيقة لتدمير جيم جراثيم صعب.
7. أنبوب تغذية كل فأر مع 25 ميكرولتر من اللقاح بوغ. كبح جماح كل فأر بلطف استيعاب الحيوان عن طريق الجلد فضفاض من الرقبة والظهر وذلك لشل حركة الرأس. باستخدام السبابة مزيد لشل حركة رأس الحيوان واستطال المريء. التأكد من أن الحيوان لا نطق أو تظهر علامات أخرى من الشدة أثناء ضبط النفس.
   ملاحظة: الحجم الكلي نظرا لالفئران عن طريق أنبوب تغذية ينبغي ألا يتجاوز 10 مل / كغ من وزن الجسم (0.1 مل / ز 10).
8. الحفاظ على الماوس في وضع مستقيم، الرأسي وتمر بلطف الإبرة أنبوب تغذية في جانب الفم. توجيه الإبرة أنبوب تغذية على طول سقف الفم وتقدم ببطء الإبرة أنبوب تغذية في المريء.
   ملاحظة: إذا واجه أي مقاومة، وإبرة أنبوب تغذية يمكن أن يدخل إلى القصبة الهوائية، وبالتالي يجب أن لا تتقدم، وإنما إزالة وتعديل أوضاعها فورا.
9. بعد الإبرة أنبوب تغذية تقريبا في منتصف الطريق إلى المريء، وضخ 25 ميكرولتر من اللقاح بوغ ساخنة وسحب بلطف الإبرة أنبوب تغذية من المريء.
   ملاحظة: تقدم بالقوة الإبرة بالتزقيم قد يؤدي إلى تمزق في المريء أو المعدة. لذلك، إذا تم مصادفة المقاومة عند دفع إبرة بالتزقيم، فمن الأفضل لإزالة فورا وإعادة الإبرة تسمين.
10. عودة الحيوان إلى القفص، ومراقبة لأي السعال أو علامات ضيق التنفس، وهذا قد يشير إدارة القصبة الهوائية غير مقصودة أو تطلع من اللقاح بوغ ساخنة.
    ملاحظة: الفئران عرضة للغاية لC. صعب بعد العلاج بالمضادات الحيوية. وبالتالي، الاحتياطات اللازمة لمنع انتقال التلوث بين أقفاص أمر ضروري. هذا مهم بشكل خاص عند إدارة الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ولكن دون منازع والضوابط.
11. بعد بتلقيح جميع الفئران، ضع ساخنة اللقاح بوغ المتبقية في أنبوب microcentrifuge معقمة وتمريرها الى غرفة اللاهوائية للتعداد الجراثيم.
12. لتعداد اللقاح بوغ ساخنة (من الخطوة 2.4) والباقي gavaged ساخنة اللقاح بوغ، وجعل 01:10 التخفيفات المسلسل من كل اللقاح في برنامج تلفزيوني 1X. فمن المستحسن لجعل ولوحة 4-5 التخفيفات (أي 10 ^-1 من خلال10 ^-5).
13. باستخدام تقنية العقيم، ونقل 100 ميكرولتر من كل تخفيف تسلسلي على لوحة TCCFA الفردية.
14. استخدام معقم على شكل حرف L رش، موزعة بالتساوي على تخفيف تطبيقها على المدى المتوسط ​​عبر لوحة. حتى نشر من اللقاح المخفف هو ضروري لتعداد دقيق للجراثيم.
15. احتضان لوحات هوائيا لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة، C. الوحدات المكونة للمستعمرة صعب (CFUs) يمكن تعداد للحصول على الجرعة المسببة للعدوى تدار على الفئران في 25 ميكرولتر (0.025 مل) حجم (راجع الملف التكميلي "الحسابات مثال"). جيم المستعمرات صعب مسطحة وشاحب اللون الأصفر ولها حواف غير منتظمة والزجاج مظهر الأرض ^24.
    ملاحظة: الحد من الكشف عن التعداد البكتيري هو 10 ² كفو.

3. رصد فقدان وزن الفأر والسريرية علامات المرض في جميع أنحاء جيم العدوى العسيرة

1. تزنnimals قبل وبعد العلاج بالمضادات الحيوية لمدة 5 أيام سيفوبيرازون، بعد انتعاش 2-يوم الخروج من المضادات الحيوية (يوم 0)، ثم لمدة التجربة.
   ملاحظة: الحصول على الأوزان في وقت ثابت كل يوم. حصلت الأوزان يوم التحدي (يوم 0) يجب أن تستخدم الوزن الأساسي الأولي للمقارنة في جميع أنحاء C. عدوى العسيرة.
2. وضع مقياس رقمي إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. وضع كوب بلاستيكية معقمة على نطاق والفارغة وزن الكأس البلاستيك. ثم، واختيار بلطف صعودا والماوس عن طريق قاعدة الذيل ووضعه في كوب من البلاستيك.
   1. ضع الكأس مرة أخرى على نطاق واسع. تحوم اليد على الجزء العلوي من الكأس لضمان أن الماوس لا الهروب. قد يستغرق 2-3 ثانية للحصول على وزن ثابت. ثم، ضع بلطف الماوس مرة أخرى في قفصه. تسجيل هذا الوزن، وتكرار هذه العملية لكل الماوس في هذا القفص.
      ملاحظة: من الضروري أن تؤخذ الاحتياطات اللازمة لمنع انتقال contaminaنشوئها بين أقفاص عند الحصول على الأوزان. يجب أن يكون كل قفص من الفئران في كوب من البلاستيك الخاص للوزن. يجب تطهير الأكواب البلاستيكية مع وكيل مبيد الأبواغ بين كل استخدام ومغطاة بورق الألومنيوم العقيمة.
3. مراقبة الحيوانات تحدى مرتين يوميا (كحد أدنى) لعلامات C. عدوى العسيرة سريريا شديدة، بما في ذلك الخمول، وفقدان الشهية، والإسهال، والتقوس في الجلوس.
4. الموت ببطء إنسانية الحيوانات التي تفقد 20٪ من وزن الجسم الأساس الأولي و / أو تطوير علامات سريرية شديدة من جيم العدوى العسيرة (المذكورة في الخطوة 3.3).
   يجب أن يكون وزنه الفئران التي تعرض علامات سريرية للC. عدوى العسيرة حسب الحاجة أثناء التجربة للتأكد من أنها لم تكن قد فقدت 20٪ من وزن الجسم الأساسي الأولي: ملاحظة. خلال نقاط وقت مبكر في التجربة، وهذا قد يعني القياسات مرتين يوميا.

4. التعداد الجرثومي من جيم صعبمن البراز ماوس والمحتوى الأعور

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن يتم وضع العناصر التالية في غرفة اللاهوائية لا يقل عن 24 ساعة: برنامج تلفزيوني 1X (انظر المواد)، لوحات TCCFA (انظر المواد)، العقيمة على شكل حرف L رش، وأنابيب microcentrifuge معقمة و / أو لوحات PCR لالتخفيفات.

1. الحصول على عينات لجيم تعداد العسيرة
   ملاحظة: قبل الحصول على البراز أو محتوى الأعور، تزن أنابيب microcentrifuge العقيمة على نطاق التحليلي. سجل وزن الأنبوب على الجانب من الأنبوب، التقريب إلى أربعة منازل عشرية (على سبيل المثال، 0.9864 ز). دلالة هذا الوزن باسم "وزن الأنبوب." يجب وضع كل عينة تم جمعها في أنبوب microcentrifuge عقيم، وزنه.
   1. جمع العقيمة من براز الفأر
      1. كبح بلطف كل الماوس عن طريق استيعاب الحيوان عن طريق الجلد فضفاض من الرقبة والظهر وذلك لشل حركة الرأس. استخدام إصبع الخنصر إلى كبح بلطف ذيل الحيوان، رHUS تعريض فتحة الشرج. التأكد من أن الحيوان لا نطق أو تظهر علامات أخرى من الشدة أثناء ضبط النفس.
      2. عقد العقيمة، أنبوب microcentrifuge وزنه مباشرة تحت فتحة الشرج الحيوان. ومن الضروري أن الأنبوب لا يأتي في اتصال مباشر مع الماوس.
         1. كما يتبرز الحيوان، وجمع بيليه البراز في أنبوب. الحفاظ على أنبوب في درجة حرارة الغرفة حتى يتم جمع كل العينات البرازية. يمكن أن يستغرق عدة دقائق للماوس لالتبرز، مما يستلزم محاولات تكرار لجمع البراز.
      3. وزن الأنابيب التي تحتوي على البراز على نطاق والتحليلي. تسجيل الوزن أنبوب، التقريب إلى أربعة منازل عشرية (على سبيل المثال، 1.0021 ز). دلالة على الوزن التي يتم الحصول عليها من "الوزن أنبوب النهائي."
      4. تمرير العينات البرازية في غرفة اللاهوائية للتعداد البكتيريا مباشرة بعد جمع البراز.
   2. جمع العقيمة من المحتويات الماوس الأعور في وقت التشريح
      1. بعد القتل الرحيم إنسانية من خلال CO ₂ الخنق تليها تدابير الثانوية، إجراء تشريح للحصول على الأعور ^25. الأعور هو، قسم كبير على شكل فاصلة في الجهاز الهضمي.
      2. ضع الأعور على طبق بتري بلاستيكية معقمة. استخدام المتاح، لا العقيمة. 10 شفرة مشرط لقطع الأعور مفتوحة من نهاية الطرف من الحقيبة لفضح محتويات الأعور.
         1. استخراج بلطف محتويات الأعور عن طريق الضغط الخفيف مع شفرة مشرط وتجتاح محتويات نحو الجزء قطعي من الأعور.
            ملاحظة: يجب الحرص على عدم تعطيل الأنسجة الأعور، الذي سيتم تقديمه للفحص الأنسجة.
      3. وضع محتويات الأعور إلى ذلك، أنبوب microcentrifuge العقيمة وزنه مباشرة بعد جمع. فقط حوالي 10 ملغ من محتوى الأعور هو مطلوب لتعداد البكتيريا.
      4. وزن الأنابيب التي تحتوي على محتوى الأعور على SCAL التحليليه. تسجيل الوزن أنبوب، التقريب إلى أربعة منازل عشرية (على سبيل المثال، 1.0021 ز). دلالة على الوزن التي يتم الحصول عليها من "الوزن أنبوب النهائي."
      5. تمرير عينات المحتوى الأعور في غرفة اللاهوائية للتعداد البكتيري.
2. التعداد البكتيري C. صعب
   1. حساب الوزن النهائي للمحتويات (البراز أو أعوري) التي سيتم المذكورة لC. صعب. يقوم هذا عن طريق طرح "الوزن أنبوب النهائي" من "الوزن أنبوب."
   2. حساب 1:10 التخفيف من المحتويات في برنامج تلفزيوني 1X و resuspend وفقا لذلك. الكريات البرازية، استخدم غيض من ماصة لتعطيل بلطف بيليه في الحل (راجع الملف التكميلي "الحسابات مثال").
   3. لا هوائيا احتضان هذه العينات معلق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، والسماح للمحتويات ليستقر.
   4. جعل التخفيفات التسلسلية لكل عينة في برنامج تلفزيوني 1X لالتعدادمواصلة النظر في كفو لكل غرام من المحتوى (البراز أو أعوري). تنفيذ هذا هوائيا.
   5. باستخدام تقنية العقيم، ونقل 100 ميكرولتر من كل تخفيف التسلسلي لوحات TCCFA. استخدام معقم على شكل حرف L رش، نشر تخفيف تطبيقها على وسائل الإعلام لنشر بالتساوي ذلك عبر لوحة. حتى انتشار التخفيف من الضروري لتعداد دقيق للمستعمرات.
   6. احتضان لوحات هوائيا لمدة 24 ساعة على 37 درجة مئوية. في هذا الوقت، تعداد جيم المستعمرات صعب الحصول على كفو في غرام من المحتوى (البراز أو أعوري). جيم المستعمرات صعب مسطحة وشاحب اللون الأصفر ولها حواف غير منتظمة والزجاج مظهر الأرض ^24.
      ملاحظة: هذا البروتوكول يمكن استخدامها لتعداد C. صعب من غيرها من المحتويات GI الفئران، بما في ذلك فائفي ومحتوى القولون. لوحات PCR يمكن استخدامها لصنع التخفيفات المسلسل.

5. فيرو الخلية السمسة الفحص لتحديد C. صعب السمية Cytotoxiمدينة

ملاحظة: من المستحسن أن يتم إجراء هذا الاختبار بعد الانتهاء من نموذج الفأر على العينات التي تم جمعها في تشريح وتخزينها في -80 درجة مئوية. تقنيات زراعة الخلايا العقيم ضرورية لمنع التلوث من خلايا الفيرو خلال هذا الاختبار. هذا البروتوكول يأخذ 2 أيام لأداء. يجب أن يتم تخزين جميع البراز ومحتوى الأمعاء المستخدمة في هذا الاختبار في، أنبوب microcentrifuge العقيمة وزنه (الرمز مع "الوزن أنبوب،" انظر القسم أعلاه). يتم قياس الوزن أنبوب النهائي (بما في ذلك المحتويات) عبر نطاق التحليلي إلى أقرب أربعة أرقام عشرية (انظر أعلاه). من المستحسن استخدام ماصة متعدد القنوات لهذا الاختبار.

ملاحظة: قبل البدء، تأكد من أن تتوفر العناصر التالية: خلايا فيرو، تعديل Dulbecco والنسر المتوسط ​​(DMEM) 1X مع 10٪ للحرارة المعطل مصل الجنين البقري (FBS) و 1٪ البنسلين / وسائل الإعلام الستربتومايسين (يرمز لها "DMEM 1X وسائل الإعلام، "انظر المواد وملف إضافي)، 0.25٪التربسين- EDTA، برنامج تلفزيوني 1X، 0.4٪ التريبان الأزرق، 96-جيدا ثقافة خلية لوحة القاع شقة، لوحة تصفية 96-جيدا، المطثية العسيرة السمية ألف (قسامة في 3 ميكرولتر في 1 ميكروغرام / ميكرولتر في الماء فائقة البحتة و مخزن في -80 درجة مئوية)، المطثية العسيرة الترياق، ورقة عمل (لإجراء العمليات الحسابية وخرائط لوحة، وانظر ملفات إضافية).

وينبغي اتخاذ الحذر خلال هذا الاختبار للتعرض الأفراد إلى C. صعب والسمية لها: ملاحظة.

1. تقسيم خلايا فيرو (يوم 1)
   1. سخن وسائل الاعلام DMEM 1X، 0.25٪ التربسين-EDTA، وبرنامج تلفزيوني 1X في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   2. الحصول على قارورة من الخلايا فيرو من الحاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂₎ ووضعه في الثقافة خلية غطاء تدفق الصفحي العقيمة. استخدام 70٪ من الإيثانول لمسح أسفل غطاء محرك السيارة والمعدات قبل استخدامها. باستخدام ماصة المصلية، نضح في وسائل الاعلام من قارورة زراعة الأنسجة لإزالته من الخلايا فيرو وتخلص منه في النفايات جontainer.
   3. شطف خلايا فيرو مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X (مسخن) في قارورة زراعة الأنسجة. نضح في برنامج تلفزيوني وتخلص منه في حاوية النفايات.
   4. إضافة 5 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA إلى قارورة زراعة الأنسجة. السماح لوقت الاتصال من 2-3 دقيقة. خلال هذا الوقت، ومراقبة الخلايا تبدأ تؤتي ثمارها على سطح القارورة. صخرة بلطف الأنسجة الجانب الثقافة قارورة إلى جنب لتخفيف خلايا فيرو.
