مكون للغضروف التمايز تحريض الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الجاذبية الطرد المركزي

Summary

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Abstract

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Introduction

عيوب في الغضروف المفصلي لا تلتئم بشكل طبيعي. ونتيجة لذلك، وقف وقد اقترح زرع الخلايا كنهج واعدة لإصلاح الغضروف ضعف. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتطلب على حد سواء الحصول على عدد كاف من الخلايا الجذعية وتحريض هذه الخلايا على الخضوع التمايز المولدة للغضروف. نخاع العظم (BM) وقد استخدم على نطاق واسع كمصدر للخلايا الجذعية، لكن العزلة خلية من BM اثنين من عيوب رئيسية هي: الغزو وعدم كفاية العائد. بسبب سهولة اقتناء والأنسجة الدهنية مصدرا مفضلا للخلايا الجذعية. وأظهرت دراسات سابقة إمكانية عزل الخلايا الجذعية من الأنسجة الدهنية ويحفز التمايز المولدة للغضروف في هذه الخلايا باستخدام السيتوكينات، مثل TGF-β1 ^{1 و 2.} هذه الطرق فعالة لكنها باهظة الثمن.

باعتبارها أقل تكلفة البديل لالسيتوكينات، إجهاد يمكن استخدامها للحث على تمايز المولدة للغضروف. تحميل الميكانيكية يلعب دورا حاسما في الحفاظ على صحة الغضروف المفصلي ^3، ويمكن أن تحدث الظواهر المولدة للغضروف في خلايا مختلفة. على سبيل المثال، الضغط الهيدروليكي يدفع الظواهر المولدة للغضروف في الخلايا الاولية المستمدة من الغشاء الزليلي عبر خطة عمل البحر المتوسط كيناز / JNK مسار ^4، والضغط الميكانيكي يدفع تكون الغضروف في الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (اللجان الدائمة) من خلال upregulating الجينات chondrocytic ^5. وبالإضافة إلى ذلك، إجهاد القص يساهم في التعبير عن ذات الصلة تكون الغضروف المصفوفة خارج الخلية (ECM) في اللجان الدائمة الإنسان ^6. خطورة الطرد المركزي (م)، وإجهاد تطبيقها بسهولة والتحكم التي تم إنشاؤها بواسطة الطرد المركزي، يمكن أن تحفز التعبير الجيني الفرق في الخلايا ^7. على سبيل المثال، في خلايا سرطان الرئة الظهارية، وupregulated التعبير عن انترلوكين (IL) -1b بواسطة الطرد المركزي ^8. تيherefore، باعتبارها إجهاد محرض تجريبيا، CG يمكن أن تستخدم للحث على التعبير الجيني chondrocytic في الخلايا الجذعية. ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت CG يمكن أن تحفز على تمايز الخلايا الجذعية المولدة للغضروف.

في هذه الدراسة، وجدنا أن CG يسببها upregulation من SOX9، المنظم الرئيسي لتكون الغضروف، في مخولا لصيانة طائرات الإنسان، مما أدى إلى overexpression من الجينات chondrocytic. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا مقارنة آثار CG على الغضروف مع تلك TGF-β1، وعامل النمو الأكثر شيوعا للحث في المختبر تكون الغضروف في الخلايا الجذعية.

Protocol

تمت الموافقة على هذا البروتوكول الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الكاثوليكية في كوريا (KC16EAME0162) وإجراء فقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة. تم الحصول على جميع أنسجة مع الموافقة المسبقة عن مكتوب.

1. الطرد المركزي الجاذبية تحميل وبيليه الثقافة

1. زراعة الخلايا والحصاد
   1. مخولا لصيانة طائرات الثقافة (P2-P3، انظر قائمة من المواد) في Dulbecco لتعديل المتوسطة انخفاض مستوى السكر في النسر (DMEM-LG) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / S) عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO _2.
   2. عندما تصل الخلايا 80٪ التقاء، تجاهل المتوسطة وغسل الخلايا مع 5 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
   3. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 1 ملم EDTA واحتضان لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO _2.
   4. اضغط على لوحة الثقافة بلطف، إضافة 4 مل من متوسطة جديدة، نقل الخلايا إلىأنبوب 15 مل المخروطية، وأجهزة الطرد المركزي الخلايا في 250 × ز لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
2. الطرد المركزي الجاذبية تحميل
   1. بعد الطرد المركزي (الخطوة 1.1.4)، وإزالة طاف دون الإخلال بيليه و resuspend بيليه في 10 مل من DMEM-LG مع FBS 10٪. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
   2. الفريق الاستشاري للتحميل، ونقل 2.5 × 10 ⁵ الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل جديد وأجهزة الطرد المركزي في 2400 × ز لمدة 15 دقيقة.
3. ثقافة بيليه
   1. مباشرة بعد الطرد المركزي، ونضح طاف وإضافة 500 ميكرولتر من يعرف متوسطة التمايز المولدة للغضروف (CDM، وارتفاع الجلوكوز DMEM تستكمل مع 1٪ FBS، 1٪ ITS + بريمكس، 100 نانومتر ديكساميثازون، 1X MEM غير الضرورية حل الأحماض الأمينية، 50 ميكروغرام / مل L-البرولين، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين). إضافة 50 ميكروغرام / مل من الطازجة حمض الأسكوربيك L-2-الفوسفات في كل تغيير المتوسط. كما تحكم إيجابية، لحث differentiati مكون للغضروفعلى الخلايا uncentrifuged بإضافة آلية التنمية النظيفة التي تحتوي على 10 نانوغرام / مل TGF-β1.
   2. وضع أنابيب توج فضفاضة تحتوي على الكريات في وضعية الوقوف واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO _2.
   3. تغيير المتوسط ​​كل يوم لمدة 3 أسابيع.
4. ثقافة MICROMASS
   1. مباشرة بعد الطرد المركزي (الخطوة 1.2.2، 2400 × ز لمدة 15 دقيقة)، ونضح طاف و resuspend بيليه في 10 ميكرولتر من آلية التنمية النظيفة.
   2. لتشكيل MICROMASS، وضع الخلايا معلق في وسط بئر من 24 لوحة جيدا.
   3. بعد 2 ساعة، إضافة بعناية 1 مل من آلية التنمية النظيفة إلى البئر، pipetting لضد الجدار لوحة لتجنب تعطيل MICROMASS. كما تحكم إيجابية، نفذ ثقافة MICROMASS مع خلايا uncentrifuged بإضافة آلية التنمية النظيفة التي تحتوي على 10 نانوغرام / مل TGF-β1.
   4. احتضان MICROMASS عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطب يحتوي على 5٪ CO _2.
   5. تغيير إف المتوسطريها يوم لمدة 3 أسابيع.

2. عكسي الناسخ، البلمرة المتسلسل (RT-PCR) للكشف الترانسكربتي Upregulation من مكون للغضروف التمايز علامات

1. في يوم 14، واستخدام ماصة لنقل الكريات كروي لأنبوب جديد 1.5 مل وغسلها في برنامج تلفزيوني 1X.
2. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الكريات باستخدام guanidinium ثيوسيانات الفينول كلوروفورم طريقة استخراج ^9.
3. توليف [كدنا من 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام الناسخ العكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم تعطيل انزيم على 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق).
4. أداء PCR مع الاشعال محددة للعلامات التمايز المولدة للغضروف ^10.

3. تلطيخ للكشف عن overexpression من مكون للغضروف التمايز ماركر البروتينات

1. الكريات خلية تضمين البارافين
   1. في يوم 21،استخدام ماصة للحصاد الكريات كروي وغسلها مع برنامج تلفزيوني 1X.
   2. إصلاح الكريات كروي عن طريق الغمر في 4٪ امتصاص العرق لمدة 24 ساعة.
      تحذير: لامتصاص العرق عالية السمية. تجنب ملامسة العينين والجلد، أو الأغشية المخاطية. تقليل التعرض وتجنب استنشاق أثناء التحضير. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
   3. تجاهل تثبيتي، وشطف الكريات الخلايا مع الماء منزوع الأيونات (DW).
   4. وضع طبقة واحدة من الشاش على الكاسيت ونقل الكريات الثابتة باستخدام ماصة. تغطية بيليه عن طريق طي الشاش وإغلاق غطاء كاسيت.
   5. يذوى الكريات.
      1. تزج الكريات في 70٪ من الإيثانول (ETOH) لمدة 5 دقائق على RT.
      2. تزج الكريات في 80٪ ETOH لمدة 5 دقائق على RT.
      3. تزج الكريات في 95٪ ETOH لمدة 5 دقائق على RT.
      4. تزج الكريات في 100٪ ETOH لمدة 5 دقائق على RT. كرر مرتين.
      5. تزج الكريات في 100٪ الزيلين لمدة 15 دقيقة في RT. كرر التويم.
   6. تضمين الكريات خلية ثابتة في البارافين عند 56 درجة مئوية في القالب. يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من الكريات في البارافين باستخدام نظم معالجة الأنسجة الآلي المتخصصة.
   7. قطع 5 أقسام ميكرون سميكة من الخلية بيليه جزءا لا يتجزأ من البارافين باستخدام مشراح الدوارة.
   8. تعويم المقاطع في 50٪ ETOH ومن ثم نقلها إلى حمام الماء 50 درجة مئوية باستخدام الشرائح.
   9. ضع أقسام عائمة على الشرائح.
2. سفرانين يا وتلطيخ الأزرق الألسيان
   1. ترطيب أقسام البارافين.
      1. تزج الشرائح في الزيلين لمدة 15 دقيقة. كرر مرتين.
      2. تزج الشرائح في 100٪ ETOH لمدة 5 دقائق. كرر مرتين.
      3. تزج الشرائح في 90٪ ETOH لمدة 5 دقائق.
      4. تزج الشرائح في 80٪ ETOH لمدة 5 دقائق.
      5. تزج الشرائح في 70٪ ETOH لمدة 5 دقائق، ثم غسلها في برنامج تلفزيوني 1X.
   2. وصمة عار على أقسام ممهى مع 1٪ سفرانين يا حل و 3٪ الأزرق الألسيان ل30 دقيقة.
   3. تجاهل الحل تلطيخ وشطف المقاطع مع DW.
   4. وصمة عار على أقسام مع حل الهيماتوكسيلين / يوزين (مباين) لمدة 1 دقيقة.
   5. تجاهل الحل تلطيخ وشطف المقاطع مع DW.
   6. ضع قطرة من متوسطة متزايدة على ساترة بعد إزالة أي المياه المتبقية. وضع بعناية الشريحة (الجانب الخلية أسفل) على ساترة تحتوي على المتوسطة المتزايدة.
   7. السماح للشرائح حتى يجف لمدة 2-3 ساعة عند RT.
   8. التقاط الصور باستخدام المجهر مشرق الميدان (الآلي المجهر تستقيم، 50X و200X).
3. المناعي فحص
   1. ترطيب أقسام كما هو موضح في القسم 3.2.1.
   2. تزج الشرائح في المخزن سيترات الصوديوم (10 ملي سيترات الصوديوم، 0.05٪ توين 20، ودرجة الحموضة 6.0)، ثم الحفاظ عليها عند درجة حرارة الغليان الفرعية لمدة 10 دقيقة باستخدام الميكروويف.
   3. تبريد الشرائح لمدة 20 دقيقة في RT ثم غسلها بماء الصنبور.
   4. احتضان الشرائح في 3٪H ₂ O ₂ (في برنامج تلفزيوني 1X) لمدة 15 دقيقة، ثم يغسل لهم ماء الصنبور لمدة 15 دقيقة ^11.
   5. منع الشرائح مع عازلة تمنع (10٪ مصل الماعز العادي في برنامج تلفزيوني) لمدة 1 ساعة.
   6. نضح عرقلة الحل، ومن ثم تطبيق الأجسام المضادة الأولية المخفف مع 5٪ مصل الماعز العادي على الشرائح.
   7. احتضان الشرائح بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   8. غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   9. احتضان الشرائح في الأجسام المضادة الثانوية-تألقي مترافق المخفف مع 5٪ مصل الماعز العادي لمدة 1 ساعة على RT في الظلام.
   10. غسل الشرائح ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق كل في الظلام.
   11. احتضان الشرائح مع دابي (1 ميكروغرام / مل) لمدة 10 دقيقة، ثم يغسل لهم مرتين في برنامج تلفزيوني 1X لمدة 5 دقائق لكل منهما.
   12. ضع قطرة من متوسطة متزايدة على ساترة بعد إزالة أي المياه المتبقية. وضع بعناية الشريحة (الجانب الخلية أسفل) على تصاعد المتوسط.
   13. السماح للشرائح حتى يجف لمدة 2-3ساعة في الظلام في RT.
   14. تصور الشرائح باستخدام المجهر مضان (Rhod: 594 نانومتر، دابي: 340 نانومتر؛ 60X والتكبير 200X) ^12.

النتائج

خطورة الطرد المركزي تحرض على overexpression من علامات التمايز المولدة للغضروف في الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة.

لتحديد درجة قوة الجاذبية الطرد المركزي التي هي مناسبة للحث على تمايز المولدة للغضرو...

Discussion

الدولة stemness الخلايا مهمة جدا ل overexpression الناجم عن CG-من SOX9. في دراستنا، يمكن أن يتسبب التعبير SOX9 التي كتبها CG في مخولا لصيانة طائرات المبكر مرور (2-3)، ولكن ليس في مخولا لصيانة طائرات في وقت لاحق-مرور. وقد أفيد أنه خلال زراعة، مخولا لصيانة طائرات تحتوي على CD34 + الخلايا حتى 3 ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasticware
100 mm Dish	TPP	93100
60 mm Dish	TPP	93060
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
ASC Culture Media Materials
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM Low glucose	Life Technologies	11885-084	growth base media
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	10%
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucose	Life Technologies	11995	chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D2915	100 nM
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	1%
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	16000-044	1%
Ascorbate-2-phosphate	Sigma Aldrich	A8960	50 μg/mL
L-proline	Sigma Aldrich	P5607	50 μg/mL
ITS	BD	354352	1%
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	10 ng/mL
Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate	Molecular Probe	A-11037	1:200
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)	Catholic MASTER Cells