بروتوكول تجريبي للكشف<em&gt; البكتيريا الزرقاء</em&gt; في العينات السائلة والصلبة مع الأجسام المضادة ميكروأري رقاقة

Summary

The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.

Abstract

ظاهرة الاحتباس الحراري وزيادة المغذيات جعل بعض النظم الإيكولوجية المائية تتصرف المفاعلات الحيوية الحقيقية كما أن يؤدي النمو السيانوبكتيريا السريع والهائل. هذا له الصحية ذات الصلة والعواقب الاقتصادية. العديد من السلالات السيانوبكتيريا والمنتجين السم، وفقط عدد قليل من الخلايا اللازمة للحث على ضرر لا يمكن إصلاحه للبيئة. لذلك، السلطات مائي والإدارات تتطلب نظم الإنذار المبكر السريعة والفعالة وتوفير بيانات موثوقة لدعم القرارات الوقائية أو العلاجية الخاصة بهم. تقارير هذه المخطوطة بروتوكول تجريبي للكشف في مجال سلالات السيانوبكتيريا المنتجة للسموم باستخدام ميكروأري رقاقة الأجسام المضادة مع الأجسام المضادة 17 (عبس) لقرار التصنيفية (CYANOCHIP). هنا، وتعدد الإرسال الفلورسنت المناعية شطيرة ميكروأري (FSMI) لرصد وقت واحد من 17 سلالات السيانوبكتيريا في كثير من الأحيان وجدت تزهر في النظم الإيكولوجية للمياه العذبة، وبعضهم من المنتجين السم، وصفت. وميكروأري مع متعددةسبيل مكررات متطابقة (تصل إلى 24) من CYANOCHIP طبعت على شريحة المجهر واحدة لاختبار في وقت واحد عددا مماثلا من العينات. العينات السائلة يمكن اختبارها إما عن طريق حضانة مباشرة مع الأجسام المضادة (عبس) أو بعد تركيز خلية عن طريق الترشيح من خلال مرشح 1- إلى 3 ميكرون. العينات الصلبة، مثل الرواسب والصخور الأرض، ويتجانس الخليط الأول وفرقت من قبل ultrasonicator باليد في وجود مخزن مؤقت الحضانة. ثم يتم تصفيتها (5-20 ميكرون) لإزالة المواد الخشنة، وحضنت الترشيح مع القيمة المطلقة. وكشف Immunoreactions من قبل حضانة النهائية مع خليط من القيمة المطلقة مضان المسمى 17 ويتم قراءتها بواسطة جهاز الكشف عن مضان المحمولة. العملية كلها تستغرق حوالي 3 ساعات، أكثر من ذلك المقابلة لفترتين 1-ساعة من الحضانة. الإخراج هو صورة، حيث تتوافق النقاط المضيئة لكشف إيجابي من علامات السيانوبكتيريا.

Introduction

كشف ورصد الكائنات الحية الدقيقة في المجتمعات الميكروبية الطبيعية المعقدة حاسمة في العديد من المجالات، بما في ذلك الطب الحيوي والبيئة البيئية، والبيولوجيا الفلكية. البكتيريا الزرقاء هي الكائنات الحية الدقيقة بدائية النواة المعروفة لقدرتها على تشكيل تزهر (الانتشار المفرط) من الخلايا في المياه العذبة. انهم في كل مكان، والعديد من الأنواع قادرة على إنتاج السموم، مما يؤدي ليس فقط إلى خطر محتمل على صحة الإنسان، ولكن أيضا إلى التأثير البيئي. وفي هذا الصدد، لا بد من تطوير أساليب سريعة وحساسة للكشف المبكر من البكتيريا الزرقاء و / أو سمومها في التربة والمياه. لهذا الغرض، تم تطوير تعدد الإرسال الفلورسنت المناعية شطيرة ميكروأري (FSMI) كأداة لإدارة المياه لمساعدتهم في اتخاذ القرارات، وبالتالي، في تنفيذ البرامج المناسبة لإدارة المياه.

وقد تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق لاكتشاف وتحديد السماويخلايا obacterial وcyanotoxins في التربة والمياه، بما في ذلك المجهر الضوئي، والبيولوجيا الجزيئية، والتقنيات المناعية. هذه الأساليب يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا في المعلومات التي يقدمونها. وتعتمد التقنيات المجهرية على شكل الخلية وكشف في الجسم الحي مضان من الأصباغ السيانوبكتيريا، مثل فيكوسيانين أو الكلوروفيل ^{(أ) 1.} على الرغم من أنها طرق سريعة ورخيصة في الوقت الحقيقي والرصد المتكرر لإعلام حول نوع وعدد من البكتيريا الزرقاء الموجودة في عينة، فإنها لا تعطي معلومات حول السمية المحتملة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها تتطلب مستوى معين من الخبرة، معتبرا أنه غالبا ما يكون من الصعب جدا التمييز بين الأنواع ذات صلة وثيقة ^2. للتغلب على هذه القيود، يجب أن يصاحب ضوء المجهر من قبل كل من فحوصات الكشف البيولوجية والكيميائية الحيوية والطرق الفيزيائية لتحديد وتقدير من cyanotoxins.