   5. بعد وقت الاتصال مع التربسين-EDTA، على الفور إضافة 5 مل من DMEM 1X وسائل الإعلام في قارورة زراعة الأنسجة. هذا وسوف تحييد التربسين-EDTA. استخدام هذا الحل لغسل بلطف أي خلايا الفيرو غير مرتبط من الجزء الخلفي من القارورة. ثم، واستخدام ماصة المصلية لنقل هذا الخليط في أنبوب مخروطي 15 مل.
   6. الطرد المركزي الخلايا فيرو في أنبوب مخروطي الشكل لمدة 5 دقائق في 180 x ج و 25 درجة مئوية. تأكد من أن أجهزة الطرد المركزي متوازن بشكل صحيح. بعد الطرد المركزي، ومراقبة بيليه المرئي من خلايا الفيرو في الجزء السفلي من أنبوب مخروطي الشكل. يجب الحرص على عدم disrUPT هذا بيليه. نضح من طاف من أنبوب مخروطي الشكل وتخلص منه.
   7. resuspend الخلايا فيرو في 3 مل من DMEM 1X وسائل الإعلام.
2. عد خلايا الفيرو
   1. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية فيرو (صنع في الخطوة 5.1.7) إلى 100 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان الأزرق. المزيج بلطف بواسطة pipetting الحل صعودا وهبوطا.
   2. إضافة 10 ميكرولتر من هذا الخليط لكل غرفة من عدادة الكريات.
   3. حساب عدد خلايا قابلة للحياة في الأرباع الأربعة للعدادة الكريات. والخلايا الميتة فيرو يستغرق التريبان الأزرق، وبالتالي سيتم الملون الأزرق (لا ينبغي أن تحسب هذه الخلايا). تسجيل هذه الأرقام في "ورقة عمل خلية فيرو"، المقدمة.
   4. خلاصة القول أن العدد الكلي للخلايا فيرو قابلة للحياة في جميع الأرباع الأربعة وحساب المتوسط. ضرب من قبل عامل التخفيف، والذي هو 2 منذ 100 ميكرولتر من الخلايا هي في ما مجموعه 200 ميكرولتر من السائل.
   5. ضرب من قبل عامل التصحيح لإعطاء "وعدد من خلية / مل "عند استخدام عدادة الكريات، ومعامل التصحيح هو دائما 10 ⁴ ضرب على الحجم الكلي لإعطاء". العدد الكلي للخلايا ".
3. تحديد عدد الآبار المطلوبة لكل تجربة
   ملاحظة: عينة واحدة (أي البراز أو محتوى الأمعاء) يتطلب 24 بئرا منفصلة التي يتعين القيام بها في نسختين. مطلوب تركيز 10 ⁵ خلايا فيرو لكل بئر (الحجم الكلي لل90 ميكرولتر).
   ملاحظة: إذا كان أحد يرغب في احتضان خلايا فيرو لوحات 96-جيدا ليلا 37 درجة مئوية، وتركيز من 10 ³ خلايا فيرو لكل بئر ينصح لحساب فترة حضانة طويلة. سوف تحتاج إلى تعديل لمراعاة هذا التغيير الحسابات داخل ورقة عمل خلية فيرو.
   1. تحديد عدد الآبار التي يمكن استخدامها على أساس كمية من خلايا الفيرو المتاحة (من الخطوة 5.2، واستخدام ورقة عمل خلية فيرو، المقدمة).
   2. تحديد حجمفيرو تعليق خلية اللازمة لملء عدد من الآبار المطلوب (على أساس عدد العينات التي يجري اختبارها). تأكد من أن يتم إضافة أي الحجم الإضافي في لحساب pipetting لخطأ (استخدم المقدمة فيرو ورقة عمل الخلية).
   3. تمييع تعليق خلية فيرو (تم الحصول عليها في الخطوة 5.1.7) في وسائل الاعلام DMEM 1x إلى الحصول على الكمية المطلوبة للتجربة.
4. خلايا فيرو بذر إلى 96 جيدا ثقافة خلية لوحة
   1. استخدام الخلية إعادة تعليق فيرو من الخطوة 5.3.2، واستخدام ماصة متعدد القنوات لإضافة 90 ميكرولتر من تعليق خلية فيرو إلى كل بئر من 96-جيدا ثقافة خلية لوحة القاع شقة.
   2. احتضان لوحة مع الخلايا فيرو في حاضنة الثقافة خلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ مدة لا تقل عن 4 ساعات قبل أن يضيف السم (عينات) إلى الآبار. هذه فترة حضانة سوف تسمح للخلايا الفيرو على الانضمام إلى الجزء السفلي من كل بئر.
5. خلق الحلول المالية من عينات (البراز أوالمحتوى المعوي)
   ملاحظة: يجب أن يكون لجميع العينات "الوزن أنبوب" و "الوزن أنبوب النهائي" يقاس عن طريق مقياس تحليلي. استخدام فيرو ورقة عمل خلية للحسابات.
   1. حساب الوزن من محتويات. تحويل ز إلى ملغ، ثم ملغ إلى ميكرولتر. حساب العدد الإجمالي النهائي للميكرولتر من محلول اللازمة لجعل تخفيف 01:10 في برنامج تلفزيوني 1X. حساب المبلغ الإجمالي من برنامج تلفزيوني 1X إضافة إلى عينة.
   2. إضافة الحجم الكلي للبرنامج تلفزيوني 1X (محسوبة أعلاه) للعينة. تنفيذ هذا هوائيا، واستخدام تقنية العقيم. الكريات البرازية، استخدم غيض من ماصة لتعطيل بلطف بيليه في الحل.
   3. دوامة العينات ثم الطرد المركزي لها في 3522 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن أجهزة الطرد المركزي متوازن بشكل صحيح. يجب الحرص على عدم تعطيل بيليه و resuspend العينة إلى حل.
      ملاحظة: أثناء الخطوة 5.5.3، إذا كان يتم معالجة سوى عدد قليل من العينات، محتويات يمكن تعقيمها من قبلتمريرها من خلال واحد مرشح 0.22 ميكرومتر بدلا من استخدام فلتر لوحة 96-جيدا. قد تتطلب بعض عينات عدة مرشحات لتعقيم محتوى حجم بأكمله باستخدام هذه التقنية.
   4. تعقيم عينة / PBS الخليط عن طريق أخذ 150 ميكرولتر من طاف ووضعه في آبار منفصلة على فلتر لوحة 96-جيدا. وضع لوحة مرشح بشكل آمن على رأس 96-جيدا ثقافة خلية لوحة مسطحة القاع بحيث محتويات سوف تصفية في هذه اللوحة.
   5. الطرد المركزي فلتر لوحة / خلية لوحة الثقافة المكدس في 431 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن أجهزة الطرد المركزي متوازن بشكل صحيح وأن / خلية كومة وحة الثقافة فلتر لوحة تتماشى بإحكام ولن تحول خلال الطرد المركزي.
      ملاحظة: هذه المحتويات التي تمت تصفيتها هي الأسهم 10 ^-1 التي سوف تستخدم في لوحات التخفيف.
   6. وضع لوحة مع العينات التي تمت تصفيتها على الجليد.
6. خلق التخفيف لوحة رقم 1
   ملاحظة: التخفيف جيش التحرير الشعبى الصينىوالشركة المصرية للاتصالات رقم 1 (DP 1 #) تتطلب 6 آبار في العينة، بما في ذلك إيجابيا (جيم العسيرة السمية أ) والسالب (برنامج تلفزيوني 1X) ضوابط (انظر موانئ دبي # 1 تخطيط على ورقة عمل خلية فيرو).
   1. لإعداد مراقبة إيجابية (جيم العسيرة السمية أ) لهذا الاختبار، يجب الحصول قسامات 3 ميكرولتر (1 ميكروغرام / ميكرولتر) من -80 درجة مئوية وإضافة 297 ميكرولتر من الماء عالى النقاء، مما أسفر عن تركيز النهائي من 0.01 ميكروغرام / ميكرولتر. مكان على الجليد.
   2. تسمية الآبار مع التخفيفات من (10 ^-1 إلى 10 ^-6) لكل عينة، وبيان الضوابط الإيجابية والسلبية (انظر موانئ دبي # 1 تخطيط).
   3. إضافة كميات مناسبة من برنامج تلفزيوني 1X إلى كل بئر. في 10 ^-1 الآبار، إضافة NO برنامج تلفزيوني. ل10 ^-2 الى 10 ^-6 الآبار، إضافة 90 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X.
   4. إضافة كميات مناسبة من العينات إلى كل بئر. في 10 ^-1 الآبار، إضافة 100 ميكرولتر من الأسهم 10 ^-1 لكل عينة (راجع الخطوة 5.5.7 من بلات فلتره). ل10 ^-2 الى 10 ^-6 الآبار، وجعل التخفيفات المسلسل. تبدأ من خلال اتخاذ 10 ميكرولتر من البئر 10 ^-1 وإضافته إلى ^-2 10 أيضا. مواصلة التخفيفات المسلسل إلى التخفيف 10 ^-6.
   5. تغطية موانئ دبي # 1 لوحة مع واضح الختم لاصق من البلاستيك ووضعها على الجليد.
7. خلق التخفيف اللوحة رقم 2
   ملاحظة: لوحة لتخفيف (DP # 2) سيتطلب 2 حارات 6 آبار لكل عينة، بما في ذلك الضوابط الإيجابية والسلبية (انظر موانئ دبي # 2 تخطيط على ورقة عمل خلية فيرو).
   1. تسمية الآبار مع التخفيفات من (10 ^-1 إلى 10 ^-6) لكل عينة، وبيان الضوابط الإيجابية والسلبية (انظر موانئ دبي رقم 2 التخطيط). تسمية الآبار مع اسم العينة (يشار إليها باعتبارها "آبار عينة") أو اسم عينة مع الترياق (يرمز لها "آبار الترياق").
   2. حساب كمية من الترياق اللازم لهذا الاختبار. ملاحظة: إن الترياق هو المخزون 25Xالحل الذي يحتاج إلى أن تضعف 01:25 في برنامج تلفزيوني 1X. وضع استعداد الترياق 1X الحل على الجليد.
   3. ل "آبار عينة"، إضافة 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X إلى كل بئر لجميع التخفيفات (10 ^-1 إلى 10 ^-6) من تلك العينة. ل "آبار الترياق"، إضافة 20 ميكرولتر من 1X الترياق إلى كل بئر لجميع التخفيفات (10 ^-1 إلى 10 ⁶⁾ من تلك العينة.
   4. نقل 20 ميكرولتر من العينة المخفف في الآبار من موانئ دبي # 1 في الآبار المعينة على موانئ دبي رقم 2 للصفوف 1-6 والصفوف 7-12 (انظر موانئ دبي # 2 تخطيط على ورقة عمل خلية فيرو). مزيج الحل بلطف بواسطة pipetting صعودا وهبوطا.
   5. تغطية موانئ دبي رقم 2 مع واضح الختم لاصق من البلاستيك والسماح 40 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة. هذه الحضانة هو السماح للالترياق لربط وبالتالي على تعطيل وتحييد جيم السم العسيرة.
   6. بعد الحضانة، إضافة 10 ميكرولتر من خليط من موانئ دبي رقم 2 لآبار خلية فيرو المناسبة (انظر فيرو تخطيط لوحة الخلية على Vايرو ورقة عمل الخلية). المزيج بلطف حل عن طريق pipetting صعودا وهبوطا، مع الحرص على عدم تعطيل الخلايا فيرو التي انضمت إلى السطح السفلي من الآبار.
   7. احتضان لوحة خلية فيرو بين عشية وضحاها في حاضنة الثقافة خلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
8. تقييم خلايا فيرو لتقريب باستخدام مجهر الضوء (اليوم 2)
   ملاحظة: أذكر أن التغييرات عامل التخفيف بمعامل 10 عند إضافة خليط من العينة إلى لوحة خلية فيرو (على سبيل المثال، 10 ^-3 الآن 10 ^-4). يجب أن الآبار التي لديها الترياق الحالي ليس لديهم أي خلية التقريب فيرو لاحظت. وسوف يلاحظ فيرو التقريب الخلية (السمية الخلوية) في عينات التي تحتوي على جيم صعب السم. إذا تم تحييد النشاط السامة للخلايا في تخفيف تحتوي على عينة والترياق، وأكدت وجود جيم السم العسيرة مما أدى إلى فيرو الخلايا السمية الخلوية.
