JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لقد وضعنا طريقة لتنقية البروتينات التفاعل coregulatory باستخدام نظام LC-MS / MS.

Abstract

Transcriptional coregulators are vital to the efficient transcriptional regulation of nuclear chromatin structure. Coregulators play a variety of roles in regulating transcription. These include the direct interaction with transcription factors, the covalent modification of histones and other proteins, and the occasional chromatin conformation alteration. Accordingly, establishing relatively quick methods for identifying proteins that interact within this network is crucial to enhancing our understanding of the underlying regulatory mechanisms. LC-MS/MS-mediated protein binding partner identification is a validated technique used to analyze protein-protein interactions. By immunoprecipitating a previously-identified member of a protein complex with an antibody (occasionally with an antibody for a tagged protein), it is possible to identify its unknown protein interactions via mass spectrometry analysis. Here, we present a method of protein preparation for the LC-MS/MS-mediated high-throughput identification of protein interactions involving nuclear cofactors and their binding partners. This method allows for a better understanding of the transcriptional regulatory mechanisms of the targeted nuclear factors.

Introduction

تفاعلات البروتين البروتين تلعب دورا هاما في العديد من الوظائف البيولوجية. على هذا النحو، قد تورطت هذه التفاعلات في نقل الإشارة. نقل البروتين عبر أغشية الخلايا. استقلاب الخلية. والعديد من العمليات النووية، بما في ذلك تكرار الحمض النووي، وإصلاح الحمض النووي من التلف والتوحد، والنسخ 1، 2، 3، 4. تحديد البروتينات المشاركة في هذه التفاعلات لذا فمن الأهمية بمكان تعزيز فهمنا لهذه العمليات الخلوية.

مناعي (IP) هو أسلوب التحقق من صحة استخدامها لتحليل التفاعلات البروتين البروتين. من أجل تسهيل التعرف على البروتينات immunoprecipitated المشترك، وغالبا ما يستخدم قياس الطيف الكتلي 5، 6، 7، 8،9. من خلال استهداف عضوا معروفا في مجمع البروتين مع الأجسام المضادة، فمن الممكن لعزل بروتين معقد وتحديد وقت لاحق مكوناته غير معروفة عن طريق تحليل الطيف الكتلي. ARIP4 (الاندروجين-التفاعل مستقبلات البروتين 4)، وcoregulator النسخي، يتفاعل مع البروتينات المستقبلة النووية من أجل تنشيط أو قمع المروجين هدفه بطريقة تعتمد على السياق 9 و 10. من أجل فهم أفضل الآليات التنظيمية النسخي التي تحكم هذه العوامل النووية، وصفنا أسلوبا شاملا لتنقية وتحديد ARIP4 البروتينات التفاعل باستخدام نظام LC-MS / MS.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. ترنسفكأيشن

  1. البذور خلايا HEK293 في لوحات ثقافة 100 ملم (2 × 10 6 خلية / طبق). ثقافة الخلايا في المتوسط ​​Dulbecco لتعديل النسر تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 100 وحدة / مل البنسلين. احتضان الخلايا في حاضنة ترطيب عند 5٪ CO 2 و 37 درجة مئوية.
  2. في اليوم التالي، transfect الخلايا مع 10 ميكروغرام من الموسومة FLAG ARIP4 البلازميد باستخدام 40 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن وفقا لتوجيهات المصنع 11.

2. البروتين استخراج

  1. ما يقرب من 36 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وغسل الخلايا مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني وحصاد الخلايا باستخدام مكشطة. نقل الخلايا إلى mltube 1.5 وأجهزة الطرد المركزي أنه في 8000 x ج لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. نضح في وطاف و resuspend بيليه خلية في 5X حجم بيليه من 0.4 عازلة M بوكل (عالية عازلة الملح: 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0) و 0.4 M بوكلو 5 ملي MgCl 2، 10٪ الجلسرين، 0.1٪ NP-40، و 10 ملي ب-mercaptethanol، 1X مثبط البروتياز كوكتيل). تدوير الخليط لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  2. أنبوب الطرد المركزي في 17700 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  3. نقل طاف (استخراج خلية كاملة) لأنبوب جديد 2 مل وإضافة 3X حجم الأولي من 0 عازلة M بوكل (التخفيف المخزن المؤقت: 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 5 ملي MgCl 2، 10٪ الجلسرين، 0.1٪ NP-40، و 10 ملي β-المركابتويثانول، 1X مثبط البروتياز كوكتيل).
  4. أداء الطرد المركزي أخرى (17700 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية)، ونقل طاف (كله استخراج الخلايا) إلى أنبوب 2 مل الجديد.