انزيم مرتبط المقايسات المناعي (ELISA)، المقايسات البروتين الفوسفات تثبيط (PPIA)، والاختبارات الكيميائية العصبية في الفئران هي أمثلة على المقايسات فحص البيوكيميائية للكشف عن cyanotoxins. في حين أن الأولين هي المنهجيات السريعة والحساسة، وقد وصفت ايجابيات كاذبة عندما يتم تقييد استخدام ELISA وPPIA الاختبارات لثلاثة أنواع من السموم. الأحيائي الماوس تقنية نوعية مع انخفاض الحساسية والدقة، وترخيص خاص والتدريب هو مطلوب. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه لا يعطي معلومات حول نوع من السموم الموجودة في العينة. ويمكن تحديد Cyanotoxins وكميا بواسطة طرق أخرى تحليلية، مثل ارتفاع الأداء اللوني السائل (HPLC)، السائل الطيف اللوني الشامل (LC-MS)، اللوني للغاز (GC)، الغاز اللوني الكتلة الطيفي (GC-MS)، أو مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز الوقت / تأين الطيران (MALDI-TOF). ومع ذلك، وهذا ممكن فقط إذا المعايير المرجعية، والتي تحتاجإد لتحديد تركيز السم الفردية في عينات معقدة، وتتوفر ^{3 و 4.} وعلاوة على ذلك، وهذه الأساليب هي مضيعة للوقت. تتطلب معدات مكلفة، واللوازم، وإعداد العينات. ويجب أن يقوم بها الموظفين ذوي الخبرة والاختصاص.

طبقت على أساس أساليب الجزيئية لعقود من الزمن لكشف وتحديد، وتحديد البكتيريا الزرقاء وcyanotoxins المقابلة شكرهم للمعلومات تسلسل نشرت في قواعد بيانات الجينوم (على سبيل المثال، المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية، NCBI). ومن بين هذه الطرق هي تلك التي تستند إلى تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، الأمر الذي يتطلب تصميم مجموعات من الاشعال لتضخيم الحمض النووي وتعتمد على معرفة سابقة من تسلسل الحمض النووي من الأنواع السيانوبكتيريا مختلفة. في حين كشف الجينات مثل الاوبرون فيكوسيانين، يؤدي إلى تحديد دقيق على مستوى جنس، فإن بعض الأنواع أو السلالات هي التي لم يتم كشفها معهذه الطريقة. ومع ذلك، جينات ترميز السم، مثل أولئك الذين ينتمون إلى الاوبرون microcystin، تسهيل التعرف على السموم في العينات حيث المنتجين شحيحة ^5. ومع ذلك، والكشف عن علامات السمية عن طريق PCR لا يعني بالضرورة سمية في البيئة. وعلاوة على ذلك، فإن مجموعة من الاشعال المتقدمة لتحليل مجموعة كاملة من الأنواع من البكتيريا الزرقاء والسمية المنتجين الحالي في عينة لا يزال غير مكتمل، ويجب أن يتم إجراء المزيد من الدراسات لتحديد أنواع غير معروفة. وغير PCR القائم على التقنيات الجزيئية الأخرى، مثل مضان في الموقع التهجين (FISH) وميكروأرس الحمض النووي.

في العقدين الأخيرين، وقد اكتسبت أهمية تكنولوجيا متطورة في العديد من مجالات التطبيق، لا سيما في مجال الرصد البيئي. ميكروأرس الحمض النووي تسمح للتمييز بين الأنواع والتحاليل ^{4، 6، 7} سوب>، ^{8، 9، 10،} لكنها نظرت الى شاقة للغاية والمهام التي تنطوي على خطوات متعددة (على سبيل المثال، أداء ميكروأري، واستخراج الحمض النووي، PCR التضخيم، والتهجين) تستغرق وقتا طويلا. لهذا السبب، وأقل فحوصات تستغرق وقتا طويلا بناء على الأجسام المضادة، مثل شطيرة وميكروأرس المناعية تنافسية، وأصبحت وسيلة عالية الإنتاجية أساسي وموثوق بها للكشف عن التحاليل البيئية متعددة ^{11 و 12 و 13.} قدرة الأجسام المضادة لتسلم على وجه المركبات المستهدفة وللكشف عن كميات صغيرة من التحاليل والبروتينات، جنبا إلى جنب مع إمكانية إنتاج الأجسام المضادة ضد مادة تقريبا أي، وجعل المجهرية الضد تقنية قوية للأغراض البيئية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القدرة على تحقيق متعددة تحلل في مثلإنجل الفحص، مع حدود الكشف بدءا من جزء في البليون إلى PPM، هو واحد من أهم مزايا هذه الطريقة ^14.

وقد أثبتت أجهزة الاستشعار القائمة على أجسام مضادة لتكون أدوات حساسة وسريعة للكشف عن مجموعة واسعة من مسببات الأمراض والسموم في الرصد البيئي ^{15، 16، 17، 18، 19، 20، 21.} بينما الأساليب الحمض النووي تنطوي على عدة خطوات، وميكروأرس القائم على الأجسام المضادة لا تتطلب سوى تحضير عينة صغيرة التي تقوم أساسا على خطوة تحلل قصيرة في وجود مخزن مؤقت الحل المناسب. ذكرت Delehanty وLigler ¹⁵ كشف في وقت واحد من البروتينات والتحاليل البكتيرية في مخاليط معقدة على أساس المناعي الأجسام المضادة شطيرة قادرة على الكشف عن تركيز البروتين من 4 جزء في البليوند 10 ⁴ كفو / مل من الخلايا. SZKOLA وآخرون. وقد وضعت ²¹ ميكروأري متعدد رخيصة ويمكن الاعتماد عليه للكشف في وقت واحد proteotoxins والسموم صغيرة، ومركبات التي يمكن استخدامها في الحرب البيولوجية. أنها اكتشفت تركيزات من مادة الريسين السامة، مع الحد من الكشف عن 3 أجزاء من البليون، في أقل من 20 دقيقة. في الآونة الأخيرة، فقد وصفت CYANOCHIP، وهو جهاز الاستشعار البيولوجي استنادا ميكروأري الأجسام المضادة للفي الموقع كشف عن البكتيريا الزرقاء السامة وغير سام، ^22. هذا ميكروأري يسمح لتحديد تزهر السيانوبكتيريا المحتملة، ومعظمها في البيئات المائية، التي يصعب تحديد مجهريا. الحد من الكشف عن ميكروأري هو ¹⁰ فبراير - 10 مارس خلايا لمعظم الأنواع، وتحول هذا جهاز الاستشعار البيولوجي إلى أداة فعالة من حيث التكلفة للكشف عن تعدد الإرسال وتحديد البكتيريا الزرقاء، حتى على مستوى الأنواع. كل هذه المواصفات تجعل من antiboتقنية ميكروأري دى، وخاصة الطريقة المعروضة في هذا العمل، وهي طريقة أسرع وأبسط مقارنة مع التقنيات المذكورة أعلاه.

يعرض هذا العمل مثالين من التجارب التي تستخدم الأجسام المضادة جهاز الاستشعار البيولوجي القائم على ميكروأري للكشف عن وجود البكتيريا الزرقاء في عينات من التربة والمياه. وهي طريقة بسيطة وموثوق بها على أساس شكل المناعية شطيرة التي تتطلب كميات عينة صغيرة جدا وإعداد نموذج بسيط للغاية. وتتطلب هذه الطريقة وقت قصير ويمكن أن يؤديها بسهولة في هذا المجال.

Protocol

1. إعداد Immunogens

1. تنمو كل سلالة السيانوبكتيريا في مستنبت مماثل تحت الشروط الموضحة في الجدول 1.
   وترد متوسطة النمو والثقافة الشروط لكل سلالة البكتيريا الزرقاء في الجدول رقم 1: ملاحظة. كل السلالات السيانوبكتيريا، باستثناء K17، تنتمي إلى مجموعة أنطونيو كيسادا من جامعة المستقلة (مدريد، اسبانيا). تم إنشاء الأجسام المضادة ضد rubescens Planktothrix من عينة الطبيعية للازهر أحادي النوعية من هذا cyanobacterium من Vilasouto خزان (شمال اسبانيا).
2. تحديد عدد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا بواسطة المجهر الضوئي للحصول على ما يقرب من 10 ⁸ خلايا / مل من ثقافة مرحلة النمو الأسي أو ثابتة في وقت متأخر.
3. حصاد الخلايا من 5 مل من الثقافة بواسطة الطرد المركزي في 2000 x ج لمدة 5 دقائق.
4. تجاهل وطاف resuspend الخلايا في حوض 10 مله مع 5 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (برنامج تلفزيوني 1X) للحصول على حوالي 10 ⁸ خلايا / مل.
5. التجانس وليز خلايا التعليق من صوتنة لمدة 5 دورات، 30 ثانية لكل منهما، مع 30- 60-ق وقفة على الجليد، وذلك باستخدام المحمولة، باليد المعالج بالموجات فوق الصوتية أو عن طريق غمس الأنبوب في حمام مائي ل اختلال الخلية في أقصى سعة (30 كيلو هرتز).
6. كرر الخطوات من 1،3-1،5 لكل سلالة من cyanobacterium.
   ملاحظة: صوتنة تنتج تمزق خلية وإطلاق المحتوى الخلوي. بينما البروتينات والسكريات هي immunogens جيدة، جزيئات محددة، مثل الدهون والأحماض النووية، لا تحفز على الاستجابة المناعية الخلطية من تلقاء انفسهم. لذلك، يجب أن ربط شركات، مثل السكريات أو البروتينات، لزيادة تعقيد الجزيئي. وبالإضافة إلى ذلك، صوتنة النشرات المواد داخل الخلية والذي يمكن أن يؤدي الى انتاج الأجسام المضادة.

2. إنتاج الأجسام المضادة بولكلونل

1. إعداد IMM الأولجرعة unogen عن طريق خلط 0.5 مل من المحللة خلية ultrasonicated حصلت عليه في الخطوة 1.5 مع 0.5 مل من مساعد الكامل فرويند. إيصالها إلى مشغل منشأة الحيوانية لبولكلونل إنتاج الأرانب الأجسام المضادة.
2. إعداد ثلاث جرعات أكثر كما كان من قبل لاستخدامها مرة أخرى كما يعزز الذاكرة في عملية إنتاج الأجسام المضادة عن طريق خلط 0.5 مل من جناسة نفسه / المحللة حصلت عليه في الخطوة 1.5 مع 0.5 مل من مساعد ناقصة فرويند. تعطيها للمنشأة الحيوانية لتحقيق عملية إنتاج الأجسام المضادة.
3. كرر الخطوات من 2.1 و 2.2 لكل عملية إنتاج الأجسام المضادة الجديدة.
   ملاحظة: عادة، ويعهد إنتاج الأجسام المضادة لمرافق الحيوان المتخصصة أو الشركات، لأن المطلوب الترخيص والتدريب المناسب للعمل مع الحيوانات. شركات توريد انزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) قياس النسبي لكمية من الأجسام المضادة مستضد معين الموجودة في عينة الدم.

3. الجسم المضاد Purification

1. تنقية المناعي G (مفتش) جزء من كل من المناعة والمصل قبل المناعة التي تم جمعها في الخطوة 2 من البروتين واللوني التقارب. بعض مجموعات تنقية التجارية، على أساس أنظمة خرطوشة، تعمل بشكل جيد. اتبع تعليمات مقدم.
2. عندما لا عدة تنقية توفير نظام تحلية، تغيير المخزن المؤقت بعد شطف من الأجسام المضادة النقاء إلى 0.1X برنامج تلفزيوني، إما عن طريق الغسيل الكلوي أو باستخدام أجهزة الطرد المركزي تصفية مع 100 كيلو دالتون (أو أقل) حجم مسام الغشاء.
3. تحديد تركيز الأجسام المضادة عن طريق قياس الامتصاصية في 280 نانومتر أو باستخدام الأساليب اللونية، مثل برادفورد ^23، لوري ^24، أو حمض Bicinchoninic (BCA) ^25.
   ملاحظة: من المهم تجنب بما في ذلك المجموعات أمين في شطف العازلة (على سبيل المثال، ومخازن تريس) لأنها تتنافس مع الأجسام المضادة للربط على الأسطح الصلبة تفعيلها مع مجموعة الايبوكسي. بعد بوrification، فمن المهم لاختبار النشاط الضد مع إليسا.

4. الإسفار الأجسام المضادة وصفها

1. تسمية الأضداد النقية التي تم الحصول عليها في القسم 3 مع تألقي (على سبيل المثال، صبغة الفلورسنت بعيدة الحمراء) عن طريق إذابة قارورة التجارية التي تحتوي على صبغة لوضع العلامات 1 ملغ من البروتين في 100 ميكرولتر من سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]). إضافة 2 ميكرولتر من صبغ حل لكل إعداد الأجسام المضادة بتركيز 2 ملغ / مل في الحجم النهائي من 50 ميكرولتر في 50 ملي المالحة الفوسفات مخزنة (الرقم الهيدروجيني 8.5).
2. الحفاظ على ردود الفعل وصفها في إطار التحريض المستمر لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة و 1،200 دورة في الدقيقة على منصة تهتز.
3. تنقية الأجسام المضادة المسمى حسب الحجم الاستبعاد اللوني (على سبيل المثال، وذلك باستخدام هلام مع مجموعة التجزئة ما بين 1.5 و 30 كيلو دالتون المحاصرين في عمود)، بناء على توصيات المورد.
4. قياس الامتصاصية في 280 نانومتر و 650 نانومتر في في eluates وحساب العلامهالكفاءة ينغ بناء على توصيات المورد.
   ملاحظة: ما يصل إلى 50 × 50 ميكرولتر يمكن القيام به ردود فعل الأجسام المضادة وضع العلامات مع قنينة واحدة من صبغة الفلورسنت لوصفها 1 ملغ من البروتين. فمن المستحسن لتغطية الأنابيب مع رقائق الألومنيوم أو، بدلا من ذلك، لاستخدام مبهمة أنابيب 0.5 مل لتجنب عمليات التبريد بعد خطوة 4.3. لالأجسام المضادة، ويتحقق وضع العلامات الأمثل مع 3-7 مول للصباغة في مول من الأجسام المضادة.

الإنتاج 5. CYANOCHIP

1. الأجسام المضادة والضوابط في حل الطباعة
   1. إعداد 30 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة النقي في حل الطباعة عن طريق خلط كل الأجسام المضادة في 1 ملغ / مل في منطقة عازلة الطباعة البروتين 1X التجاري مع 0.01٪ (ت / ت) توين 20 (أ المنظفات غير الأيونية)، كل ذلك تركيزات النهائي.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، قد تحتوي على حل الأجسام المضادة 20٪ الجلسرين، 1٪ (ث / ت) والسكروز (أو طرهالوز، كمادة حافظة)، و 0.01٪ (ت / ت) توين 20 في المخزن كربونات (درجة الحموضة 8.5).
   2. إعداد 30 ميكرولتر من الحل الطباعة والضوابط: (أ) عازلة الطباعة 1X البروتين مع 0.01٪ (ت / ت) توين 20، (ب) من البروتين مصل قبل المناعة النقي في 1 ملغ / مل في 1X عازلة الطباعة البروتين مع 0.01٪ (ت / ت) توين 20، و (ج) زلال المصل البقري (BSA) في 1 ملغ / مل في 1X عازلة الطباعة البروتين مع 0.01٪ (ت / ت) توين 20.
   3. إعداد 30 ميكرولتر من ذلك، تنقية الدم قبل المناعة fluorescently المسمى بتركيزات مختلفة (على سبيل المثال، من 50 ميكروغرام / مل إلى 1 ميكروغرام / مل) في 1X عازلة الطباعة البروتين مع توين 20، كما في الخطوة 5.1.1. وسوف تستخدم هذه العينات كعلامات إطار الفلورسنت والكمي مضان النسبي بعد اكتشاف.
   4. إضافة 30 ميكرولتر لكل بئر من حلول الطباعة أعد الخطوات 5.1.1، 5.1.2، 5.1.3 وعلى أعلى جودة 384 جيدا microplates لتصنيع ميكروأري، مثل البولي بروبلين.
      ملاحظة: عازلة الطباعة البروتين يزيد من جودة واستقرار الأجسام المضادة، وتوين 20 تجانس بقعة موrphology ويبني البروتين اقتران تصل. فمن المستحسن للحفاظ على صفيحة 384 جيدا في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام. تخزينه عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لفترات طويلة من الزمن. مادة البولي بروبيلين لديها الحمض النووي منخفضة، والبروتين، واستخراج الخلايا، وجزيء صغير ملزم جوهري.
2. طباعة الأجسام المضادة على شريحة المجهر
   ملاحظة: طباعة الأجسام المضادة على الشرائح المجهر تفعيلها باستخدام منصات مجموعة مختلفة، مثل الاتصال، وانقسام إبرة، أو أجهزة عدم الاتصال، مثل الطابعات كهرضغطية أو تقنيات "الحبر النفاث". في هذا العمل، وCYANOCHIP وقد طبع بشكل روتيني عن طريق الاتصال باستخدام النظام الآلي (arrayer) قادرة على اكتشاف كميات NL من الأجسام المضادة في نطاق ميكرون.
   1. تهيئة الظروف البيئية للغرفة الطباعة إلى 20 درجة مئوية و 40 - الرطوبة النسبية 50٪.
   2. إعداد ركائز الشرائح (على سبيل المثال، 75- × 25 ملم الشرائح تنشيط الايبوكسي ميكروسكوب) لأداء عدة متطابقة الأذربيجانية الأجسام المضادةيس على كل شريحة.
   3. اكتشاف كل الأجسام المضادة النقي، بما في ذلك الضوابط والإطار المرجعي، في نمط بقعة ثلاث نسخ. في ظل هذه الظروف، والبقع هي 180-200 ميكرون في القطر.
   4. بعد الطباعة، وترك الشرائح لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة الحرارة المحيطة السماح لهم الجافة، ومن ثم تخزينها في 4 درجات مئوية. للعمل في هذا المجال، الشرائح يمكن نقلها وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
      ملاحظة: يتم طباعة CYANOCHIP في شكل ميكروأري بقعة ثلاث نسخ مع 3 × 8 ميكروأرس متطابقة لكل شريحة أو 9 صفائف متطابقة في شكل ميكروأري 1 × 9. لا يجب أن يكون حجم كل مجموعة أعلى من أبعاد دائرة رد الفعل لطوقا 24-جيدا (عادة 7.5 × 6.5 مم في غرفة التهجين 3 × 8).
   5. قبل استخدام ميكروأري لتحليل العينات البيئية، واستخدام FSMI لتحديد تخفيف العمل لكل الأجسام المضادة في منحنى المعايرة. لكل الأجسام المضادة، واستخدام تركيز المعياري للIMM المقابلةunogen ⁽¹⁰ مارس - 10 أبريل خلية / مل) والتخفيفات المسلسل من الأجسام المضادة فلوري (بين 1: 500 و 1: 32000). تركيز الأجسام المضادة الأمثل يتوافق مع 50٪ من الحد الأقصى لكثافة إشارة تم الحصول عليها في منحنى المعايرة. أيضا، لا بد من تحديد حساسية وخصوصية لكل الأجسام المضادة، كما هو موضح في بلانكو وآخرون. ^22.

6. إعداد Multianalyte مقتطفات البيئي للمناعية الفلورسنت ساندويتش ميكروأري (FSMI)

1. استخراج Multianalyte من عينة السائل
   1. خذ 1-100 مل من عينة السائل مع محقنة معقمة (على سبيل المثال، الماء من الشاطئ من خزان المياه)؛ كمية من العينة يعتمد إلى حد كبير على تركيز المحتمل للأهداف.
   2. تركيز الخلايا عن طريق تمرير عينة المياه من خلال حجم المسام 3 ميكرون، 47 ملم مرشح قطر البولي. تركيز الخلويةبين ¹⁰ مارس - 10 أغسطس خلية / مل من المرغوب فيه للكشف إيجابي، ولكن التركيز الحقيقي غير معروف.
   3. استرداد الكتلة الحيوية التي تم جمعها في تصفية مع 1 مل من مخزنة المالحة تريس المعدلة العازلة توين 20 عزز (TBSTRR؛ 0.4 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8)، 0.3 M كلوريد الصوديوم، و 0.1٪ توين 20) عن طريق كشط مع ملعقة في أنبوب 15 مل.
   4. التجانس وتفصيل باستخدام المعالج بالموجات فوق الصوتية المحمولة باليد، كما هو موضح في الخطوة 1.5، أو فقط من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. هذا يعد عينة لتحليلها من قبل ميكروأري.
2. استخراج Multianalyte من العينة الصلبة
   1. يصل وزنه إلى 0.5 غرام من العينة الصلبة (مثل الصخور والتربة، والرواسب) في أنبوب 10 مل وتضيف ما يصل إلى 2 مل من TBSTRR.
   2. يصوتن بغمر التحقيق sonicator في الأنبوب، عن طريق غمس الأنبوب في حمام مائي لsonicator القرن قوية، أو باستخدام sonicator باليد. أداء لا يقل عن 5 × 30-قدورات في 30 كيلوهرتز، ووقف لمدة 30 ثانية في حين على الجليد.
   3. تصفية لإزالة الرمال والطين، وغيرها من المواد الخشنة مع حقنة 10 مل بالإضافة إلى قطر 10- إلى 12 ملم، 5- إلى 20 ميكرون حامل حجم المسام مرشح من النايلون. دفع عينة من خلال مرشح في أنبوب 1.5 مل. إذا كان يشبع التصفية، تستنهض الهمم معلق في حقنة وأخذه إلى واحد جديد. هذا وتعد المواد الترشيح لالمناعية (الخطوة 7).
      ملاحظة: سعة التخزين المؤقت من TBSTRR تعتمد على نوع العينة. ومن المهم لتنفيذ المناعية على الفور بعد إعداد مستخلص البيئي لتجنب تأثير تدهور الأنزيمية على التحاليل. بدلا من ذلك، إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني في استخراج البيئي وتجميد في -80 درجة مئوية حتى الخطوة التالية.

7. الفلورسنت ساندويتش ميكروأري المناعية (FSMI)

1. منع CYANOCHIP
   ملاحظة: مباشرة قبل الاستعمال، علاج عrinted الشرائح لمنع جميع الفئات الايبوكسي مجانا على الشريحة ولإزالة الفائض من الأجسام المضادة ملزمة غير تساهمي.
   1. تزج ميكروأري إلى 0.5 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 9) مع 5٪ (ث ت /) حل جيش صرب البوسنة على سطح نظيف (على سبيل المثال، طبق بيتري أو أنبوب 50 مل) مع الانفعالات خفيفة من منصة الروك لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك، وضع الانزلاق في الصعود إلى 100- 200 ميكرولتر قطرة من حل أعلاه مع البقع ميكروأري التي تواجهها. يترك لمدة 3-5 دقائق ثم المضي قدما.
   2. اختيار بعناية الشريحة باستخدام الملقط ذات الرؤوس البلاستيكية. في محاولة لتجنب المناطق ميكروأري مؤثرة. القضاء على الفائض من السوائل عن طريق ضرب بهدوء الشريحة على منشفة ورقية. تزج به في 0.5 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8) مع 2٪ (ث / ت) حل جيش صرب البوسنة لمدة 30 دقيقة مع الإثارة خفيفة من منصة الروك.
   3. تجف الشريحة عن طريق إجراء الطرد المركزي القصير (200-300 x ج لمدة 1 دقيقة) باستخدام microcentrifuge لالتجارية تكييفها لشرائح المجهر. بدلا من ذلك، تجف الشريحة عن طريق ضرب بهدوء ونطالزراعة العضوية منشفة ورقية.
2. حضانة استخراج عينة multianalyte مع ميكروأري
   1. إعداد شريحة في كاسيت ميكروأري التهجين التجاري مع 24 بئرا لميكروأرس متعددة؛ اتبع تعليمات مقدم.
   2. بعد الشريحة وكاسيت التجمع، ماصة تصل إلى 50 ميكرولتر من استخراج عينة أو التخفيف منه في TBSTRR في كل بئر من الكاسيت.
   3. كرر الخطوة 7.2.2 لكل عينة لتحليلها.
   4. كعنصر تحكم فارغة، ماصة 50 ميكرولتر من TBSTRR العازلة في اثنين على الأقل من آبار منفصلة من الكاسيت.
   5. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة مع خلط من قبل pipetting كل 15 دقيقة أو تركها تحت اهتزاز خفيف. بدلا من ذلك، واحتضان لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: استخدام الحشوات حضانة أخرى بوصفها وظيفة من نمط ميكروأري. الوقت ودرجة الحرارة للحضانة في الخطوة 7.2.5 معلمات التجريبية التي تعتمد عادة على تقارب وكي ملزمةnetics كل ازواج مستضد الضد.
3. غسل
   1. إزالة عينات من خلال وضع شريط أسفل وبعناية يطرق على ورقة نظيفة، ماصة.
   2. غسل الآبار وذلك بإضافة 150 ميكرولتر من TBSTRR إلى كل واحد، والقضاء على المخزن المؤقت، على النحو الوارد أعلاه.
   3. كرر الخطوة 7.3.2 ثلاث مرات أكثر.
4. الحضانة مع الأجسام المضادة للكشف الفلورسنت
   1. إضافة 50 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة التي تحتوي على 17 أضداد السيانوبكتيريا سلالة، كل المسمى مع تألقي في TBSTRR مع 1٪ (ث / ت) BSA. تحديد تركيز كل الأجسام المضادة فلوري في خليط (0،7-2 ميكروغرام / مل) عن طريق إجراء التجارب المعايرة من كل زوج مستضد / الأجسام المضادة ^22.
   2. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، كما هو موضح في الخطوة 7.2.5، أو لمدة 12 ساعة عند 4 درجات مئوية.
5. غسل من الأجسام المضادة الفلورسنت </ قوي>
   1. إزالة الأجسام المضادة غير منضم الفلورسنت، كما في الخطوة 7.3.
   2. تفكيك كاسيت وتزج الشريحة إلى 0.1X برنامج تلفزيوني (على سبيل المثال، في أنبوب 50 مل) لشطف سريع.
   3. تجف الشريحة كما في الخطوة 7.1.3.

8. الضوئي لالإسفار

1. فحص شريحة لمضان في أقصى ذروة مضان الانبعاثات لصبغة الفلورسنت بعيدة الحمراء في الماسح الضوئي لمضان. أخذ عدة صور من المجهرية في المعلمات مسح مختلفة، عموما عن طريق خفض قيمة كسب الليزر.
   ملاحظة: تجنب البقع المشبعة (> 65،000 التهم مضان) -أنهم خارج نطاق وقد إدخال أخطاء القياس الكمي.

9. معالجة الصور وتحليل البيانات

1. استخدام البرمجيات التجارية لتحليل الصور وتقدير. يوفر البرنامج قياسات كثافة مضان (FI، متوسط ​​أو متوسط ​​كل بكسل من بقعة واحدة) للبريدبقعة منظمة العمل ضد الجوع من ميكروأري كله. طرح الخلفية المحلية في جميع أنحاء المناطق: FI = FI _البقعة - FI _{خلفية المحلية.}
2. حفظ البيانات FI وفتحها باستخدام برنامج جدول بيانات.
3. استخدام القيم التي تم الحصول عليها لصفائف فارغة كما سيطرة سلبية لتحديد والتخلص من ايجابيات كاذبة. تطبيق المعادلة التالية لحساب FI لكل بقعة الأجسام المضادة: FI = (FI _عينة - FI _{فارغة)،} حيث FI _عينة = FI _البقعة - تشغيل FI _{خلفية المحلية} في المجهرية مع مقتطفات عينة وFI _فارغة = _بقعة FI - FI _{خلفية المحلية} في ميكروأرس فارغة.
4. تطبيق عتبة قطع إضافية من 2- 3 أضعاف متوسط ​​FI من ميكروأري كله لتقليل احتمال من ايجابيات كاذبة. هذا مهم بشكل خاص للصور ميكروأري ذات نوعية رديئة، وانخفاض نسب الإشارة إلى الضوضاء.
5. خلق المؤامرات و / أو تنفيذ مزيد من التحليل عند الضرورة.

النتائج

يصف هذا العمل اختبار المقايسة المناعية تعدد الإرسال لتحديد وقت واحد من الأنواع السيانوبكتيريا المياه العذبة الأكثر صلة (الجدول 1) باستخدام ميكروأري CYANOCHIP الأجسام المضادة. ميكروأري يمكن أن يكون شكل 3 × 8 ميكروأري المطبوعة على شرائح المجهر. و?...

Discussion

هنا، يتم وصف لتعدد الإرسال الفلورسنت شطيرة المناعية باستخدام CYANOCHIP، ميكروأري 17-الأجسام المضادة للكشف والتعرف على مجموعة واسعة من أجناس السيانوبكتيريا، ^22. وتمثل هذه البكتيريا الزرقاء أجناس القاعية والعوالق الأكثر شيوعا في موائل المياه العذبة، وبع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 mm pore diameter filters	Millipore	GSWP04700	For preparation of immunogens
Eppendorf  5424R microcentrifuge	Fisher Scientific		For preparation of immunogens
Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10x)	Thermo Fisher Scientific	70011036	50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4
Ultrasonic processor UP50H	Hielscher		For preparation of immunogens
Complete Freund's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5881	Immunopotentiator
Incomplete Freud's adjuvant	Sigma-Aldrich	F5506	For boost injections
Protein A antibody purification kit	Sigma-Aldrich	PURE1A	For isolation of IgG
Centrifugal filter devices MWCO<100 kDa	Millipore	UFC510096-96K	For isolation of IgG
Dialysis tubings, benzoylated	Sigma-Aldrich	D7884-10FT	For isolation of IgG
Illustra Microspin G-50 columns	GE-HealthCare	GE27-5330-02	For isolation of IgG
Bradford reagent	Sigma-Aldrich	B6916-500 mL	To quantify the antibody concentration
MicroBCA protein assay kit	Thermo Scientific	23235	To quantify the antibody concentration
Protein arraying buffer 2x	Whatman (Sigma Aldrich)	S00537	Printing buffer; 30 - 40% glycerol in 1x PBS with 0.01% Tween 20
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416	Non-ionic detergent
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418	Control  for printing; blocking reagent
384-wells microplate	Genetix	X6004	For antibody printing
Robot arrayer for multiple slides	MicroGrid II TAS arrayer from Digilab		For antibody printing
Epoxy substrate glass slides	Arrayit corporation	VEPO25C	Solid support for antibody printing
Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester	Molecular probes	A20006	Fluorochrome
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418	Fluorochrome dissolvent
Heidolph Titramax vibrating platform shaker	Fisher Scientific		For antibody labeling
Illustra Microspin G-50 columns	Healthcare	27-5330-01	For purification of labeled antibodies
Safe seal brown 0.5 mL tubes	Sarstedt	72,704,001	For labeled antibodies storage
Nanodrop 1000 spectrophotometer	Thermo Scientific		To quantify antibody concentration and labeling efficiency
3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter	Millipore	TMTP04700	To concentrate cells
1 M Trizma hydrochloride solution pH 8	Sigma-Aldrich	T3038	For TBSTRR preparation; to block slides
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653	For TBSTRR preparation
20 µm nylon filters	Millipore	NY2004700	For environmental extract preparation
10 - 12 mm filter holders	Millipore	SX0001300	For environmental extract preparation
Protease inhibitor cocktail	Sigma-Aldrich	P8340	For environmental extract storage
1 M Trizma hydrochloride solution pH 9	Sigma-Aldrich	T2819	To block slides
Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker	VWR		To block slides; for incubation processes
VWR Galaxy miniarray microcentrifuge	VWR	C1403-VWR	To dry slides
Multi-Well microarray hybridization cassette	Arrayit corporation	AHC1X24	Cassette for 24 assays per slide
GenePix 4100A microarray scanner	Molecular Devices		Scanner for fluorescence
GenePix Pro Software	Molecular Devices		Software for image analysis and quantification