تشريح ومراقبة من عسل النحل ظهري سفينة لدراسات وظيفة القلب

Summary

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Abstract

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Introduction

ويتمثل الهدف العام من هذه المنهجية هو السماح للمحقق لمراقبة بسرعة وسهولة، وبتحديد التأثير أن وكيل الدوائي له على معدل ضربات القلب من عسل النحل. النحل، مثل غيرها من الحشرات، يكون نظام الدورة الدموية المفتوحة التي تنشر الدملمف، أي ما يعادل الحشرات من الدم، في جميع أنحاء تجويف الجسم، والمعروفة باسم hemocoel. تداول الدملمف ضروري لنقل المواد الغذائية وعوامل المناعة، والنفايات، وكذلك هرمونات عصبية وغيرها من الجزيئات يشير الى ^1. ومما يسهل تداولها من قبل سفينة الظهرية، والتي تمتد على طول خط الوسط الظهرية من الحشرات، وكذلك أجهزة نابض التبعي. ينقسم السفينة الظهرية إلى قسمين متميزة وظيفيا، عين القلب في البطن والشريان الأورطي في الصدر والرأس. تقلصات نشر في الدملمف مضخة القلب نحو الصدر والرأس، في حين تضمن أجهزة نابض التبعي تدفق اللمف الدموي إلى الحدود القصوى.

الطبقة = "jove_content"> الحشرات وظيفة القلب ويمكن ملاحظة ذلك باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب، وهذا يتوقف على حجم، مرحلة علم وظائف الأعضاء، أو حياة الحشرة. نهج مشترك لمراقبة معدل ضربات القلب في اليرقات والحشرات الصغيرة هو استخدام التصوير حيوي داخلي ^2. هذا الأسلوب هو أقل فائدة في النحل البالغ، ولكن، كما أنه يمكن أن يكون من الصعب عرضها بشكل واضح السفينة الظهرية من خلال جدار البطن. نهج مستقر لتسجيل معدل ضربات القلب في مجموعة متنوعة من الحشرات، بما في ذلك النحل، هو استخدام الحراري الاتصال، الذي يستخدم الثرمستورات تطبيقها على السطح الخارجي للحشرة لكشف نبضات القلب ^3،4. كما تم تسجيل معدل ضربات القلب في النحل البالغ باستخدام تقنية الكهربية لقياس والكهربائية ^4،5 إشارة مقاومة. هذا الأسلوب يتطلب إدخال أقطاب كهربائية في الحيوان بجانب القلب واستخدام محول مقاومة لتسجيل دقات القلب ^(4). وبالمثل، استخدمت الكهربائي إلى DETECر الإشارات الكهربائية التي ينتجها القلب وجنبا إلى جنب مع تسجيل فيديو للنحل لمراقبة التغيرات في نشاط القلب ^6. وهناك ميزة واضحة لهذه المناهج هي أن معدل ضربات القلب يتم تقييم في حالها، والنحل الحية، وليس في عينة تشريح، مما يساعد على ضمان توفر مجموعة كاملة من الاستجابات الفسيولوجية في هذا الموضوع. وتشمل التحديات من هذه الأساليب المحاسبية لتجميد أو تخدير لهذا الموضوع، والحاجة للحد من متغيرات ومؤثرات الخارجية التي قد تغير معدل ضربات القلب، وكذلك تحديد طريقة تسليم المناسب عند اختبار وكلاء الدوائية.

مقاربة أخرى التي استخدمت لدراسة النحل النشاط القلبي لتشريح جزء من الحشرة من أجل فضح القلب، ثم قياس تقلصات سفينة الظهرية باستخدام القوة التشريد محول ^7. في هذا البروتوكول، واستحم القلب باستمرار مع المياه المالحة الفسيولوجية التي تعمل بنظام التشغيل والاختبار المشتركmpounds يمكن حله في هذا الحل لتطبيق لهذا الموضوع ^(7). وهناك فرق كبير بين هذه الطريقة وتلك التي سبق وصفها هو أن الحبل العصبي البطني تتم إزالة، والقضاء على الدور الذي ثبت الجهاز العصبي المركزي للعب في تحوير معدل ضربات القلب ^5. والنتيجة هي أن ضربات القلب الأساسي، التي عادة ما تكون غير منتظمة جدا، تستقر على تردد أقل من ذلك بكثير والسعة من عادة ما لوحظ في حشرة تعيش ^5،7. ما كل من هذه الأساليب تكون مشتركة هي أنها تتطلب معدات متخصصة للغاية ومكلفة في كثير من الأحيان، بالإضافة إلى مستوى معين من الخبرة، من أجل أن تتم. ولعل أكبر العيب هو أن أيا من هذه الطرق بشكل خاص مناسبة تماما لالتجارب التي تنطوي على اختبار عدد كبير من الموضوعات، مثل فحص مكتبة من مركبات يحتمل cardiomodulatory.

أعظم قوة النهج الموصوف هناهو بساطته. بروتوكول من السهل نسبيا لإتقان، والإعداد يتطلب مساحة صغيرة، وفقط المدخلات المالية الحد الأدنى الضروري. والأسلوب يتطلب أكثر قليلا من بعض النحل، عدد قليل من الأدوات الجراحية، وهو محلول متساوي التوتر، وإما المجهر الرقمي أو المجهر التقليدية مع كاميرا رقمية. يتم تشريح النحل لتصور السفينة الظهرية وتستخدم أشرطة الفيديو الرقمية لتسجيل معدل ضربات القلب قبل وبعد العلاج مع وكلاء الدوائية. وعلى الرغم من تسجيل الفيديو ليست في الواقع ضرورية لمراقبة التغيرات في معدل ضربات القلب، وسوف تزيد بشكل كبير الإنتاجية (أي عدد من المواضيع التي يمكن معالجتها في فترة معينة من الزمن). يمكن للمحقق تعظيم كفاءة من خلال تسجيل عدد كبير من أشرطة الفيديو في وقت واحد ومن ثم في وقت لاحق وسجل أشرطة الفيديو هذه في وقت أكثر ملاءمة. ميزة أخرى لهذا النهج هو أن أشرطة الفيديو تسمح المحقق للبدء من جديد، يجب أن توقف عملية التهديف، وجعلها أسهل للالخامسiewer ليكون أعمى للعلاج من أجل الحد من التحيز.

Protocol

1. جمع وإعداد الموضوعات اختبار

1. جمع العدد المناسب من النحل من مستعمرة.
   ملاحظة: إن العدد المطلوب يعتمد على ليس فقط حجم ونطاق التجربة، ولكن أيضا مهارة المحقق. على سبيل المثال، إذا كان هناك 2 مجموعات العلاج مع حجم العينة المطلوبة من 10 النحل في كل مجموعة، قد محقق المهرة معقول جمع لا يقل عن 30 النحل لحساب تشريح فاشلة وينتهي مع 20 شريط فيديو مفيدة للتسجيل.
2. تقليل كمية الوقت الذي يمر بين جمع وتشريح.
   ملاحظة: على الرغم من أن النحل يمكن أن يضم في المختبر لعدة أيام قبل تشريح، ونسبة نجاح تشريح (أي احتمال من الحفاظ على معدل ضربات القلب مستقر في سفينة الظهرية تشريح) وقد لوحظ أن ينخفض نسبة إلى مقدار الوقت الذي ويعيش النحل بعيدا عن مستعمرة.
   1. توفير النحل مع مصدر المياه والغذاء في حين يضم في المختبر. لإكساءmple، كحد أدنى، وتوفير الوصول إلى 50٪ (ث / ت) حل السكروز في الماء (وهذا يكفي لفترات أقل من 6 ساعات). لفترات أطول، وتوفير النحل الوصول إلى العسل.
   2. النحل منزل في ليلة وضحاها المختبر عند درجة حرارة حوالي 32 درجة مئوية والرطوبة النسبية 60-80٪ للحد من التوتر وتجنب الجفاف.
3. قبل التشريح، وتخدير النحل لفترة وجيزة للمساعدة في التعامل معها.
   ملاحظة: هذا يمكن أن تقلل من نسبة نجاح تشريح وتقليل الإنتاجية.
   1. هدئ النحل إما عن طريق وضعها على الجليد أو في الثلاجة لفترة طويلة بما يكفي للحد من حركة من أجل مساعدة في التعامل معها.
   2. بدلا من ذلك، كشف لفترة وجيزة النحل إلى CO ₂ وذلك للمساعدة في التعامل معها.
      ملاحظة: التعرض للبرد الموسع يمكن أن تقلل من نسبة نجاح التشريح. تمديد أو التعرض المتكرر للCO ₂ يمكن أيضا أن يقلل من نسبة نجاح التشريح.

2. تشريحفي ظهري جدار البطن

ملاحظة: يجب أن يكون النحل على قيد الحياة في وقت تشريح.

1. باستخدام ملقط و / أو مقص تسليخ مجهري، إزالة الأرجل والأجنحة لتسهيل تشريح البطن. الحفاظ على كوب صغير أو حاوية مماثلة مملوءة بالماء المقطر قريب لغرض الشطف الصكوك بين التشريح.
2. بينما يقيد النحل مع ملقط، واستخدام مقص تسليخ مجهري لقطع أفقيا على طول جدار البطن الظهري بين tergites الأولى والثانية (انظر الشكل 1).

الشكل 1: عرض الظهرية من البطن النحل. وينبغي أن يتم شق الأولي بين tergites الأولى والثانية، والرمز بواسطة الخط الأحمر. شريط مقياس = 1 مم. الرجاء الضغط عليهاالبريد لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. في حين تجتاح بخفة الحافة الخلفية للtergite الثاني مع ملقط، قطع طولي على طول كل جانب من النحل من شق الأولي إلى الحشرة (انظر الشكل 2). توخي الحذر عند قطع لتجنب ثقب الجهاز الهضمي.

الشكل 2: عرض جانبي من بطن النحل. ينبغي الشقوق الثانية والثالثة على طول جانبي البطن، والرمز بواسطة الخط الأحمر. شريط مقياس = 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. تبادل مقص لمجموعة ثانية من ملقط غرامة والاستفادة منها لفصل بعناية ظهري جدار البطن عن بقية سو البطن. إزالة بلطف الحشرة وأي جزء من الجهاز الهضمي التي لا تزال تعلق على جدار البطن الظهري. تجنب تمزق الأمعاء، كما محتويات يمكن معطف جدار البطن ويعيق التصور السفينة الظهرية.

الشكل (3): مشاهدة السفينة الظهرية. مرة واحدة وقد تم إزالة الأمعاء والواخزة، السفينة الظهرية مرئيا على طول خط الوسط من جدار البطن الظهرية تشريح. شريط مقياس = 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

5. ترتيب جدار البطن الظهري في الاتجاه المطلوب تحت الكاميرا بحيث السفينة الظهرية مرئية (انظر الشكل 3). استخدام مقص لتقليم تسليخ مجهري بعيدا أي أب الزائدجدار dominal أن يعوق التصور السفينة الظهرية. شكل جدار البطن الظهري يجب أن تشبه كوب الضحلة أو وعاء عندما تقع بشكل صحيح.
   1. منذ سفينة الظهرية لا تمتد إلى قطاع البطن أخير للنحل، وإزالة tergite النهائي من أجل تحسين التصور للسفينة الظهرية.
6. الاستفادة من micropipette حجم قابل للتعديل، وتغطي السفينة الظهرية مع 10 ميكرولتر من محلول متساوي التوتر للحفاظ على الظروف الفسيولوجية وتسهيل ضربات القلب ثابت.
   ملاحظة: الحل المقترح هو قوة الربع حل رينغر (0.120 غرام كلوريد / L الكالسيوم، 0.105 غرام / لتر كلوريد البوتاسيوم، 0.050 غرام / لتر بيكربونات الصوديوم، و2.250 غرام / لتر كلوريد الصوديوم)، والتي تم العثور عليها لتسهيل مستقرة، ضربات القلب المستمر.

3. مراقبة والتحوير من معدل ضربات القلب

1. السماح للسفينة الظهرية للجلوس دون عائق حتى يتم التوصل إلى مستقر، ضربات القلب المستمر(عادة في غضون 300 ثانية).
   ملاحظة: يتم تصور نبضات كما الانقباضات الإيقاعية للسفينة الظهرية. في البداية، قد يبدو أن هناك أي ضربات القلب، وخاصة إذا كان تخدير والنحل، ولكن القلب عادة استئناف الضرب بعد يستريح في محلول متساوي التوتر لعدة دقائق، ويمكن أن يستمر الضرب لساعات، شريطة أن يبقى استحم في حل.
2. قياس معدل ضربات القلب من حيث عدد نبضة في الدقيقة (BPM).
   1. تسجيل عدد من الانقباضات التي لوحظت خلال فترة 60 ثانية. استخدام عداد اليد رصيده وجهاز توقيت لتسهيل هذه العملية.
3. قياس التغير في معدل ضربات القلب عن طريق تسجيل BPM لوحظ قبل وبعد العلاج بمركب cardiomodulatory.
   ملاحظة: على الرغم من أن الوقت اللازم لمراقبة تأثير على معدل ضربات القلب قد تختلف تبعا لمجمع يجري اختبارها، والتغيرات في معدل ضربات القلب وعادة ما يمكن أن يلاحظ في غضون دقائق.
   1. تحديد معدل ضربات القلب خط الأساس مباشرة قبلإضافة أي مركب الاختبار.
      وعادة ما يمكن تحديد معدل ضربات القلب في مرحلة ما بعد العلاج بعد 90-120 ثانية: ملاحظة.
   2. إعداد cardiomodulators إمكانية (على سبيل المثال، أوكتوبامين) عن طريق إذابة المركب في محلول متساوي التوتر نفسه الذي استخدم ليستحم السفينة الظهرية.
   3. إضافة مركبات اختبار في حل المحيطة السفينة الظهرية من خلال الاستفادة من micropipetter.
4. لمزيد من الدقة وأعلى إنتاجية، وجعل تسجيل الفيديو من كل موضوع الاختبار ثم استخدام أشرطة الفيديو لتسجيل معدل ضربات القلب في وقت لاحق.
   ملاحظة: هذا يسمح للمحقق واحد لارباك تشريح من أجل تسهيل الإنتاج المستمر تقريبا من أشرطة الفيديو. عند تسجيل الفيديو، والحد الأدنى الموصى به من طول ما يقرب من 240 ثانية مع أي مركب اختبار يتم إضافتها على علامة 60 ثانية. وهذا يضمن أن المحقق لديه نافذة 60 ثانية لتسجيل معدل ضربات القلب الأساسي ومن ثم نافذة 60 ثانية أخرى لتسجيل بعد المعالجة معدل ضربات القلب 120 ثانيةبعد العلاج.

النتائج

لأن العديد من المركبات النشطة الدوائية التي يمكن اختبارها باستخدام هذا البروتوكول هي غير قابلة للذوبان في الماء، فإنه من الضروري أن يكون مذيب يمكن الاعتماد عليها من شأنها أن تسمح المركبات اختبار ليتم تسليمها عن طريق محلول متساوي التوتر تستخدم ليس?...

Discussion

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect⁵ or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel⁷, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8 cm, Straight, 5 mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2 cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments