زراعة<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em&gt; في ثلاثة أبعاد في المختبر

Summary

نقدم طريقة بسيطة لبناء 3D أنظمة زراعة الخيطية يسمى NGT-3D وNGB 3D. ويمكن استخدام هذه لدراسة اللياقة البدنية الخيطية والسلوكيات في الموائل التي هي أكثر مماثلة لانواع معينة ايليجانس الموائل الطبيعية من المختبر جيم لوحات ثقافة ايليجانس 2D القياسية.

Abstract

The use of genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans has led to seminal discoveries in biology over the last five decades. Most of what we know about C. elegans is limited to laboratory cultivation of the nematodes that may not necessarily reflect the environments they normally inhabit in nature. Cultivation of C. elegans in a 3D habitat that is more similar to the 3D matrix that worms encounter in rotten fruits and vegetative compost in nature could reveal novel phenotypes and behaviors not observed in 2D. In addition, experiments in 3D can address how phenotypes we observe in 2D are relevant for the worm in nature. Here, a new method in which C. elegans grows and reproduces normally in three dimensions is presented. Cultivation of C. elegans in Nematode Growth Tube-3D (NGT-3D) can allow us to measure the reproductive fitness of C. elegans strains or different conditions in a 3D environment. We also present a novel method, termed Nematode Growth Bottle-3D (NGB-3D), to cultivate C. elegans in 3D for microscopic analysis. These methods allow scientists to study C. elegans biology in conditions that are more reflective of the environments they encounter in nature. These can help us to understand the overlying evolutionary relevance of the physiology and behavior of C. elegans we observe in the laboratory.

Introduction

The study of the nematode Caenorhabditis elegans in the laboratory has led to seminal discoveries in the field of biology over the last five decades¹. C. elegans was the first multicellular organism to have its genome sequenced in 1998², and it has been invaluable in understanding the contributions of individual genes to the development, physiology, and behavior of a whole organism. Scientists now are looking to further understand how these genes may contribute to the survival and reproductive fitness of organisms in their natural environments, asking questions about ecology and evolution at the genetic level^3-5.

C. elegans once again can provide an excellent system to answer these questions. However, little is known about C. elegans biology in natural nematode habitats, and there are no current methods to simulate controlled natural conditions of C. elegans in the laboratory. In the lab, C. elegans is cultivated on the surface of agar plates seeded with E. coli bacteria⁶. In nature, however, C. elegans and related nematodes can be found sparsely inhabiting soils throughout the globe, but they are specifically found thriving in rotting fruits and vegetative matter^7,8. These three-dimensional (3D) complex environments are quite different from the simple 2D environments to which worms are exposed to in the laboratory.

To begin to answer questions about the biology of nematodes in a more natural 3D setting, we have designed a 3D habitat for laboratory cultivation of nematodes we called Nematode Growth Tube 3D or NGT-3D for short⁹. The goal was to design a 3D growth system that allows for comparable growth, development, and fertility to the standard 2D Nematode Growth Media (NGM) plates¹⁰. This system supports the growth of bacteria and nematodes over their entire life cycles in 3D, allows worms to move and behave freely in three dimensions, and is easy and inexpensive to manufacture and employ.

In the current study, we provide a step-by-step method to manufacture NGT-3D and evaluate worm development and fertility. In addition to assessing worm fitness in 3D, we sought to image, video, and assess worm behavior and physiology in 3D cultivation. Thus, in addition to NGT-3D, we present here an alternate method called Nematode Growth Bottle 3D or NGB-3D, for the microscopic imaging of C. elegans during 3D cultivation. This will be especially important for the study of known behaviors identified in 2D, and the identification of novel behaviors unique to 3D cultivation.

Protocol

1. إعداد حلول لNGT-3D وNGB-3D

1. إعداد الحلول العقيمة التالية: 1 لتر من حل 0.1454 M كلوريد الصوديوم، 1 لتر من 1 M CaCl _2، 1 لتر من 1 M MgSO _4، استذابة مرق (LB)، 1 لتر من 1 M KPO ₄ العازلة (108.3 غرام من KH ₂ ص ₄ و 35.6 غرام من K ₂ هبو _4، وملء H ₂ O إلى 1 L). إنتاج NGM استخدام هذه الحلول يمكن العثور عليها في بروتوكول السابق ^10.
2. حلول الأوتوكلاف في درجة حرارة 121 مئوية، لمدة 15 دقيقة.
3. تجهيز 50 مل من العقيمة 5 ملغ / مل حل الكولسترول. في أنبوب مخروطي 50 مل، مزيج 0.25 غرام من الكولسترول و 50 مل من 99.99٪ من الإيثانول وتخلط جيدا. لا الأوتوكلاف. تعقيم حل الكولسترول باستخدام حقنة 50 مل مع فلتر حقنة 0.45 ميكرون. وهذا أيضا إزالة أي الكوليسترول غير منحل.
4. (اختياري) إعداد 10 مل من 150 ملي من 2'-ديوكسي-5-fluorouridine الأسهم (FUdR). في أنبوب مخروطي 15 مل، مزيج 0.3693 زمن FUdR و 10 مل من الماء المقطر. هز جيدا.

2. إعداد البكتيريا الثقافة لNGT-3D وNGB-3D

1. تطعيم 10 مل مرق LB مع البكتيريا. البكتيريا العادية المستخدمة في C. ايليجانس التغذية هي كولاي سلالة OP50.
2. ثقافة التلقيح البكتيرى عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز بين عشية وضحاها.
3. استعدادا لتخفيف المسلسل، قسامة 9 مل من محلول كلوريد الصوديوم إلى العقيمة 15 مل أنابيب مخروطية. على سبيل المثال، قسامة 9 مل إلى ما مجموعه 7 أنابيب لجعل التخفيف 10 ^-7 من OP50 سلالة كولاي.
4. باستخدام معقم ماصة 1000 ميكرولتر، الماصة 1 مل من ثقافة البكتيرية أو ثقافة البكتيرية المخفف في أنبوب جديد العقيمة مع 9 مل من محلول كلوريد الصوديوم ودوامة الخليط 10 مل جيدا. كرر حتى يتم الوصول إلى التخفيف البكتيرية المطلوب.
   ملاحظة: إن تخفيف البكتيرية المطلوب يعتمد على نوع وحالة من البكتيريا فضلا عن الظروف التجريبية بالضبط.على سبيل المثال، 10 ^-6 - كان 10 ^-8 التخفيف من OP50 سلالة كولاي كافية لإنتاج 1-200 المستعمرات البكتيرية في 6.5 مل أنبوب NGT 3D. الديدان وضعت بشكل موثوق وتتكرر عادة عندما بلغ عدد المستعمرات أكثر من 60، التي وقعت في التخفيف من 10 ^-6 - 10 ^-7. لNGB-3D، استخدم تخفيف من 10 ^-8.

3. صنع NGT-3D وNGB-3D (200 مل)

1. بعد إعداد ثقافة البكتيرية، مزيج 0.6 غرام كلوريد الصوديوم، 1 غرام حبيبات أجار، و 0.5 ز ببتون في قارورة 500 مل. إدراج شريط مغناطيسي في قارورة.
2. إضافة 195 مل من الماء المقطر، وتغطية الفم من القارورة بورق الألمنيوم.
3. الأوتوكلاف 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
4. ضع قارورة تعقيمها الساخنة على طبق من ذهب ضجة، ويقلب بسرعة معتدلة لا يقل عن 2 ساعة. تبريد قارورة إلى 40 درجة مئوية. ومن المؤكد أن تبرد بما فيه الكفاية المستمر من هنا في درجات حرارة عالية قد يؤدي إلى تغيم للأجار النهائي.ومع ذلك، قد يؤدي انخفاض درجات الحرارة في تصلب السابق لأوانه أجار.
   1. (اختياري) لتسريع عملية التبريد، ضع قارورة في 40 ° C حمام الماء لمدة 15 دقيقة قبل وضع على لوحة ضجة.
5. عندما تكون درجة الحرارة من وسائل الإعلام أجار تصل 40 درجة مئوية، إضافة 200 ميكرولتر 1 م CaCl _2، 200 ميكرولتر من 5 ملغ / حل الكولسترول مل، 200 ميكرولتر 1 م MgSO ₄ و 5 مل 1 M KPO ₄ العازلة مع استمرار حل لاثارة لتركيزات النهائي من 1 ملم CaCl الكوليسترول _2، 5 ميكروغرام / مل، 1 ملي MgSO _4، 1 ملم KPO _4.
   1. (اختياري) لNGT-3D عمر فحص إضافة 80 ميكرولتر من 150 مم FUdR إلى التركيز النهائي من 120 ميكرومتر ^12.
6. إضافة 6 مل من 10 مل مخففة ثقافة البكتيرية من الخطوة 2.4 في قارورة مباشرة.
   1. (اختياري) لNGT-3D، وإزالة 6 مل من وسائل الاعلام أجار قبل الخطوة 3.6 وإبقائه دافئا بشكل منفصل. وسيتم استخدام هذه الوسائط للبكتيريا مجاناالطبقة العليا.
7. باستخدام الإجراءات العقيمة، والاستغناء عن وسائل الإعلام في غرفة الثقافة العقيمة. تأكد من أن غطاء حجرة يغلق بإحكام.
   1. (اختياري) لمنع المستعمرات البكتيرية من تشكيل في السطح العلوي للأجار، وجعل طبقة من وسائل الإعلام أجار خالية من البكتيريا من الخطوة 3.6.1 على رأس قبل وسائل الإعلام من الخطوة 3.7 يصلب تماما. وهذا خلق منطقة خالية من البكتيريا في الجزء العلوي من NGT 3D.
   2. لNGT-3D، صب 6.5 مل وسائل الاعلام الى 8 مل واضحة أنابيب اختبار من البلاستيك لجعل طبقة البكتيريا أجار، والاستغناء بعناية 200 ميكرولتر من وسائل الإعلام الحرة البكتيريا على رأس وسائل الإعلام تصلب شبه 3D لجعل bacteria- رقيقة طبقة حرة على القمة.
   3. لNGB-3D، صب 65 مل من وسائل الاعلام الى 25 سم ² واضح من البلاستيك زجاجة ثقافة الخلية. هذا المبلغ يجب ملء الجسم من 25 سم زجاجة الثقافة ² الخلية.
8. ترك غرف عموديا في درجة حرارة الغرفة لمدة أسبوع للسماح للمستعمرات البكتيرية للنموإلى حجم كبير لا يقل عن 1 ملم قطر.
   1. (اختياري) لفحص عمر في NGT-3D، غرف غطاء بورق الألمنيوم لمنع تدهور ضوء FUdR.

اللياقة البدنية 4. قياس السكان دودة على NGT-3D (الحضنة النسبي الحجم الفحص)

1. اختيار مرحلة دودة L4 باستخدام سلك البلاتين اختيار ونقل على لوحة NGM خالية من البكتيريا. السماح للدودة أن تتحرك بحرية في جميع أنحاء لبضع دقائق لإزالة البكتيريا التي تعلق على الجسم.
2. كرر الخطوة 4.1 وتأكد من أن دودة خالية من البكتيريا. عموما، وهما يكرر 4.1 كافية.
3. وضع بعناية دودة نظيفة على سطح وسائل الإعلام 3D مع اختيار سلك البلاتين. الدودة يجب أن تدخل في نهاية المطاف أجار في آغار مصفوفة 3D.
4. أغلق الغطاء السماح فضفاضة بعض الهواء للوصول الى الأنبوب، ولكن يمنع جفاف وسائل الإعلام أجار.
5. احتضان لمدة 96 ساعة على 20 درجة مئوية.
6. بعد 4 أيام، إغلاق الأغطية بإحكام ووضعغرفة الثقافة NGT-3D في حمام مئوية الماء 88 درجة لإذابة أجار. الحرارة تقتل الديدان ولكن لا تزال أجسادهم سليمة.
   ملاحظة: استخدام 8 مل أنابيب لNGT-3D، 20 - 30 دقيقة الحضانة عادة ما تكون كافية.
7. باستخدام ماصة الزجاج، ونقل وسائل الإعلام المذابة على 9 سم طبق بتري البلاستيكية. لا ينصح الماصات البلاستيكية، كما يمكن الديدان في كثير من الأحيان الالتزام بها.
8. عن طريق ناقل حركة ستيريو تشريح المجهر، والاعتماد على عدد الديدان في L3، L4، ومراحل الكبار. لا تعول الديدان التي هي مرحلة L2 والأصغر سنا، كما أجيال F1 و F2 يمكن الخلط هنا. وهكذا، هذا الاختبار هو نسبي حجم الحضنة فحص بدلا من مجموع فحص حجم الحضنة.

5. صورة وسجل دودة السلوك في NGB-3D

1. اختيار مرحلة دودة L4 باستخدام سلك البلاتين اختيار وإزالة أي بكتيريا عالقة على السطح من خلال نقل إلى لوحة NGM خالية من البكتيريا والسماح لها بالتحرك بحرية لدقائق قليلة.
2. كرر الخطوة 5.1 للتأكد من التعليم الجامعيجمهورية مقدونيا خالية من البكتيريا.
3. وضع بعناية دودة نظيفة على مركز سطح أجار في NGB-3D بالقرب من عنق الزجاجة مع اختيار سلك البلاتين. الدودة يجب أن تدخل في نهاية المطاف أجار في آغار مصفوفة 3D.
4. أغلق الغطاء السماح فضفاضة بعض الهواء للوصول الى الأنبوب، في حين منع جفاف وسائل الإعلام أجار.
5. صورة أو تسجيل دودة تحت انتقال ستيريو تشريح المجهر. ضبط التركيز مع تحرك دودة من خلال مصفوفة 3D.

النتائج

بناء NGT-3D هو بروتوكول بسيط ومباشر الذي ينتج في أنبوب اختبار مليئة أجار مع المستعمرات البكتيرية صغيرة متباعدة في جميع أنحاء أجار (الشكل 1A). يمكن الديدان تتحرك بحرية من خلال مصفوفة أجار، وإيجاد واستهلاك المستعمرات البكتيرية. لتأكيد ما إذا C....

Discussion

كانت زراعة مختبر جيم ايليجانس باستخدام لوحات وسائط النمو الخيطية الكلاسيكية حاسمة لمئات من الاكتشافات الهامة من ان البحث في C. ايليجانس التي قدمها. هنا، فإننا نقدم طرق جديدة لزراعة C. ايليجانس في بيئة تعكس بشكل أكثر دقة الطبيعية موائلها ثلاثية الأبعاد. ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB broth, Miller (Luria-Bertani)	Difco	224620
Sodium chloride	DAEJUNG	7548-4400	58.44 MW
Agar, Granulated	Difco	214530
Peptone	Bacto	211677
Calcium chloride, dihydrate	Bio Basic	CD0050	2*H2O; 147.02 MW
Cholesterol	Bio Basic	CD0122	386.67 MW
Ethyl alcohol	B&J	RP090-1	99.99%; 46.07 MW
Magnesium sulfate, anhydrous	Bio Basic	MN1988	120.37 MW
Potassium phosphate, monobasic, anhydrous	Bio Basic	PB0445	136.09 MW
2'-Deoxy-5-fluorouridine	Tokyo Chemical Industry	D2235	246.19 MW
Potassium phosphate, dibasic, anhydrous	Bio Basic	PB0447	174.18 MW
Multi-Purpose Test Tubes	Stockwell Scientific	ST.8570	8 ml
Test Tube Closures	Stockwell Scientific	ST.8575
Cell Culture Flask	SPL Lifescience	70125	25 cm2
Research Stereo Microscope	Nikon	SMZ18
High-Definition Color Camera Head	Nikon	DS-Fi2
PC-Based Control Unit	Nikon	DS-U3
NIS-Elements Basic Research, Microscope Imaging Software	Nikon	MQS32000