3. مناعي

  1. أثناء الطرد المركزي (2.4)، وغسل 50 ميكرولتر من الخرز مكافحة FLAG مع برنامج تلفزيوني، 0.1 M الجلايسين-هيدروكلوريد، ثم 1 M تريس، هيدروكلوريد، تليها غسل مرتين مع 0.1M العازلة بوكل (منخفض عازلة الملح: 20 ملي Tris- حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 0.1 م بوكل، 5 ملي MgCl2، 10٪ الجلسرين، 0.1٪ NP-40، 10 مM ب المركابتويثانول، 1X مثبط البروتياز كوكتيل). يتم تنفيذ الطرد المركزي لعملية غسل هذا في 2000 x ج لمدة 1 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  2. مزيج 50 ميكرولتر من الخرز FLAG مع مقتطفات خلية كاملة وتناوب بلطف الخليط لمدة 4 ساعات في 2-4 درجة مئوية (وينبغي أيضا أن تبقى 1٪ من استخراج خلية كاملة من الخطوة 2.4 في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل كمدخل).
  3. نقل العينة إلى عمود الدوران الصغير (انخفاض الجاذبية). الحفاظ على التدفق من خلال في أنبوب 1.5 مل، وتجميد باستخدام النيتروجين السائل، وتخزينه في -80 درجة مئوية (فحص مستويات البروتين من كل من المدخلات والتدفق من خلال استخدام تحليل لطخة غربية).
  4. إضافة 1 مل من 0.1 العازلة M بوكل (منخفض عازلة الملح) لتغسل حبات FLAG (انخفاض الجاذبية).
  5. كرر الخطوة 3.4 على الأقل أربع مرات أكثر (أي ما مجموعه خمسة يغسل).

4. شطف

  1. وضع عمود في أنبوب 1.5 مل وأجهزة الطرد المركزي أنه في 2000 x ج لمدة 1 دقيقة. والخرز يجف.
  2. سقف أسفل العمود.
  3. إضافة 50 ميكرولتر (مساو لحجم حبات FLAG) من 0.1 M جليكاين، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 2.5).
  4. يهز بلطف الخليط لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. وضع عمود في أنبوب 1.5 مل جديد وأجهزة الطرد المركزي أنه في 2000 x ج لمدة 1 دقيقة.
  6. هو تحييد الحل مزال مع 10 ميكرولتر من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)؛ تخلط جيدا من قبل pipetting أو باستخدام آلة دوامة.

5. الألكلة وTrypsinization

  1. إضافة 50 ميكرولتر من 100 ملي NH 4 HCO 3 و 10 ميكرولتر من CH 3 CN، و 2 ميكرولتر من dithiothreitol إلى الخليط (112 ميكرولتر اجمالى حجم).
  2. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 56 درجة مئوية.
  3. وضع العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من 333 ملي iodoacetamide إلى العينة واحتضان في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  5. إضافة 10 ميكرولتر من التربسين (33 نانوغرام / ميكرولتر) إلى الخليط، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.

معشوقة = "jove_title"> 6. LC-MS / MS تحليل

  1. وبعد trypsinization بين عشية وضحاها، نقل المنتج النهائي إلى MS-LC مرفق / MS أو لطرف ثالث مختبر قياس الطيف الكتلي لتحليل 12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

حددنا إشارة قوية ARIP4، حوالي 160 كيلو دالتون، فضلا عن تلك التي تحكم عينة وهمية وعدة بروتينات أخرى غير معروفة (الشكل 1). التحليل الذي LC-MS / MS كل من الببتيدات المعقدة ARIP4 والعوامل المساعدة الببتيد المحتملة داخل جزء من الخرز FLAG (الجدول 1). P62 ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

ترنسفكأيشن كفاءة ضروري للحصول على نتيجة ناجحة مع هذا البروتوكول. وفقا لذلك، فإننا نوصي باستخدام تحليل لطخة غربية لتحديد مستويات البروتين FLAG الموسومة immunoprecipitated. هذه الخطوة تمكن المستخدمين من التحقق من أن البروتين اهتمامهم هى overexpressed بشكل صحيح، وعلاوة على ذلك، أن الم...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This study was supported by the Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders (HT), the Takeda Science Foundation (HT), and by a Japan Society for the Promotion of Science Grants-in-Aid for Young Scientists (B) to HT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentThermo Fisher Scientific11668019
Protease Inhibitor Cocktail (EDTA free) (100x)nacalai tesque03969-21
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220
Micro Bio-Spin ColumnsBIO-RAD732-6204

References

  1. De Las Rivas, J., Fontanillo, C. Protein-protein interactions essentials: key concepts to building and analyzing interactome networks. PLoS Comput.Biol. 6 (6), e1000807(2010).
  2. Westermarck, J., Ivaska, J., Corthals, G. L. Identification of protein interactions involved in cellular signaling. Mol.Cell.Proteomics. 12 (7), 1752-1763 (2013).
  3. MacPherson, R. E., Ramos, S. V., Vandenboom, R., Roy, B. D., Peters, S. J. Skeletal muscle PLIN proteins, ATGL and CGI-58, interactions at rest and following stimulated contraction. Am.J.Physiol.Regul.Integr.Comp.Physiol. 304 (8), 644-650 (2013).
  4. Qin, K., Dong, C., Wu, G., Lambert, N. A. Inactive-state preassembly of G(q)-coupled receptors and G(q) heterotrimers. Nat.Chem.Biol. 7 (10), 740-747 (2011).
  5. Ogawa, H., Ishiguro, K., Gaubatz, S., Livingston, D. M., Nakatani, Y. A complex with chromatin modifiers that occupies E2F- and Myc-responsive genes in G0 cells. Science. 296 (5570), 1132-1136 (2002).
  6. Shi, Y., et al. Coordinated histone modifications mediated by a CtBP co-repressor complex. Nature. 422 (6933), 735-738 (2003).
  7. Huh, K. W., DeMasi, J., Ogawa, H., Nakatani, Y., Howley, P. M., Munger, K. Association of the human papillomavirus type 16 E7 oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 102 (32), 11492-11497 (2005).
  8. Huang, B. X., Kim, H. Y. Effective identification of Akt interacting proteins by two-step chemical crosslinking, co-immunoprecipitation and mass spectrometry. PLoS One. 8 (4), 61430(2013).
  9. ten Have, S., Boulon, S., Ahmad, Y., Lamond, A. I. Mass spectrometry-based immuno-precipitation proteomics - the user's guide. Proteomics. 11 (6), 1153-1159 (2011).
  10. Ogawa, H., Komatsu, T., Hiraoka, Y., Morohashi, K. Transcriptional Suppression by Transient Recruitment of ARIP4 to Sumoylated nuclear receptor Ad4BP/SF-1. Mol.Biol.Cell. 20 (19), 4235-4245 (2009).
  11. Tsuchiya, M., et al. Selective autophagic receptor p62 regulates the abundance of transcriptional coregulator ARIP4 during nutrient starvation. Sci.Rep. 5, 14498(2015).
  12. Watanabe, T., Matsuo, I., Maruyama, J., Kitamoto, K., Ito, Y. Identification and characterization of an intracellular lectin, calnexin, from Aspergillus oryzae using N-glycan-conjugated beads. Biosci.Biotechnol.Biochem. 71 (11), 2688-2696 (2007).
  13. Sitz, J. H., Tigges, M., Baumgartel, K., Khaspekov, L. G., Lutz, B. Dyrk1A potentiates steroid hormone-induced transcription via the chromatin remodeling factor Arip4. Mol.Cell.Biol. 24 (13), 5821-5834 (2004).
  14. Mohammed, H., Taylor, C., Brown, G. D., Papachristou, E. K., Carroll, J. S., D'Santos, C. S. Rapid immunoprecipitation mass spectrometry of endogenous proteins (RIME) for analysis of chromatin complexes. Nat.Protoc. 11 (2), 316-326 (2016).
  15. Fonslow, B. R., Yates, J. R. Capillary electrophoresis applied to proteomic analysis. J.Sep.Sci. 32 (8), 1175-1188 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

119 LC MS MS

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved