JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Abstract

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.

The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Introduction

الخلايا الجذعية (DCS) هي الخلايا العارضة للمستضد المتخصصة أهم من نظام المناعة لدينا. غير ناضجة البلدان النامية (البلدان الجزرية النامية) يقيمون في الجلد أو في الأنسجة المخاطية وبالتالي هي من بين الخلايا المناعية الأولى للتفاعل مع مسببات الأمراض الغازية. وتمثل البلدان النامية الجسر بين الفطرية ونظام المناعة التكيفية 1، لأنها يمكن أن تفعيل البائية والخلايا الردود التالية الكشف عن العوامل المسببة للأمراض. وعلاوة على ذلك، لأنها تسهم في الاستجابات المناعية الموالية للالتهابات بسبب إفراز كميات عالية من السيتوكينات، مثل IL-1β، IL-6، و IL-12. البلدان النامية أيضا تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية وجذب الخلايا المناعية الأخرى إلى موقع الإصابة التي كتبها الكيميائي.

ويمكن تقسيم البلدان النامية إلى خلايا غير ناضجة شجيري (البلدان الجزرية النامية) والخلايا الجذعية الناضجة (mDCs) 2 بناء على التشكل وظيفة. بعد الاعتراف مستضدات الخارجية من جانب واحد من العديد من مستقبلات التعرف على الأنماط (على سبيل المثال، مثل عدد المستقبلات، C-نوعيكتينس، أو تكمل مستقبلات) أعرب بوفرة على سطح الخلية، البلدان الجزرية النامية تخضع لتغييرات كبيرة وتبدأ في النضج. وخلال هذه العملية النضج، ومستقبلات لالتقاط مستضد وأسفل تنظيم، في حين أن جزيئات أساسية لتقديم المستضد ويصل ينظم 3. ناضجة البلدان النامية يصل تنظيم معقد التوافق النسيجي الكبير الأول والثاني (MHC الأول والثاني)، وشارك في تنشيطية الجزيئات مثل CD80 و CD86، التي تعتبر ضرورية لتقديم المستضد وتنشيط الخلايا اللمفاوية التائية. بالإضافة إلى ذلك، هو فعل للتعبير عن CCR7 مستقبلات chemokine على سطح الخلية، والتي تمكن من الهجرة من البلدان النامية من الأنسجة الطرفية إلى الغدد الليمفاوية. وسهلت الهجرة من قبل "المتداول" من البلدان النامية على طول يجند chemokine 19 (CCL19 / MIP-3B) وchemokine يجند 21 (CCL21 / SLC) التدرج إلى الغدد الليمفاوية 4-6.

وبعد الهجرة، mDCs تقديم المستضد تجهيزها لالسذاجة خلايا CD4 + و CD8 + T، وبالتالي رسائل كتبها هذا المؤلفtiating استجابة مناعية التكيف ضد الغازي الممرض 7. ويرتبط هذا التفاعل مع الخلايا التائية في الغدد الليمفاوية أيضا مع انتشار الفيروس 8. وكشفت الدراسات في المختبر الأخرى التي البلدان النامية التقاط بكفاءة ونقل فيروس نقص المناعة البشرية إلى خلايا T وأن هذه النتائج انتقال الى عدوى نشطة 9-12. هذه التجارب تبرز أن في الجسم الحي فيروس نقص المناعة البشرية يستغل البلدان النامية كما المكوكات من المحيط إلى الغدد الليمفاوية. خلال تقديم المستضد، البلدان النامية تفرز المحفزة الرئيسية التي تحدد شكل التفريق بين المستجيب الخلايا التائية المساعدة، وبالتالي، يتم تحديد نتائج الاستجابة المناعية كلها ضد ميكروب في هذا التفاعل جدا. وبصرف النظر عن نوع 1 (TH1) والنوع 2 (TH2) المستجيب الخلايا التائية، مجموعات فرعية أخرى من الخلايا CD4 + T المساعدة (على سبيل المثال، اكتب 17 (Th17) ونوع 22 (خلايا Th22) T) وقد وصفت، وتحريض و وقد تم التحقيق في وظيفة تماما. وتشارك البلدان النامية علاوة على ذلك فيتوليد الخلايا التائية التنظيمية (Tregs) 13،14. هذه الخلايا هي المثبطة للمناعة، ويمكن أن تتوقف أو أسفل تنظم تحريض أو انتشار المستجيب خلايا تي وحاسمة لتطوير مناعة والتسامح وهكذا.

وتضم البلدان النامية التقليدية الإنسان (جان تنمية المجتمعات المحلية) عدة مجموعات فرعية من الخلايا مع الأصل النخاعي (أي خلايا لانغرهانس (خطابات الاعتماد) والجلد والبلدان النامية الخلالي) أو أصل اللمفاوية (أي البلدان النامية بلازماوية الشكل (PDCS)). لفي التجارب المختبرية أو استراتيجيات التطعيم العاصمة، وتستخدم البلدان النامية الوحيدات المستمدة بشكل روتيني نموذجا للبلدان النامية عن طريق الجلد. تظهر هذه الخلايا التشابه في علم وظائف الأعضاء، مورفولوجيا، وظيفة الخلايا الجذعية الدم النخاعي التقليدية. يتم إنشاؤها من قبل إضافة انترلوكين 4 (IL-4) ومحببة بلعم تحفيز مستعمرة عامل (GM-CSF) إلى حيدات معزولة من المتبرعين الأصحاء 12،15-18. ويمكن أيضا أن الخلايا الجذعية تكون معزولة مباشرة من الجلد أو الغشاء المخاطي الخزعات، أو يمكن حتى به وضعت من CD34 + الخلايا الاصلية المكونة للدم المعزولة من عينات دم الحبل السري التي تم الحصول عليها الرحم السابقين. هنا، علينا أن نظهر كيف يتم عزل حيدات وحفز من الدم البشري مكافحة متخثر بعد خلية وحيدة النواة في الدم المحيطي (PBMC) تخصيب بواسطة الطرد المركزي كثافة التدرج. بعد مرور فترة الحضانة لمدة 5 أيام، وحيدات الإنسان في ظل ظروف محددة هي متباينة في البلدان الجزرية النامية ونحن على استعداد لإجراءات تجريبية في وضع غير سريري.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع المتبرعين بالدم المشاركة من قبل المعهد المركزي لنقل الدم وزارة المناعية، إنسبروك، النمسا: الأخلاقيات بيان. وتمت الموافقة على استخدام عينات بقايا مجهولة الهوية لأغراض علمية من قبل لجنة الأخلاقيات من كلية الطب بجامعة انسبروك.

1. إثراء خلايا الدم المحيطي وحيدات النوى (PBMCs)

  1. تركيز PBMCs بواسطة الطرد المركزي.
    1. فتح حزمة الدم والانقسام في أنابيب معقمة 50 مل الطرد المركزي وفقا لكمية من الدم الواردة.
    2. إذا لزم الأمر، وضبط مستوى الصوت إلى 50 مل لكل أنبوب مع العقيمة Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (D-PBS).
    3. وضع أنابيب إلى جهاز للطرد المركزي وتدور لهم في 400 x ج لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) دون فرامل.
    4. رسم من الطبقة العليا التي تحتوي البلازما والصفائح الدموية باستخدام معقم ماصة 10 مل المصلية، وترك boundarذ طبقة دون عائق.
      ملاحظة: إذا تم استخدام البلازما الذاتي بدلا من FCS لاستكمال مستنبت، يجب جمع البلازما والمعطل للحرارة في هذه الخطوة.
    5. جمع الخلايا وحيدة النواة (طبقات الحدود) من اثنين من 50 مل أنابيب الطرد المركزي ونقلها إلى أنبوب مل العقيمة 50 واحد باستخدام العقيمة 10 مل ماصة المصلية.
    6. ضبط مستوى الصوت إلى 50 مل لكل أنبوب باستخدام معقم مد برنامج تلفزيوني.
    7. وضع أنابيب إلى جهاز للطرد المركزي وتدور لهم في 400 x ج لمدة 15 دقيقة في RT دون فرامل.
    8. رسم من الطبقة العليا التي تحتوي على البلازما والصفائح الدموية باستخدام معقم ماصة 10 مل المصلية، وترك الطبقة الحدودية دون عائق.
    9. جمع الخلايا وحيدة النواة (طبقات الحدود) من 50 مل أنابيب الطرد المركزي ونقلها إلى قسمين العقيمة 50 مل أنابيب جمع باستخدام العقيمة 10 مل ماصة المصلية.
    10. ضبط مستوى الصوت إلى 50 مل لكل أنبوب مع معقم مد برنامج تلفزيوني.
  2. الفصلمن PBMCs بواسطة الطرد المركزي التدرج الكثافة (الشكل 1).
    1. إعداد أربع 50 مل أنابيب وماصة 15 مل من التدرج الكثافة المتوسطة في كل أنبوب.
    2. خذ 25 مل من الخلايا المجمعة / الدم من أنبوب جمع (الخطوة 1.1.10) وتراكب بعناية متوسطة الكثافة التدرج.
    3. وضع أنابيب إلى جهاز للطرد المركزي وتدور لهم في 700 x ج لمدة 30 دقيقة في RT دون فرامل.
  3. جمع وتنقية PBMCs.
    1. رسم من الطبقة العليا التي تحتوي على البلازما والصفائح الدموية باستخدام معقم ماصة 10 مل المصلية، وترك طبقة PBMC دون عائق.
    2. جمع البيني PBMC من جميع الأنابيب وتجمع الخلايا في اثنين العقيمة 50 مل أنابيب باستخدام العقيمة 25 مل ماصة المصلية.
    3. ضبط مستوى الصوت إلى 50 مل لكل أنبوب مع معقم مد برنامج تلفزيوني. وضع أنابيب إلى جهاز للطرد المركزي وتدور لهم في 400 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الفرامل.
    4. نضح طاف واعادة تعليقالخلايا في العقيمة مد برنامج تلفزيوني. تجميع الخلايا من كلا الأنابيب وضبط مستوى الصوت إلى 50 مل مع معقم مد برنامج تلفزيوني.
    5. وضع أنابيب في أجهزة الطرد المركزي وتدور لهم في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الفرامل.
    6. نضح طاف واعادة تعليق الخلايا في العقيمة مد برنامج تلفزيوني. ضبط مستوى الصوت إلى 50 مل مع معقم مد برنامج تلفزيوني وماصة 50 ميكرولتر إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي على 450 ميكرولتر من مد برنامج تلفزيوني.
    7. دوامة أنبوب 1.5 مل بقوة وعد الخلايا في غرفة نويباور أو أي صك عد الخلايا الأخرى.
    8. وضع 50 مل أنابيب في أجهزة الطرد المركزي وتدور لهم في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الفرامل.

2. عزل الخلايا وحيدة النواة التي CD14 الجزيئات المغناطيسية المضادة الإنسان

  1. وسم PBMCs مع الجزيئات المغناطيسية.
    1. ضبط تركيز PBMC إلى 8 × 10 7 خلية / مل باستخدام عازلة العزلة.
    2. دوامة جسيمات CD14 مكافحة الإنسان المغناطيسية thoroughly و إضافة 50 ميكرولتر من الجسيمات لكل 1 × 10 7 PBMCs.
    3. مزيج تعليق خلية الجسيمات بدقة واحتضان ذلك في RT لمدة 30 دقيقة.
  2. فصل الكسور الإيجابية والسلبية.
    1. ضبط حجم ما يصل الى 12 مل باستخدام عازلة العزلة.
    2. إعداد ستة أنابيب جولة القاع معقمة وماصة 2 مل من تعليق خلية الجسيمات في كل أنبوب.
    3. المكان على الفور أنابيب على المغناطيس. احتضان لهم لمدة 10 دقيقة في RT.
    4. إبقاء الأنابيب على المغناطيس ورسم بعناية قبالة طاف. وطاف يحتوي على جزء سلبي.
    5. إزالة أنبوب من المغناطيس وإضافة 2 مل من العازلة العزلة.
    6. بلطف إعادة تعليق الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا.
    7. وضع أنابيب مرة أخرى على المغناطيس. احتضان لمدة 5 دقائق على RT.
    8. إبقاء الأنابيب على المغناطيس ورسم بعناية قبالة طاف. وطاف يحتوي على جزء سلبي.
    9. إزالة الأنابيب من المغناطيس وإضافة 2 مل من العازلة العزلة إلى كل أنبوب. بلطف إعادة تعليق الخلايا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا.
    10. نقل جزء إيجابي لأنبوب 50 مل العقيمة وضبط مستوى الصوت إلى 50 مل باستخدام معقم مد برنامج تلفزيوني.