   1. دراسة لفيرو الخلية التقريب باستخدام من lighر المجهر في 200X التكبير. للآبار عينة (بما في ذلك مراقبة إيجابية)، تسجيل التخفيف من البئر الذي هو آخر أن يكون 80٪ فيرو الخلية التقريب لاحظ.
   2. حساب عيار السامة للخلايا، والذي يعرف بأنه مقلوب أعلى التخفيف التي تنتج 80٪ فيرو التقريب خلية لكل غرام من العينة. على سبيل المثال، إذا كان أعلى تخفيف 10 ^-5، ثم عامل التخفيف سيكون 10 ^-6 لهذه العينة. وهكذا، سجل [عامل التخفيف النهائي] / غرام من العينة سيتم تسجيل [10 ^6]، والتي ينتج عيار المتبادل لل6.
      ملاحظة: خلايا الفيرو تحتاج إلى خضعت ما لا يقل عن 3-4 الممرات وليس أكثر من 30 مقاطع قبل استخدامها في هذا الاختبار ^26.

النتائج

أثناء دراسة التمثيل، وسابقة التجهيز من العمر 5 أسابيع C57BL / 6 الفئران WT مع سيفوبيرازون في مياه الشرب (0.5 ملغ / مل) لمدة 5 أيام، وسمح ليوم 2 تغسل مع مياه الشرب العادية. وقد تم الطعن الفئران مع 10 ⁵ أبواغ C. صعب R20291 خلال أنبوب تغذية عن طريق الفم في يوم...

Discussion

This protocol characterizes the clinical course, including weight loss, bacterial colonization, toxin cytotoxicity, and histopathological changes in the gastrointestinal tract, of antibiotic-treated mice challenged with C. difficile R20291 spores. There are several critical steps within the protocol where attention to detail is essential. Accurate calculation of the C. difficile spore inoculum is critical. This calculation is based on the original C. difficile spore stock enumeration, which sho...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner	SSS Navigator	48027	This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter	Fisherbrand	09-720-3	Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
0.4% Trypan Blue	Gibco	15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin	Gibco	15070-063
10% heat inactivated FBS	Gibco	16140-071	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
1 ml plastic syringe	BD Medical Supplies	309628
1x PBS	Gibco	10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap	Corning	430917
96 well cell culture flat bottom plate	Costar Corning	CL3595
96 well filter plate	Millipore	MSGVS2210
Adhesive Seal	ThermoScientific	AB-0558
Bacto Agar	Becton Dickinson	214010	Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone	Becton Dickinson	211684	Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone	MP Bioworks	199695
Cefoxitine	Sigma	C47856	Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit	Tech Labs	T5000	Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A	List Biological Labs	152C	Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine	Sigma	C6880	Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water	Gibco	15230
DMEM 1x Media	Gibco	11965-092	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
Fructose	Fisher	L95500	Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer	Bright-Line, Sigma	Z359629
KH2PO4	Fisher	P285-500	Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous)	Sigma	M2643	Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter	Millex-GS	SLGS033SS	Filter for TCCFA plates
Na2HPO4	Sigma	S-0876	Part of TCCFA plates (see below)
NaCl	Fisher	S640-3	Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade	Miltex, Inc	4-410
PCR Plates	Fisherbrand	14230244
Plastic petri dish	Kord-Valmark Brand	2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader	Fisherbrand	14-665-230
Syringe Stepper	Dymax Corporation	T15469
Taurocholate	Sigma	T4009	Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	664	Mice should be 5 - 8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope	Olympus Life Science
DP27 camera	Olympus Life Science
cellSens Dimension software	Olympus Life Science