بروتوكول لعن طريق نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) أجهزة الاستشعار لقياس -Force القوات الميكانيكية عبر مجمع ينك النووية

Summary

A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.

Abstract

The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.

Introduction

قوة الحساسة، وقد ظهرت أجهزة الاستشعار الحنق المشفرة وراثيا في الآونة الأخيرة بوصفها أداة هامة لقياس القوى القائم على الشد في الخلايا الحية، وتوفير نظرة ثاقبة كيف القوات الميكانيكية يتم تطبيقها عبر البروتينات ^{1، 2، 3، 4.} مع هذه الأدوات، يمكن للباحثين صورة غير جراحية القوات داخل الخلايا في الخلايا الحية باستخدام المجهر الفلورسنت التقليدية. تتكون هذه المجسات من الحنق الزوج (المانحة والفلورسنت متقبل البروتينات، في معظم الأحيان متبرع الأزرق والأصفر متقبل) مفصولة الببتيد مرنة ^3. وعلى النقيض من C- أو علامات N-الطرفية، يتم إدخال هذا الاستشعار إلى موقع داخلي من البروتين لقياس قوة ميكانيكية تنتقل عبر البروتين، ويتصرف باعتباره قياس الضغط الجزيئي. زيادة التوتر الميكانيكية عبر نتائج الاستشعار عن زيادة المسافة بين الحنق فالهواء، مما أدى إلى انخفاض الحنق ^3. ونتيجة لذلك، يرتبط الحنق عكسيا مع قوة الشد.

وقد وضعت هذه المجسات على أساس الفلورسنت للبروتينات التنسيق التصاق (فينكولين ³ و تالين ^4)، والبروتينات هيكل الخلية (α-actinin ^5)، والبروتينات خلية خلية تقاطع (E-كادهيرين ^{6 و 7} و VE كادهيرين ^8، وPECAM ^8). ومن المعروف رابط مرونة الأكثر استخداما وتتميز بشكل جيد في هذه المستشعرات الحيوية كما TSmod ويتكون من سلسلة متكررة من 40 الأحماض الأمينية، (GPGGA) _8، والتي كانت مستمدة من سوطي الشكل العنكبوت بروتين الحرير. وقد تبين TSmod أن يتصرف باعتباره الخطي مرنة نانو الربيع، مع الاستجابة الحنق إلى 1-5 السندات الإذنية من قوة الشد ^3. أطوال مختلفة من سوطي الشكل يمكن استخدامها لتغيير دينامية صآنج من حساسية TSmod الحنق القوة ^9. بالإضافة إلى سوطي الشكل، إسبكترن يكرر ⁵ و villin خوذة الببتيد (المعروف باسم HP35) ⁴ وقد استخدمت مثل الببتيدات مرنة بين الحنق أزواج في أجهزة الاستشعار قوة مماثلة ^4. وأخيرا، أظهر تقرير صدر مؤخرا أن TSmod يمكن أيضا أن تستخدم لكشف قوات الضغط ^10.

نحن وضعت مؤخرا جهاز استشعار القوة لرابط للنواة-الهيكل الخلوي (لينك) بروتين معقد Nesprin2G باستخدام TSmod إدراجها في بروتين Nesprin2G اقتطاع التي سبق وضعها المعروفة باسم مصغرة Nesprin2G (الشكل 2C)، الذي يتصرف على نحو مماثل لالذاتية Nesprin-2G ^11. يحتوي المجمع ينك البروتينات المتعددة التي تؤدي من الخارج إلى داخل النواة، ربط الهيكل الخلوي حشوية إلى الصفيحة النووية. Nesprin-2G هو البروتين الهيكلي ملزمة لكل منالهيكل الخلوي الأكتين في السيتوبلازم والبروتينات SUN في الفضاء حول النواة. باستخدام جهاز الاستشعار البيولوجي لدينا، كنا قادرين على إظهار أن Nesprin-2G يخضع لتوتر تعتمد على أكتوميوزين في الخلايا الليفية NIH3T3 ^2. وكانت هذه هي المرة الأولى التي تقاس تلك القوة مباشرة عبر البروتين في مجمع ينك النووي، وأنه من المرجح أن تصبح أداة هامة لفهم دور القوة على نواة في ميكانيكا الأحياء.

وينص البروتوكول أدناه منهجية مفصلة لكيفية استخدام جهاز استشعار القوة Nesprin-2G، بما في ذلك تعبير عن التوتر استشعار Nesprin (Nesprin-TS) في خلايا الثدييات، فضلا عن اقتناء وتحليل الصور الحنق من الخلايا معربا عن Nesprin- TS. باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب مجهزة للكشف الطيفي، وصفا لكيفية قياس الانبعاثات توعية الحنق تستخدم unmixing الطيفي ويرد ratiometric التصوير الحنق. الصور ratiometric الانتاج يمكن ان تستخدم في صنع منه النسبيمقارنات القوة ntitative. في حين يركز هذا البروتوكول على التعبير عن Nesprin-TS في الخلايا الليفية، وقابل للتكيف بسهولة لخلايا الثدييات الأخرى، بما في ذلك خطوط الخلايا والخلايا الأولية. وعلاوة على ذلك، هذا البروتوكول من حيث صلته الحصول على الصور وتحليلها الحنق يمكن بسهولة أن تتكيف مع أجهزة الاستشعار القوة القائم على الحنق الأخرى التي تم وضعها للبروتينات أخرى.

Protocol

1. الحصول Nesprin-2G الاستشعار DNA وغيره من البلازميد DNA

1. الحصول Nesprin-2G TS (جهاز استشعار التوتر) السيطرة، Nesprin-2G HL (بلا رأس)، mTFP1، فينوس، وTSmod من مصدر تجاري. نشر جميع البلازميدات DNA وتنقيتها باستخدام معيار E. سلالات القولونية، مثل DH5-α، كما هو موضح سابقا ^{12 و 13.}

2. خلايا Transfect مع Nesprin-2G وغيره من البلازميد DNA

1. تنمو NIH 3T3 الخلايا الليفية إلى خلايا 70-90٪ التقاء في 6 جيدا طبق زراعة الخلايا في حاضنة الثقافة الخلية القياسية مع درجة الحرارة (37 درجة مئوية) وتنظيم CO ₂ (5٪). على المدى المتوسط ​​نمو الخلايا، استخدم Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين.
2. في غطاء ثقافة الخلية، وإزالة المتوسطة وشطف كل جيدا مع ما يقرب من 1 مل من وسيلة خلية خفض المصل. إضافة 800 ميكرولتر من المتوسطة خلية خفض المصل إلى كل بئرووضع غرفة 6 جيدا في الحاضنة.
3. ماصة 700 ميكرولتر من خلية متوسطة خفض المصل في أنبوب 1.5 مل مع 35 ميكرولتر من محلول الدهون الناقل لتشكيل "lipomix". مزيج من قبل pipetting. تسمية الأنبوب مع "L."
4. جمع ست أنابيب 1.5 مل وتسمية لهم من 1 إلى 6. ماصة 100 ميكرولتر من المتوسطة خلية خفض المصل في كل أنبوب.
   1. عن طريق تركيز الحمض النووي البلازميد من الخطوة 1، ماصة 2 ميكروغرام من Nesprin 2G-TS في أنابيب 1 و 2. ماصة 2 ميكروغرام من Nesprin-HL في أنابيب 3 و 4. ماصة 1 ميكروغرام من mTFP في أنبوب 5. ماصة 1 ميكروغرام من mVenus في أنبوب 6. لا إعادة استخدام نصائح ماصة عندما pipetting لأنواع مختلفة من الحمض النووي.
5. ماصة 100 ميكرولتر من lipomix من أنبوب "L" في كل أنبوب المسمى (1-6)، ومزيج من قبل pipetting المتكررة. استخدام ماصة نظيفة لكل أنبوب. احتضان لمدة 10-20 دقيقة.
6. إضافة 200 ميكرولتر من كل أنبوب المسمى لبئر في غرفة 6 جيدا مع متموجة 70-90٪الخلايا. تسمية الجزء العلوي من كل بئر مع DNA المقابل المضافة. مكان الغرفة 6 جيدا في حاضنة لمدة 4-6 ساعة.
7. نضح المتوسطة وإضافة 1-2 مل من المتوسط ​​خلية خفض المصل لشطف. نضح المتوسطة خلية انخفاض مصل، إضافة 2 مل من التربسين إلى كل بئر، ووضع صحن 6 جيدا في الحاضنة (5-15 دقيقة).
8. في حين فصل الخلايا في الحاضنة، ومعطف 6 الزجاج أسفل يشاهدون أطباق بطبقة من فبرونيكتين في تركيز 20 ميكروغرام / مل حل في المياه المالحة الفوسفات مخزنة (PBS). السماح للأطباق لطلاء السطح في الخلية هود الثقافة (حوالي 20 دقيقة).
9. تحييد التربسين بإضافة 2 مل من DMEM مرة يتم فصل الخلايا.
10. نقل محتويات كل بئر إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وصفت وتدور باستمرار في 90 x ج لمدة 5 دقائق في يتأرجح الطرد المركزي الدوار. نضح طاف وإعادة تعليق كل بيليه خلية في 1000 ميكرولتر من DMEM بواسطة ماصة الاختلاط.
11. نضح الخليط فبرونيكتين منأطباق الزجاج وماصة 1000 ميكرولتر من كل تعليق الخلية على أطباق الزجاج.
12. بعد تسوية الخلايا في الجزء السفلي من الأطباق الزجاجية (~ 15 دقيقة)، إضافة 1 مل أخرى من DMEM + 10٪ FBS + 1٪ القلم بكتيريا على كل جانب ومكان في حاضنة الخلية. السماح للخلايا لنعلق والتعبير عن الاستشعار عن 18-24 ساعة على الأقل.
    و transfected الخلايا باستخدام الموجبة الكواشف ترنسفكأيشن الدهون التجارية (انظر جدول المواد): ملاحظة. بدلا من ذلك، خطوط الخلايا مستقرة يمكن اختيار باستخدام البلازميد مع الجينات التي تمنح مقاومة السم (متوفرة على موقع على شبكة الانترنت DNA مستودع البلازميدات pcDNA لNesprin-TS و-HL (انظر جدول المواد) توفير الخلايا معربا عن المقاومة geneticin ). بالإضافة إلى ذلك، طرق العدوى الفيروسية (الفيروسة البطيئة، الارتجاعي، أو اتش) يمكن استخدامها للتعبير عن جهاز استشعار في الخلايا التي يصعب ل transfect.
13. بالإضافة إلى Nesprin-TS، transfect خلايا إضافية مع HL Nesprin صفر لالسيطرة م، كما هو موضح في الخطوات 2،1-2،12. ويمكن أيضا أن تستخدم TSmod كعنصر تحكم صفر القوة وينبغي أن يحمل الحنق على غرار Nesprin-HL.
14. خلايا Transfect مع mTFP1 وفينوس لتوليد البصمات الطيفية (راجع الخطوة 4).
    ملاحظة: mTFP1 وفينوس تعبير عن عادة عند مستويات أعلى من Nesprin-TS، وعلى هذا النحو، قد تحتاج إلى transfected لتحقيق مستويات التعبير مماثلة كميات أقل من الحمض النووي.

3. التحقق من ترنسفكأيشن الكفاءة

1. ما يقرب من 18-24 ساعة بعد الانتهاء من ترنسفكأيشن، استخدام المجهر الفلورسنت المقلوب لفحص كفاءة ترنسفكأيشن بمقارنة عدد الخلايا الفلورسنت إلى العدد الكلي للخلايا في عرض (عادة 5-30٪).
   1. استخدام المجهر الفلورسنت مجهزة تردد الإثارة قرب 462 نانومتر (mTFP1) أو 525 نانومتر (فينوس) وتصفية الانبعاثات تركزت قرب 492 نانومتر (mTFP1) أو 525 نانومتر (فينوس).
      ملاحظة: بدلا من ذلك، سوف GFP تصفية مجموعات التقاط مجموعة من mTFP1 وهاءانبعاثات جامعة سنغافورة الوطنية، وسيسمح للتأكيد على كفاءة ترنسفكأيشن.
2. صورة الخلايا الحية خلال 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
   1. بدلا من ذلك، إصلاح الخلايا في 4٪ امتصاص العرق (في PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم) لمدة 5 دقائق، ومتجر في برنامج تلفزيوني، وعرض بعد 48 ساعة ^8.
      ملاحظة: ما وراء 48 ساعة، وجودة الإشارة والقوة يضمحل. تحديد الخلايا يحافظ على دولتهم، بما في ذلك الحنق الذي أعرب ^8؛ ومع ذلك، ينبغي تصوير الخلايا فقط في برنامج تلفزيوني، وتصاعد المتوسطة قد تؤثر الحنق ^14. لا يمكن إلا أن خلايا ثابتة يمكن مقارنة الخلايا الثابتة الأخرى، كما قد يكون هناك تغيير في التعبير.
      تحذير: امتصاص العرق هي سامة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE).

4. التقاط الطيفي بصمات mTFP1 والزهرة Fluorophores للالطيفي Unmixing

1. في غطاء ثقافة الخلية، استبدل المتوسطة الخلية مع جامعة المدينة العالمية التصويرم (HEPES مخزنة) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني.
2. ضع الأطباق عرض في (37 ° C) المرحلة المجهر مبائر التحكم في درجة حرارته.
3. وضع صحن زجاج العرض مع خلايا transfected mTFP1 على مدى الهدف النفط في 60X التكبير مع الفتحة العددية 1.4.
   ملاحظة: يستخدم زيت على المجهر الليزر على الهدف 60X تشبه عن كثب معامل الانكسار الركيزة الزجاج. يوضع الزيت على أعلى عدسة الهدف، ويأتي في اتصال مباشر مع ساترة الزجاج.
4. حدد موقع mTFP1 معربا عن الخلايا مع مصدر الإثارة 458 نانومتر وعامل تصفية ممر الموجة الانبعاثات تركزت في 500 نانومتر.
5. مع خلية الفلورسنت في مجال الرؤية، تحديد وضع الكشف الطيفي ( "لامبدا الوضع" في البرمجيات المستخدمة هنا) والتقاط الصورة الطيفية (الشكل 3-1). يشمل جميع الترددات وراء 458 نانومتر باستخدام 10 بزيادات نانومتر (الشكل 3-3). حدد fluoresc مشرقمنطقة الأنف والحنجرة (ROI) على الخلية (20 بكسل نصف القطر).
   ملاحظة: الشكل الطيفي للmTFP1، معربا عن ROI يجب أن تبقى ثابتة نسبيا عبر الخلية. إذا كان شكل اختلافا كبيرا، وإعادة ضبط الليزر والحصول على إعدادات لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
6. إضافة ROI الفلورسنت يعني، وكثافة طبيعية لقاعدة البيانات الطيفية بالنقر على "حفظ الأطياف إلى قاعدة البيانات."
7. تحسين قوة الليزر واكتساب بحيث يتم التوصل إلى جيدة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. سوف تختلف إعدادات لمعدات مختلفة. استخدام غير الفلورسنت، وخلايا untransfected كمرجع الخلفية، وزيادة الربح والسلطة حتى الخلايا مشرقة، ولكن ليس خارج النطاق الديناميكي للكشف (نقطة التشبع). لا ينبغي أن يكون خلايا خلفية مضان كشفها بعد المتوسط.
8. كرر العملية للخلايا transfected فينوس مع الاستثناءات التالية:
   1. تأكد من أن وتيرة الإثارة هو في 515 نانومتر، وأن ممر الموجة مرشح هو مntered قرب 530 نانومتر عند تحديد خلايا فينوس، معربا عن.
   2. في "وضع الطيفي"، استخدم تردد الإثارة من 515 نانومتر بدلا من 458 نانومتر.

5. التقاط صور غير المخلوطة

1. تبديل وضع الالتقاط إلى "الطيفي Unmixing".
2. إضافة بصمات طيفية من فينوس وmTFP1 في القنوات unmixing (الشكل 3، ارو 2).
3. تعيين الليزر الإثارة مرة أخرى إلى مصدر الأرجون 458 نانومتر.
4. ضع صحن عرض Nesprin-TS فوق الهدف النفط 60X.
5. بعد التركيز على خلية الفلورسنت مع التعبير مشرق بما فيه الكفاية، وضبط الكسب وقوة الليزر لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
   ملاحظة: منذ كفاءة الحنق من Nesprin-TS بالقرب من 20٪، ويجب أن تكون الصورة فينوس غير مخلوطة باهتة إلى حد كبير من الصورة mTFP1 غير مخلوطة. مرة واحدة وقد تم تحديد ووضع السلطة والمكاسب مقبول تكرارا، يجب أن تظل هذه المعايير المستمر لجميع صور الكابتنمحكم.
6. القبض على ما لا يقل عن 15-20 الصور خلايا Nesprin-TS مع سطوع مماثل نسبيا، وتجنب الإفراط في التشبع بكسل (تتم إزالة كافة بكسل المشبعة خلال معالجة الصور).
7. تكرار عملية التقاط صورة مع خلايا Nesprin-HL باستخدام معلمات التصوير متطابقة.

تجهيز 6. صورة ونسبة تحليل الصور

1. استخدام المصدر المفتوح يماغيج (فيجي) والبرمجيات (http://fiji.sc/)، وفتح شكل صور أصلية باستخدام BioFormats القارئ.
2. قبل عملية الصور وحساب نسبة الصور باستخدام البروتوكولات المعمول بها سابقا ^15.

النتائج

بعد بروتوكول أعلاه، تم الحصول عليها DNA البلازميد من مستودع DNA وتحويلها إلى خلايا E. القولونية. وقد تم اختيار E. القولونية التعبير عن DNA استشعار من LB / لوحات الأمبيسلين وتضخيمها في مرق LB السائل. بعد التضخيم من ناقلات، وتنقية البلازميدات DNA إلى ع...

Discussion

وهناك طريقة ومظاهرة من تصوير الخلايا الحية من التوتر الميكانيكية عبر Nesprin-2G، وهو بروتين في مجمع ينك النووي، وقد ورد أعلاه. قبل هذا العمل، تقنيات مختلفة، مثل الطموح micropipette، المغناطيسي حبة الخلوي، والمجهري ليزر الاجتثاث، وقد استخدمت لتطبيق الضغط على نواة الخلية وقياس...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nesprin-TS DNA	Addgene	68127	Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNA	Addgene	68128	Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA	Addgene	54613	Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNA	Addgene	27793	Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA	Addgene	26021	Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent Cells	Bioline	BIO-85026
Liquid LB Media	ThermoFisher	10855001	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture Plates	Sigma-Aldrich	L5667	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
Ampicillin	Sigma	A9518
Spectrophotometer	Biorad	273 BR 07335	SmartSpec Plus
quartz cuvette	Biorad	1702504	Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kit	Macherey-Nagel	740412.5	NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dish	Falcon-Corning	353046	Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media	Gibco	11995-065	DMEM(1x)
Bovine Serum	Life Technologies	16170-078
reduced serum cell media	Gibco	31985-070	Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solution	invitrogen	11668-019	Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL sterile plastic tube	Denville	c2170
Trypsin	Gibco	25200-056	0.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dish	In Vitro Scientific	D35-20-1.5-N	35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass
Fibronectin	ThermoFisher	33016015	fibronectin human protein, plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190-144	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 mL sterile centrifuge tube	Greiner bio-one	188261
swinging rotor centrifuge	Thermo electron	Centra CL2	Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hood	Forma Scientific	1284
climate controlled cell culture incubator	ThermoFisher	3596
inverted LED widefield fluorescent microscope	Life technologies	EVOS FL
Clear HEPES buffered imaging media	Molecular Probes	A14291DJ
Fetal bovine Serum	Life technologies	10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources	Zeiss	LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth Media	Newengland Biolabs	B9020s
NIH 3T3 Fibroblasts	ATCC	CRL-1658