3. تحفيز المعزولة وحيدات مع IL-4 و GM-CSF

  1. وضع الأنبوب في جهاز الطرد المركزي وأنها تدور في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الفرامل.
  2. نضح طاف وإعادة تعليق الخلايا في 50 مل من مد برنامج تلفزيوني.
  3. ماصة 50 ميكرولتر في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 450 ميكرولتر من مد برنامج تلفزيوني. دوامة أنبوب 1.5 مل بقوة وعد الخلايا في غرفة نويباور أو أداة العد خلية أخرى.
  4. وضع أنبوب 50 مل في أجهزة الطرد المركزي وأنها تدور في 400 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الفرامل.
    ملاحظة: إذا كان الكسر السلبي، تحتوي على الخلايا الليمفاوية في الدم الطرفية (PBLs)، ومطلوب أيضا، أداء الغسيل والفرز خطوات مماثلة لرخرطوم الكسر الإيجابي (الخطوات 3،1-3،5).
  5. ضبط تركيز الخلية إلى 1 × 10 6 / مل مستنبت قبل تحسنت (المتوسط 1640 RPMI تستكمل مع 10٪ FBS الحرارة المعطل و 1٪ حل الجلوتامين) وماصة 3 مل / بئر في 6 لوحات جيدة.
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم الحرارة المعطل البلازما ذاتي، استبدال FCS 10٪ مع 1-5٪ البلازما الذاتي، وفقا لانشاء التجريبية.
  6. تحفيز حيدات مع المؤتلف الإنسان IL-4 (250 U / مل)، والمؤتلف الإنسان GM-CSF (1000 U / مل) من قبل pipetting السيتوكينات مباشرة في مستنبت. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  7. إعادة تنشيط الخلايا مع IL-4 (250 U / مل)، وGM-CSF (1000 U / مل) بعد 48 ساعة من قبل pipetting السيتوكينات مباشرة في مستنبت.
    ملاحظة: إذا كان هناك أي علامات على تحمض أظهره مؤشر الرقم الهيدروجيني في المتوسط، استبدال نصف المتوسط ​​مع مستنبت قبل تحسنت.
  8. الحصاد غير ناضجة الخلايا الجذعية في يوم 5 لأسفل مجرى التجارب من قبل pipetting الخلايا المستنبتة من لوحة 6 جيدا وفي أنبوب 50 مل الطرد المركزي بعد pipetting لمستنبت صعودا وهبوطا عدة مرات.
  9. عد الخلايا وصمة عار على عينة من حيدات معزولة مع أضداد الإنسان ضد CD11b، CD11c وو DC-SIGN / CD209، جنبا إلى جنب مع صبغة بقاء الخلية. لتجنب غير محددة ملزمة من الأجسام المضادة خلال تلطيخ السطح، واستخدام التيسير مستقبلات منع الكواشف أو ألبومين المصل البقري مخازن (BSA) ينصح بشدة.
  10. تحليل العينة باستخدام الصبغة بقاء الخلية، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، عن طريق أداء التدفق الخلوي لتقييم نقاء وسلامة والبلدان الجزرية النامية ولدت.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

بعد الطرد المركزي من الدم المضادة للمتخثر باستخدام وسادة السكروز، وإثراء الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى (PBMCs) في الطور البيني على أعلى من متوسط كثافة التدرج (الشكل 1). بعد يتم رسمها PBMCs الخروج، يتم إجراء تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية ل?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يصف هذا البروتوكول توليد الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات (MDDCs) من خلال عزل حيدات الإنسان من الدم المضادة للمتخثر باستخدام الفحص القائمة على جسيمات متناهية الصغر المغناطيسي. في هذا البروتوكول، ويتم تنفيذ الخطوات الطرد المركزي المنبع الإجراء العزلة الخلية، مم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19BD Biosciences555415
APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15eBD Biosciences551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic ParticlesBD Biosciences557769
BD ImagnetBD Biosciences552311
BSA (Albumin Fraction V)Carl RothEG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well PlatesCostar3506
Density gradient media: Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare Bio-Sciences17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS)Sigma-AldrichD8537
Falcon 10 ml Serological PipetCorning357551
Falcon 25 ml Serological PipetCorning357525
Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge TubeCorning352070
Falcon Round-Bottom TubesCorning352054
FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3aBD Biosciences555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent)Tonbo biosciences13-0870
GM-CSFMACS Miltenyi Biotec130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America)Gibco10500-064
Hettich Rotanta 460RHettich---
IL-4 CCPromoKineC-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x)BD Biosciences552362
L-Glutamine solutionSigma-AldrichG7513
Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpinVWR211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2BD Biosciences555398
PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46BD Biosciences551265
RPMI-1640 mediumSigma-AldrichR0883
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0Invitrogen15575020

References

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  2. Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
  3. Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
  4. Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
  5. Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
  6. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
  7. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
  8. Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
  9. Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
  10. McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
  11. Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
  12. Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
  13. Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
  14. Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
  15. Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891(2010).
  16. Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).
  17. Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005(2015).
  18. Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
  19. Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

118

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved