دراسة الميتوكوندريا هيكل وظيفة في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; المبايض

Summary

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Abstract

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Introduction

ووصف الميتوكوندريا كلاسيكي باسم قوة الخلوية، لأنها هي المقاعد الرئيسية لإنتاج الطاقة في الخلايا المتمايزة. وعلاوة على ذلك، الميتوكوندريا تلعب دورا حاسما في عملية التمثيل الغذائي وتوليد الحرارة، وتعديل الدهون والكالسيوم والتوازن الأكسدة، وتزامن عمليات الخلية إشارات، الخ ^1. الميتوكوندريا أيضا أن تلعب دورا نشطا في تحريض الخلايا الموت ^2، وكذلك في خلية تنظيم دورة ^3. هذه وظائف متعددة تثير الأسئلة الأساسية التالية: أ) كيف الميتوكوندريا أداء كل هذه المهام في وقت واحد وب) وهناك حمامات الميتوكوندريا محددة أو subzones التي تخصصت لوظائف مختلفة؟ في هذا السياق، من المهم أن نلاحظ أن الميتوكوندريا متعددة الوظائف الحيوية في شكلها وحجمها، وهيكل داخل الخلايا الفردية، وأنه شكل حالة استقرار الميتوكوندريا يمكن أن تختلف بين أنواع الخلايا. عقود من البحث من مختلف مختبروتشير الخطابات أن تغيير شكل الميتوكوندريا وحجم وهيكل، التي تسمى مجتمعة ديناميات الميتوكوندريا، أمر بالغ الأهمية للحفاظ على وظائف مختلفة الميتوكوندريا _^4،5،6. هذه النتائج تثير إمكانية أن الميتوكوندريا قد يحقق لها وظائف متعددة بحكم ديناميكية الهيكلية.

جارية لفهم العلاقة بين الهيكل وظيفة الميتوكوندريا جهود واسعة النطاق. يتم الحفاظ على دينامية هيكل الميتوكوندريا في المقام الأول من خلال قدرتها على الخضوع الانشطار والانصهار الأحداث مع بعضها البعض. انشطار الميتوكوندريا كبيرة تحولها إلى عناصر الميتوكوندريا أصغر، في حين التحام بين مؤسستي الميتوكوندريا أصغر يدمج منهم إلى عنصر الميتوكوندريا أكبر ^7. وعلاوة على ذلك، قد يحدث الانصهار عابرة اثنين من الميتوكوندريا للسماح للخلط محتوياتها. تخضع الأحداث الانشطار والانصهار في الأغشية الميتوكوندريا الداخلية والخارجية بعناية من قبل المواصفاتيحدد IFIC من البروتينات. ويتكون الجهاز الانشطار الأساسية من البروتين ذات الصلة dynamin 1 (Drp1)، الذي يتم تجنيده من العصارة الخلوية إلى الميتوكوندريا التي كتبها تفاعلها مع بعض الحسنة بروتينات الميتوكوندريا الحسنة (على سبيل المثال، Fis1 أو Mff1)، في حين أن وظيفة Drp1 يمكن أيضا أن ينظم من قبل بروتينات أخرى على سطح الميتوكوندريا ^4. على الرغم من أن Drp1 تعمل على الغشاء الخارجي، والقدرات الانشطار لها تؤثر على الغشاء الداخلي كذلك. تزامن للانشطار أغشية الميتوكوندريا الخارجي والداخلي ليست مفهومة جيدا. من ناحية أخرى، يخضع انصهار الغشاء الداخلي في صلب الأنشطة التي يقوم بها Opa1، في حين يحكم mitofusins انصهار الخارجي غشاء ^5. التوازن في مواجهة الانشطار والانصهار أحداث الميتوكوندريا تملي شكل الميتوكوندريا حالة استقرار في خلية. على سبيل المثال، فإن القمع الانشطار الميتوكوندريا يؤدي إلى الانصهار الكامل وبدون معارضة، في حين أن الإفراط في النشاط الميتوكوندرياسيكون ل الانشطار يؤدي إلى تفتت الميتوكوندريا ^3.

دراسة العلاقة بين الهيكل وظيفة الميتوكوندريا ينطوي في المقام الأول نهجين مجانية: أ) تحليل الظواهر الخلوية والعضوي بعد التلاعب الجيني للبروتينات الانشطار / الانصهار الميتوكوندريا وب) التقييمات المباشرة للهيكل الميتوكوندريا وظيفة. ومن الجدير بالذكر أن التحاليل الجينية قد لا تكشف دائما وظيفة مباشرة للجزيء في متناول اليد (في هذه الحالة، الميتوكوندريا البروتينات الانشطار / الانصهار)، كما قد تنشأ الظواهر بسبب آثارها الجانبية. ولذلك، فإنه من الأهمية بمكان لتطوير واستخدام أدوات لدراسة بنية الميتوكوندريا وظيفة مباشرة. أي تقييم لهيكل الميتوكوندريا يتضمن أدوات الفحص المجهري مختلف. استخدام المجهر مضان من الخلايا الحية قد تقدم كثيرا من الدراسات ديناميات الميتوكوندريا، منذ ديناميكية الميتوكوندريا يمكن رصدها من حيث الكم وquantitatively باستخدام أدوات وتقنيات ⁸ مضان المجهر المناسبة. وقد تم تطوير الأدوات التي تعتمد على الفحص المجهري مضان لدراسة بنية الميتوكوندريا وظيفة في أنسجة البطن الحية والثابتة ذبابة الفاكهة، توضيح أهمية حيوية الميتوكوندريا في الجسم الحي ^9. يتم وصف هذه الأساليب وذات الصلة هنا، وذلك بهدف دراسة بنية الميتوكوندريا وظيفة في المبيض ذبابة الفاكهة.

يتكون المبيض ذبابة الفاكهة من سلالة الجرثومية والجسدية الأنساب، التي تنشأ من الخلايا الجذعية البالغة في كل منها الموجودة في germarium ^10،11. ستة عشر الخلايا الجرثومية المخلوي (GCS) الحصول على تغليف بواسطة خلايا بصيلات الجسدية (FCS) لتشكيل غرف البيض الفردية التي تنشأ من germarium (الشكل 1). واحدة من 16 GCS الحصول ملتزمة تصبح بويضة، و15 GCS المتبقية تتطور إلى خلايا الممرضة التي تدعم نمو غرفة بويضة، وتسهيل نضوج البويضة قبل وضعه. الغالبية العظمى من السفح الخضوع 9 جولات من الانقسامات الإنقسامية قبل خروجها من دورة الخلية الإنقسامية للتمييز عضال في طبقة الخلايا الظهارية نمط تتكون من خلايا الأمامي جريب (AFCs)، وخلايا الخلفي بصيلات بالفلور، وخلايا الجسم الرئيسية (MBCS) . يتم توصيل الدوائر البيض على التوالي من قبل خلايا ساق، والتي تتمايز الخلايا التي تستمد أيضا من السفح في وقت مبكر في عملية التنمية. شكل الميتوكوندريا التي تنظمها الميتوكوندريا Drp1 البروتين الانشطار وتشارك بنشاط في عملية التمايز خلال التطور الطبيعي للذبابة الفاكهة المبيض طبقة FC ^9،12. ووصف الأساليب المستخدمة في هذه الدراسات للتعرف على إشراك Drp1 في ذبابة الفاكهة تطوير طبقة الخلايا المسام هنا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد ذبابة الفاكهة (الأدوات المطلوبة وصفت في الشكل 2A)

1. للحصول على أي من التجارب وصفها، جمع ذبابة الفاكهة (الحفاظ على درجة حرارة الغرفة، أو 25 درجة مئوية) في غضون 5 أيام من eclosion ووضعها في قارورة مملوءة 5-7 مل من ذبابة الفاكهة الغذائية (انظر المواد الجدول)، مع عدم وجود أكثر من 25 الذباب في كل قارورة. الحفاظ على الإناث: نسبة الذكور من 2: 1.
2. رش كمية صغيرة من خميرة حبيبات لتحفيز إنتاج البيض ذبابة الفاكهة. أداء التلاعب التجريبية ضمن 2-4 أيام.

2. تشريح ذبابة الفاكهة المبايض (الأدوات المطلوبة وصفت في الشكل 2A)

1. دافئ حشرة تشريح المتوسطة (انظر المواد الجدول) إلى درجة حرارة الغرفة 25 درجة مئوية. ملء ثلاثة آبار ثمانية جيدا طبق زجاج تشريح، مع 200 ميكرولتر من المتوسط ​​في كل بئر.
2. تخدير ذبابة الفاكهة مع ثاني أكسيد الكربون 2 عن طريق وضع إبرة بندقية ضربة تحت المكونات قارورة. وضعها على لوحة الطيران. باستخدام مجهر تشريح، فرز 5 إناث ووضعها في أول بئر للطبق تشريح. التعامل مع واحد ذبابة الفاكهة في كل مرة عند إجراء الفحص المجهري المباشر.
3. في حين يبحث من خلال العدسة المجهر تشريح، قطع القفص الصدري من البطن باستخدام اثنين من أزواج من الملقط. باستخدام ملقط، ونقل بعناية البطن إلى البئر الثاني من الطبق.
4. استخدام زوج واحد من ملقط لعقد البطن في نهاية الخلفي، وببطء دفع المبايض من (جنبا إلى جنب مع محتويات البطن الأخرى) مع زوج آخر من ملقط. إذا فشلت هذه المحاولة، وإزالة بعناية الهيكل الخارجي البطن عن طريق إدراج ملقط في نهاية الأمامي للافراج عن المبايض.
5. باستخدام ملقط، عقد المبيض الفردية في نهاية الخلفي مبهمة (أي البيض مليئة صفار البيض، في وقت متأخر من المرحلة) ونقلها بعناية إلى البئر الثالث من الطبقلإغاظة لمعالجة ذلك للفحص المجهري المباشر (الخطوة 3) أو لتحديد لأداء المناعية (الخطوة 7).
6. بعناية ندف غلاف واق من حول المبايض التي تجتاح إبرة إغاظة طفيفة من الخلفية إلى الأمامية نهاية كل المبيض أثناء الضغط من قبل نهاية الخلفي مع زوج من الملقط.
   ملاحظة: لتقليل الضرر أثناء إغاظة، ينحني رأس الإبرة والتكبير على كل المبيض عن طريق زيادة التكبير من المجهر (الشكل 2A). وينبغي أن يكون إغاظة فعالة بما فيه الكفاية لكسر غمد، ولكن يجب أيضا أن يتم ذلك بعناية للحفاظ على سلامة ovarioles.

3. إعداد لالمجهري لايف الأنسجة

ملاحظة: الأدوات المطلوبة وصفت في الشكل 2A.

1. قبل ذبابة الفاكهة تشريح، وإعداد polyL يسين غرف المغلفة. تحقيقا لهذه الغاية، وضع قطرتين 20 ميكرولتر من polyL ليسين (0.1 ملغ / مل) على coverglالحمار (14 مم، رقم 0) طبق بتري القاع الزجاجي (35 ملم) على مسافة معقولة من بعضها البعض من أجل منع اندماج قطرات. الهواء الجاف لوحات لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، وعلامة على حواف بيضاء فيلم polyL يسين على الجانب السفلي من لوحة مع علامة قابل للمسح.
   ويمكن تخزين polyL يسين المغلفة غرف في 4 درجات مئوية لمدة أسبوع: ملاحظة. في حالة استخدام غرفة مطلية سابقا، وإحضاره إلى درجة حرارة الغرفة قبل البدء في تشريح ذبابة الفاكهة.
2. تعيين المعلمات المسح على المجهر متحد البؤر للتأكد من أن العينة يمكن تصوير مباشرة بعد الانتهاء من تشريح والتركيب، على النحو التالي.
3. مكان واحد تشريح ومازحت المبيض (بعد الخطوة 2 والملون، وإذا لزم الأمر، وبعد الخطوة 5) في منطقة المغلفة polyL يسين بعلامات ونشر المبيض مع الإبرة إغاظة لفصل ovarioles. وضع قطرة 10 ميكرولتر من المتوسطة تشريح الحشرات فوق المبيض، مع التأكد من تغطية رانه كامل منطقة polyL يسين المغلفة. تغطية طبق بتري.
4. أداء فورا المجهري متحد البؤر من العينة التي شنت في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يجب تشريح واحد فقط ذبابة الفاكهة، وتجهيزها، وتصويرها في وقت واحد. أيضا، لا ينبغي أن يقوم المجهري عند 37 درجة مئوية، والتي سوف تحاكي بيئة الصدمة الحرارية للأنسجة ذبابة الفاكهة.

4. الإسفار الخسارة في photobleaching من (FLIP) الفحص لتقييم الميتوكوندريا مصفوفة الاستمرارية

تم تأسيس استمرارية مصفوفة الميتوكوندريا في بنية الميتوكوندريا تنصهر بعد الانصهار الكامل في الأغشية الداخلية والخارجية الميتوكوندريا بعد التقدم من خلال خطوات وسيطة: ملاحظة. انشطار الميتوكوندريا قد اتبع نفس الخطوات ولكن في الاتجاه المعاكس (الشكل 3A). نقف هو الوقت الفاصل بين طريقة القائم على الفحص المجهري نصف الكمية التي يمكن استخدامها لتقييم استمرارية مصفوفة الميتوكوندريا فيالدولة تنصهر النهائية من خارج الحي الميتوكوندريا (الخطوات 3 و 4 في الشكل 3A) في المبايض ذبابة الفاكهة الحية ^9. يتم تنفيذ فحص الوجه كمنطقة صغيرة من الفائدة (ROI) من الميتوكوندريا معربا عن جزيء فلوري في المصفوفة الميتوكوندريا التي photobleached على فترات منتظمة (FLIP العائد على الاستثمار في الشكل 3A). ونتيجة لذلك، فإن أي منطقة الميتوكوندريا المحيطة التي هي مستمرة مع العائد على الاستثمار FLIP (ROI التجريبي في الشكل 3A) تفقد إشارة بسبب تبادل الجزيئات في المصفوفة الميتوكوندريا مستمرة. وأجريت التجارب نقف تظاهر هنا على المعدلة وراثيا ذبابة الفاكهة معربا عن mitoYFP، الذي يحتوي على تسلسل استهداف الميتوكوندريا من السيتوكروم أوكسيديز الثامن فرعية الإنسان ذات الكلمات الدلالية مع YFP لاستهدافه إلى مصفوفة الميتوكوندريا في شكل إنتشاري بحرية. ويمكن أيضا تجربة مماثلة أن يؤديها مع التحوير ميتو pUASP-ميتو-GFP، كما ذكرت سابقا <سوب> 9. ويمكن استخدام بروتوكول نقف مماثل مع لجنة التحقيق التي تستهدف الفضاء بين غشاء الميتوكوندريا لتكون قادرة على الكشف عن الاستمرارية الناتجة من اندماج الخارجي ولكن ليس أغشية الميتوكوندريا الداخلية (الخطوة 2 في الشكل 3A).

1. فتح البرنامج الحصول على الصور على المجهر متحد البؤر وتعيين المعلمات المسح المناسبة في "اكتساب" علامة التبويب (الجدول 1). التحقق من "السلاسل الزمنية"، "تبيض"، و "صندوق المناطق" لفتح علامات الفردية. وضع قيم المعلمات الاستحواذ المناسبة في كل علامة تبويب (الجدول 1).
   ملاحظة: يجب أن تترك الثقب مفتوحة، كما تم تصميم هذه التجربة لمراقبة إشارة عموما من السكان الميتوكوندريا كله في الخلايا الفردية.
2. استخدام العدسة لتحديد مكان بسرعة في مجال الاهتمام في الأنسجة الحية التي شنت.
   ملاحظة: حدد ovarioles التي تنتشر بشكل جيد على الزجاج bottomeد طبق، منذ المجهري متحد البؤر لا يمكن أن يؤديها على ovarioles العائمة.
3. انقر فوق "العيش" للحصول على صورة حية من الحقل المحدد من الفائدة. انقر على "وقف" لوقف المسح الحية.
4. إذا لزم الأمر، وضبط المعلمات اقتناء مثل هذا إشارة الفلورسنت الكشف عن أقل من مستويات التشبع (المشار إليها لعدم وجود بكسل الحمراء عند تحديد الخيار "مؤشر مجموعة")، مع خلفية محددة كما هو مبين من خلال تعديل قيم الإزاحة.
5. رسم العائد على الاستثمار صغير باستخدام أداة رسم بيزيه من علامة التبويب "المناطق" لترسيم منطقة photobleaching من على الصورة المكتسبة عن طريق المسح الضوئي الحية.
   ملاحظة: يجب أن يكون حجم العائد على الاستثمار حول 20-50٪ من إجمالي إشارة الميتوكوندريا الفلورسنت داخل الخلية.
6. أداء الحصول على الصور من خلال النقر على "بدء التجربة."
7. قياس كثافة مضان باستخدام الملكية أو برمجيات المصدر المفتوح (انظر الموادالجدول). تسجيل يعني إشارة من العائد على الاستثمار حيث استهدف تبيض المتكررة (FLIP). رويس حيث لم يتم تنفيذ تبيض في نفس الخلية (التجريبية)؛ العائد على الاستثمار من الخلايا غير مقصور آخر في نفس مجال الرؤية، لتقييم تبيض الإجمالي خلال الفترة التجريبية (تبييض)؛ والعائد على الاستثمار في المنطقة الخلفية (خلفية). طرح إشارة الخلفية يعني الحصول عليها من المتوسط ​​في إشارة رويس الآخرين. تطبيع إشارة الفلورسنت مع الإشارة قبل التبييض الأولي للخلية منها.
8. مؤامرة تطبيع البيانات باستخدام أي برنامج التآمر القياسية.

5. تلطيخ العيش مع نيون الميتوكوندريا الأصباغ

ويمكن تقييم هيكل الميتوكوندريا ثابت للدولة وإمكانية استخدام الأصباغ التي تتضمن على وجه التحديد في الميتوكوندريا في الخلايا والأنسجة الحية: ملاحظة. المبايض ذبابة الفاكهة الحية يمكن أن تكون ملطخة خارج الحي مع الميتوكوندريا الفلورسنتالبقع لتصور الميتوكوندريا، لتقييم أنواع الاكسجين التفاعلية الميتوكوندريا (ميتو-ROS) الإنتاج، وتقييم إمكانات الميتوكوندريا في وحدة الكتلة. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق المشاركة في تلطيخ مع الميتوكوندريا الجهدية استر صبغ tetramethylrhodamine الإيثيلي (TMRE) وصمة عار الميتوكوندريا الحية متوافقة يمثلون كتلة الميتوكوندريا (انظر المواد الجدول لالأصباغ محددة).

1. تمييع الأسهم من البقع في الحشرات الدافئة تشريح المتوسطة إلى تركيز العمل النهائية: وصمة عار الميتوكوندريا، 250 نانومتر. TMRE، 50 نانومتر. وميتو-ROS وصمة عار، 5 ميكرومتر.
2. بعد تشريح وإغاظة المبايض التالية الخطوة 2، وضع المبيضين إلى 200 ميكرولتر من أي حل تلطيخ معين في بئر طبق تشريح. احتضان لهم لمدة 10 دقيقة مع الطبق مربع مناسبة ملفوفة بورق الألومنيوم لحمايتها من ضوء تغطيتها. غسل المبايض الملون عن طريق نقلها بعناية مع ملقط إلى 3 آبار متتالية containinز وسيط وبدون وصمة عار.
3. للمشاركة في تلطيخ مع TMRE والمتوافقة مع وصمة عار الميتوكوندريا الشاملة، اتبع البروتوكول أعلاه وصمة عار لأول مرة مع TMRE وبعد ذلك على الفور مع وصمة عار الميتوكوندريا الإجمالية (من دون أي خطوات غسل بين).
4. جبل المبايض على طبق القاع الزجاجي polyL يسين المغلفة التالية الخطوة 3 والاستعداد للفحص المجهري متحد البؤر مع المعلمات المسح المناسبة (الجدول 1)، بعد الخطوات 4،2-4،4.
   ملاحظة: إن إشارة من الأصباغ أدرجت لم يدم عند محاولة تركيب عينات الملون في تصاعد المتوسطة.
5. ضع علامة في المربع-باجتزاء Z لفتح علامة التبويب. أدر عجلة التركيز نحو الجزء السفلي من العينة بينما يتم فحص الحية وانقر على "المجموعة الأولى" لتحديد bottommost القسم Z. تفعل الشيء نفسه أثناء تحريك عجلة التركيز نحو الاتجاه الآخر لتحديد العلوي القسم.
6. أداء الحصول على الصور من خلال النقر على "بدء التجربة."
7. قياس كثافة الفلورسنت لتصحيح الخلفية من رويس للإشارة الخلفية والخلايا الفردية (كما في الخطوة 4.7) ورسم البيانات باستخدام أي برنامج التآمر.

6. توليد Drp1 خالية الفسيفساء

ملاحظة: استراتيجية نسيلي المستخدمة هنا يدخل الخضراء بروتين فلوري (GFP)-سلبية Drp1 استنساخ فارغة في خلفية لذلك، ظاهريا الخلفية من النوع البري GFP إيجابية وهذا هو متخالف genotypically للطفرة فارغة Drp1 ^9. حرارة الصدمة التي يسببها flippase flippase الاعتراف الهدف (FLP-FRT) بوساطة مواقع محددة الإنقسامية إعادة التركيب يخلق استنساخ متماثل من الأليل drpKG03815 لاغيا وظيفيا. وراثى من ذبابة الفاكهة تحمل متحولة Drp1 هو drpKG03815 FRT40A / CYO، في حين أن النمط الجيني تحمل FLP الناجم عن صدمة للحرارة (hsFLP) وUbiGFP علامة نسيلي هو hsflp. NLS-GFP اليوبيكويتين (UbiGFP) FRT 40A / CYO. وراثى للحد ذاتهاذرية lected الصليب بين المورثات أعلاه هو hsFLP / +. drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

1. مزامنة ذبابة الفاكهة لجمع البكر عن طريق نقلها إلى قارورة جديدة من المواد الغذائية الطازجة كل 2 إلى 3 أيام. مراقبة قارورة pupariating يوميا من أجل جمع الإناث عذراء الناشئة.
2. جمع ومجعد الجناح الإناث البكر حمراء العينين من النمط الجيني متحولة Drp1 كل يوم، مرة في الصباح ومرة ​​في المساء، ووضعها في قارورة منفصلة. في موازاة ذلك، جمع الذكور ذبابة الفاكهة مع عيون حمراء داكنة والأجنحة المستقيمة تحمل hsflp وUbiGFP خلال 5 أيام من eclosion.
3. إنشاء تقاطع طريق إضافة الذكور إلى الإناث البكر مع الإناث: نسبة الذكور من 2: 1.
4. رش كمية صغيرة من خميرة حبيبات لتحفيز إنتاج البيض.
   ملاحظة: بعناية تحريك ذبابة الفاكهة إلى قارورة جديدة من وسائل الاعلام كل 2-3 أيام إلى زيادة كمية ذرية وللحد من الازدحام قارورة.
5. لesthetize وفرزها، وجمع مباشرة الجناحين، أحمر العينين ذرية الإناث خلال 5 أيام من eclosion.
6. لالصدمة الحرارية، وضع ذبابة الفاكهة التي تم جمعها في قارورة فارغة مع كمية صغيرة من خميرة حبيبات وصغيرة، لينة مسح (لامتصاص الرطوبة خلال الصدمة الحرارية). ضع قارورة مع ذبابة الفاكهة في حمام مائي عند 38 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، لتوليد الحيوانات المستنسخة خلية المسام في المقام الأول، وعلى 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مرتين في اليوم (السماح على الأقل 5 ساعات بين الصدمات 2 الحرارة) لمدة 2 أيام متتالية ، لتوليد كل من سلالة الجرثومية واستنساخ الخلايا المسام.
   ملاحظة: تأكد من أن القارورة مغمورة تماما في المياه يصل إلى مستوى المكونات.
7. صدمة الحرارة قد تجعل متحرك ذبابة الفاكهة. السماح للذبابة الفاكهة للحرارة صدمت لاسترداد لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة عندما تصبح المحمول مرة أخرى.
8. إضافة الذكور إلى الإناث بنفس النسبة كما في الصليب، ونقلها إلى قارورة جديدة مع جامعة المدينة العالميةرش م مع كمية صغيرة من خميرة حبيبات. الحفاظ على ذبابة الفاكهة لمدة 5 أيام على الأقل.
9. تشريح المبيض عند الضرورة لإجراء تجربة حية أو الثابتة.
   ملاحظة: المبايض معزولة عن الوالدين ذبابة الفاكهة معربا عن UbiGFP يجب أن تستخدم ضوابط السلبية لتأكيد تحريض كفاءة من الحيوانات المستنسخة GFP سلبية من قبل الصدمة الحرارية.

7. المشارك المناعية للالسيكلين E والميتوكوندريا

ملاحظة: للكشف عن ذبابة الفاكهة السيكلين E (dCyclinE)، وقد استخدمنا الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها تجاريا أثيرت على وجه التحديد ضد dCyclinE ⁹ (انظر المواد الجدول). كعلامة الميتوكوندريا، كنا الأجسام المضادة ضد ATP-B (وحدة فرعية من مجمع سينسيز ATP الميتوكوندريا) ^9.

1. دافئ 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) إلى درجة حرارة الغرفة 25 درجة مئوية. الحذر! امتصاص العرق هي سامة.
   ملاحظة: بعد افتتاحوأمبولة، يجب أن يتم تخزين PFA في 4 درجات مئوية، وتستخدم خلال 7 أيام. وذلك لأن تخزين PFA قد تسمح أكسدة الميثانول، والتي من شأنها أن تغير بشكل كبير أغشية الميتوكوندريا أثناء التثبيت، حتى لو كان حاضرا في كميات ضئيلة.
2. مباشرة بعد تشريح، وتحديد المبيضين تشريح عن طريق وضعها في 200 ميكرولتر من PFA جديدة في بئر من صحن الزجاج تشريح (بدون إغاظة). الحفاظ على طبق في غطاء الدخان لمدة 15 دقيقة. غسل المبايض الثابتة عن طريق نقلها بعناية مع ملقط إلى 3 آبار متتالية، كل منها يحتوي على 200 ميكرولتر من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
   ملاحظة: هذه التجربة يمكن أن تتوقف هنا والعينات يمكن أن تترك في 4 درجة مئوية لمدة 1 يوم.
3. ندف المبيضين أكثر شمولا في برنامج تلفزيوني (على غرار الخطوة 2.6) لإزالة بعناية الغمد الليفي الحماية التي قد تعيق وصول المستضد بواسطة الأجسام المضادة.
4. Permeabilize المبايض مثار عن طريق وضعها في أنبوب microfuge مع 500 ميكرولتر من الطازجة المصنوعة 0.5٪ PBS-تريتون-X100 (PBS-TX)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في حين تعصف في 25 دورة في الدقيقة.
   ملاحظة: خلال هزاز، وضع أنابيب موازية لحركة هزاز. وضعها بشكل عمودي قد تسمح الأنسجة التمسك الغطاء من الأنابيب، مما أدى إلى فقدان الأنسجة.
5. لإزالة برنامج تلفزيوني-TX، ووضع أنابيب microfuge في رفوف للسماح للأنسجة لتستقر في الجزء السفلي من الأنابيب. تفتيشها بصريا والاستفادة من الأنابيب، إذا لزم الأمر، لتحقيق أي أنسجة العائمة إلى أسفل. نضح الحل بعناية من أعلى، والتأكد من أن الأنسجة في الجزء السفلي من الأنابيب لا تزال دون عائق.
6. منع المبيضين وذلك بإضافة 200 ميكرولتر من 2٪ زلال المصل البقري (BSA) الذائب في 0.5٪ في برنامج تلفزيوني-TX، واحتضان على الروك في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. إزالة عامل عرقلة باتباع الخطوة 7.5.
7. إضافة الأجسام المضادة الأولية في 200 ميليلتر من وكيل حجب العذبة: المضادة للأرنب dCyclinE الأجسام المضادة (1: 100)، ومكافحة فأر ATP-B الأجسام المضادة(1: 100). احتضان الأنسجة على الروك لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
8. غسل البويضات مع برنامج تلفزيوني-TX 3 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما، بعد خطوة 7.5.
9. إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في برنامج تلفزيوني جديد-TX: مكافحة فأر-CY3 (1: 1000) والمضادة للأرنب-CY5 (1: 500). احتضان على الروك لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
10. غسل البويضات مع برنامج تلفزيوني-TX 3 مرات لمدة 15 دقيقة لكل منهما، بعد خطوة 7.5.
11. وصمة عار على الحمض النووي، إضافة هويشت (1: 1000 تمييع) لغسل برنامج تلفزيوني-TX النهائي.
12. وأخيرا، يترك الأنسجة في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1X.
13. باستخدام micropipette 1 مل، وإزالة المبايض immunostained من microfuge أنبوب في بئر جديدة من وعاء زجاجي تشريح تحتوي على 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني.
14. إضافة قطرة واحدة من المتوسطة المتزايدة على أساس الجلسرين لشريحة زجاجية وإضافة المبايض immunostained واحدا تلو الآخر إلى تصاعد المتوسط.
    ملاحظة: تأكد من أن المبايض يتم نقل الواقع إلى تصاعد المتوسط. الفشل في القيام الصورةس سيؤدي إلى فقدان الأنسجة.
15. في حين يبحث من خلال مجهر التشريح، ونتف بلطف ovarioles شفافة (مراحل الأصغر سنا) من غرف بيضة ناضجة مبهمة باستخدام إبرة إغاظة حين الضغط على جزء معتم من المبيض مع ملقط. إزالة غرف بيضة ناضجة من تصاعد المتوسط.
16. وضع ساترة (22 مم، رقم 1) على الشريحة واضغط برفق للتأكد من أن تصاعد المتوسط ​​وتنتشر بشكل موحد تحت.
    ملاحظة: الضغط على ساترة كما يضمن التوافق السليم للأنسجة على طول ساترة. الفشل في القيام بذلك على النحو الأمثل قد تسمح للمراحل أصغر لتطفو في المتوسطة المتزايدة، ومنع المجهر الأمثل لتلك الأنسجة.
17. الهواء تجفيف العينات لمدة 15 دقيقة وختم حواف ساترة بعناية مع طلاء الأظافر.
18. أداء متحد البؤر المجهري وفقا للحاجة التجريبية (الجدول 1).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

ويمكن استخدام الأساليب المذكورة لدراسة بنية الميتوكوندريا وظيفة في المبايض ذبابة الفاكهة الحية والثابتة (الشكل 2B). تقدم بعض الأمثلة على النتائج المتوقعة التي تم الحصول عليها مع الأساليب المذكورة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

photobleaching من: منع photobleaching من لا مبرر له من عينات الفلورسنت ضروري جدا لأداء كفاءة المجهر متحد البؤر. ولذلك، فإن الوقت المستخدم لتحديد العينات من خلال العدسة أو لتعيين المعلمات الحصول على الصور ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain)	Life Technologies	m7514	Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate	Sigma Aldrich	87917-25MG	Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain)	Life Technologies	m36008	Reconstitute and Aliquot
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Conicals	Fisher Scientific	AS-355
Fly Vial Flugs	Fisher Scientific	AS273
Fly Conical Flugs	Fisher Scientific	AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300)	Santa Cruz	sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker	AbCam	ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-175-144
Hoechst	Fisher Scientific	H3570
VectaShield	Fisher Scientific	H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Confocal Microscope	Carl Zeiss	LSM 700
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000
Analyses software	Carl Zeiss	Zen
Analyses software	Open source	Image J
Research Macro Zoom Microscope	Olympus	MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono	QImaging	QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1	QImaging