JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول جيل من الفئران أورام المثانة مثلي في الإناث C57BL / 6J الفئران ورصد نمو الورم.

Abstract

يصف هذا البروتوكول توليد أورام المثانة لدى الفئران C57BL / 6J الإناث باستخدام الفئران خط خلية سرطان المثانة MB49، الذي تم تعديله لإفراز البروستاتا البشرية محددة مستضد (PSA)، وإجراءات التأكد من زرع الورم. باختصار، يتم تخدير الفئران باستخدام المخدرات عن طريق الحقن ومصنوعة لوضع في موقف الظهرية. وأخلى البول من المثانة و 50 ميكرولتر من بولي-L-ليسين (PLL) وتغرس ببطء بمعدل 10 ميكرولتر / 20 ق باستخدام القسطرة 24 G الرابع. فإنه لا يتبقى في المثانة لمدة 20 دقيقة قبل stoppering القسطرة. تتم إزالة القسطرة وجلت PLL بواسطة ضغط لطيف على المثانة. ويعقب ذلك تقطير خط خلية سرطان المثانة الفئران (1 × 10 5 خلية / 50 ميكرولتر) بمعدل 10 ميكرولتر / 20 ق. ومقفول القسطرة لمنع إخلاء سابق لأوانه. بعد 1 ساعة، وإحياء الفئران بعقار انعكاس، وأخلت المثانة. معدل تقطير بطيء مهم،كما أنه يقلل من الجزر المثاني الحالبي، والتي يمكن أن تسبب الأورام تحدث في المسالك البولية العلوي وفي الكلى. خط الخلية يجب أيضا إعادة وقف التنفيذ للحد من التثاقل من الخلايا، وهذا يمكن أن يؤدي إلى أحجام الأورام متفاوتة بعد الزرع.

هذه التقنية تحرض الأورام بكفاءة عالية. ويتم رصد نمو الورم عن طريق إفراز دعم البرامج والإدارة البولية. مراقبة PSA علامة هو أكثر موثوقية من الموجات فوق الصوتية أو التصوير مضان للكشف عن وجود أورام في المثانة. الأورام في الفئران تصل عموما حجم أقصى يؤثر سلبا على الصحة بنحو 3-4 أسابيع إذا تركت دون علاج. من خلال رصد نمو الورم، فمن الممكن أن نفرق الفئران التي تم علاجها من تلك التي لم تزرع بنجاح مع الأورام. مع تحليل نقطة النهاية الوحيد، وهذا الأخير يمكن افتراض خاطئ قد تم علاجه عن طريق العلاج.

Introduction

والهدف من هذه الطريقة هو توليد أورام المثانة مثلي الفئران ورصد الأورام مزروع بأكبر قدر ممكن، حتى لا يعتقد أن الفئران دون زرع الورم قد تم علاجه في تحليل نقطة النهاية. وعموما، فإن طريقة أظهرت سوف يقلل من الحاجة لأعداد كبيرة من الفئران لتحليل تجريبي وضمان المزيد من الدقة في تحديد النتائج العلاجية.

تطوير نموذج مثلي لسرطان مهمة، كما زرع خلايا الورم تحت الجلد لا ألخص البيئة من المرض السريري أو تمكين وضع استراتيجيات علاجية. بنية المثانة يسمح للتقطير من علاجات سرطان المثانة مباشرة في المثانة مع تأثيرات جهازية الحد الأدنى. وبالتالي، نماذج حيوانية أن ألخص هذه البيئة، مثل نموذج مثلي، هي مهمة لتقييم علاجات جديدة. وdependen الاستنتاجات المستخلصة من أي انشاء التجريبيةر على القيود المفروضة على النموذج.

وقد تم تطوير العديد من التقنيات لإنتاج أورام المثانة مثلي في الفئران. هذه تعتمد على إتلاف طبقة جلايكان المثانة، مما يتيح الخلايا السرطانية ليكون مزروع. وتشمل التقنيات المستخدمة كهربي، مما يؤدي الى نقطة واحدة من الضرر في جدار المثانة، مما يؤدي إلى نمو الورم في موقع واحد في المثانة 1،2. ومع ذلك، فإن نسبة نجاح زرع الورم باستخدام كهربي يعتمد مشغل متفاوتة 10-90٪، ويشمل الخطر الذي جدار المثانة سيتم ثقب، مما يؤدي إلى أورام النامية في التجويف البريتوني. يتم تنفيذ الكي الكيميائي باستخدام نترات الفضة، الامر الذي يسيء الى جدار المثانة 3. وبالمثل، وقد استخدم حمض إلى تلف جدار المثانة 4. كما تم استخدام التربسين إلى تلف المثانة وكذلك 5. قد ينتج عن هذه الأساليب في تطوير الورم أكثر من واحد في المثانة.وعلاوة على ذلك، هناك خطر حدوث أضرار بالغة في المثانة إذا ترك المواد الكيميائية في اتصال مع جدار المثانة لفترة طويلة جدا. الطريقة التي وضعتها Ninalga وآخرون. يستخدم موجبة بولي-L-ليسين (PLL) 6 الجزيئات إلى طبقة جدار المثانة. وهذا يتيح لخلايا الورم المشحونة سلبا على التمسك طبقة جلايكان المثانة. هذه الطريقة عموما النتائج في الورم أكثر من واحد النامية في المثانة، ولكن الورم غرس هو في 80-100٪ 4،7. من الناحية الفنية، بل هو أيضا أسهل طريقة لأداء. لضمان أن الأورام التي تنشأ هي إلى حد ما حتى في الحجم، من المهم أن الخلايا السرطانية لا تجميعها في كتل كبيرة قبل الزرع.

من أجل تقييم فعالية العلاج، فمن الأفضل لأداء هذه الدراسة على الفئران بأورام مماثلة الحجم إلى حد ما. وهكذا، فإن نظام الكشف الجيدة التي يمكن قياس حجم الورم قريبا بعد زرع مهم. العديد من الاستراتيجيات لها النحلن المستخدمة لتقييم الأورام. وتشمل هذه التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) 10/08، مضان 11، تلألؤ بيولوجي 12،13، الموجات فوق الصوتية 14، وانزيم مرتبط المناعي فحص (ELISA) 15،16. بينما التصوير بالرنين المغناطيسي والموجات فوق الصوتية لا تتطلب إدخال تعديلات على الخلايا السرطانية، وهناك حاجة إلى معدات والتباين وكلاء حساسة للتصوير بالرنين المغناطيسي. تتطلب فحوصات fluorescence-، luminescence-، واستنادا ELISA-تعديل الخلايا السرطانية للتعبير عن البروتينات علامة التي يمكن الكشف عنها من قبل هذه الأساليب. لالتلألؤ، مطلوب ركيزة للكشف عن luciferase النشاط. وبالتالي، هناك خطوة إضافية وزيادة تكلفة. كل من التألق ومضان يتطلب معدات متخصصة. لإنتاج مضان، الأخضر بروتين فلوري (GFP) cyclization، الذي يحفزه الأكسجين الجزيئي، مطلوب. وبالتالي، قد يكون التعبير GFP متغير داخل كتلة الورم اعتمادا على الحصول على الأكسجين، مما يجعل هذا علامة لا يمكن الاعتماد عليها بدلا 17. تعديل الفئران خط خلية سرطان المثانة MB49 لإفراز البروستاتا البشرية مستضد النوعي (PSA) 15،16 كمؤشر بديل هو استراتيجية أخرى. كما توفر هذه العلامات وسيلة بديلة لتأكيد وجود ورم في إنهاء التجربة، مما يجعلها بديلا لالمناعية. تعرض هذه الدراسة المنهج PLL زرع ورم مثلي وتقدم مقارنة بين أنظمة الكشف عن الورم، وهي ELISA، مضان، والتصوير بالموجات فوق الصوتية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

كل عمل الحيوان انضمت إلى لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC) مبادئ توجيهية بشأن استخدام الحيواني ويعالج (عدد بروتوكول 084/12) في جامعة سنغافورة الوطنية.

1. تزايد الخلايا MB49-PSA في المختبر وقياس PSA إفراز

  1. الحفاظ على الفئران بسرطان المثانة خلايا MB49-PSA 15 في كامل Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 2 ملمول / لتر L-الجلوتامين، و 0.05 ملغ / مل البنسلين، الستربتوميسين في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. إضافة 200 ميكروغرام / مل هيغروميسين B للحفاظ على ضغط اختيار الخلايا المفرزة للدعم البرامج والإدارة.
  2. لتحديد إفراز دعم البرامج والإدارة، لوحة 1 × 10 6 خلايا في طبق ثقافة 6 جيدا واحتضان ذلك عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة.
  3. بعد ذلك بيومين، وجمع طاف لقياس PSA.
    1. باستخدام ماصة باستور، ونقل سوبernatant إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
    2. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 250 x ج لإزالة الخلايا العائمة والحطام. إذا تم تنفيذ فحص PSA خارج في يوم آخر، وتخزين طاف في - 30 درجة مئوية في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. إذا لم يكن كذلك، انتقل إلى الخطوة التالية مباشرة.
    3. تحديد تركيز PSA باستخدام PSA خالية من الإنسان ELISA عدة 7.
  4. تعداد الخلايا مطلي.
    1. باستخدام ماصة باستور، وغسل الخلايا برفق مع 1 مل من DMEM. نضح تماما وإزالة وسائل الإعلام.
    2. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام الجديدة وكشط بلطف مع مكشطة الخلية لإزاحة الخلايا من البئر.
    3. نقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge وإعادة تعليق عليها بدقة لضمان تعليق وحيدة الخلية.
    4. خلط كميات متساوية من تعليق الخلية وحل التريبان الأزرق 0.4٪. عد الخلايا الحية (التي لا تأخذ الصبغة) باستخدام عدادة الكريات.
  5. حساب التعبير دعم البرامج والإدارة نانوغراممن PSA / مل من وسائل الاعلام / 10 6 خلايا. التعبير PSA الخلايا MB49-PSA لزرع في الفئران هو 80-120 نانوغرام / مل / 10 6 خلايا.

2. تحديد حساسية القياسات PSA بواسطة ELISA وفي الوقت الحقيقي تحليل PCR

  1. لوحة الخلايا MB49-PSA في وسائل الاعلام DMEM كاملة في لوحة الثقافة 6 جيدا مع كميات مختلفة من الخلايا MB49 الأبوية مثل أن هناك حد أقصى قدره 1 × 10 6 خلايا لكل بئر (أي 10 0، 10 1، 10 2، 10 3، 10 4، 10 5، أو 10 6 خلايا MB49-PSA يتم تربيتها مع 10 6، 10 5، 10 4، 10 3، 10 2، 10 1، أو 10 0 MB49 الخلايا، على التوالي).
  2. في وقت لاحق يوم واحد، وجمع طاف لقياس PSA، كما هو موضح في الخطوة 1.3. تحديد تركيز PSA باستخدام PSA خالية من الإنسان ELISA عدة 7.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا.
    1. ليزالخلايا مباشرة في لوحة بإضافة 1 مل من استخراج الحمض النووي الريبي كاشف.
    2. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ونقل المحللة الخلية إلى أنبوب microcentrifuge. إضافة 0.2 مل من الكلوروفورم ودوامة العينات بقوة لمدة 15 ثانية. احتضان لهم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. الطرد المركزي العينات في 12000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. نقل بعناية المرحلة المائية العليا (0.5 مل) إلى أنبوب جديد دون إزعاج البيني.
    4. إضافة 0.5 مل من الكحول الآيزوبروبيل. احتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي العينات في 12000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. إزالة طاف تماما، من دون إزعاج راسب الحمض النووي الريبي في الجزء السفلي من الأنبوب.
    5. يغسل بيليه مرة واحدة مع 1 مل من الايثانول 75٪. أجهزة الطرد المركزي في 7500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة جميع الايثانول والسماح بيليه الهواء الجاف لمدة 10 دقيقة.
    6. حل الحمض النووي الريبي في 30 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه. احتضان لمدة 5 دقائق عند 60 درجة مئوية لزيادة ذلكlubility.
    7. Quantitate الحمض النووي الريبي عن طريق قياس الامتصاصية باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (UV) الطيفي في 260 نانومتر (A260). لتقييم RNA النقاء، وقياس الامتصاصية في 280 نانومتر (A280) وحساب نسبة A260 / A280 التي يجب أن يكون فوق 1.6.
  4. عكس نسخ كدنا] من 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي.
    1. تحضير خليط التفاعل على الجليد وتحويلها إلى 0.2 مل أنابيب.
    2. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الأنابيب تدور أسفل محتويات والقضاء على فقاعات الهواء.
    3. تحميل الأنابيب في cycler الحرارية وتنفيذ النسخ العكسي في الحالات التالية: 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية تليها 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية. وبمجرد الانتهاء من تشغيل، والحفاظ على عينات كدنا] في 4 درجات مئوية.
    4. تخزين العينات في - 30 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
  5. إجراء تحليل PCR في الوقت الحقيقي لدعم البرامج والإدارة وهيولي الأكتين بيتا. يستخدم الأكتين بيتا لتطبيع عينات. إجراء الفحص على 100 نانوغرام من الحمض النووي الريبي كتب الاتجاه المعاكس في جيش التحرير الشعبى الصينى 96-جيداالشركة المصرية للاتصالات. مقايسة جميع العينات في ثلاث نسخ. أداء 40 دورة مع المعلمات التالية: 2 دقيقة عند 50 درجة مئوية، و 10 دقيقة في 95 ° C، 15 ثانية في 95 درجة مئوية لمدة تمسخ، و1 دقيقة في 60 درجة مئوية. تعيين أدنى حد من الكشف على عتبة دورة (CT) من 35؛ وبالتالي، فإن أي عينة مع قيمة CT وراء 35 يعتبر لا يمكن كشفها.

3. الحفاظ على Tumorigenicity من الخط خلية MB49-PSA

ملاحظة: لفترة طويلة النمو في المختبر يؤدي إلى فقدان tumorigenicity. للحفاظ على tumorigenicity، وpassaged خط الخلية MB49-PSA عن طريق الماوس الأقل مرة واحدة في كل سنة 2.

  1. الخلايا.
    1. حصاد أضعافا مضاعفة تزايد الخلايا عن طريق كشط لهم بلطف مع مكشطة الخلية معقمة. خلط كميات متساوية من تعليق الخلية وحل التريبان الأزرق 0.4٪. عد الخلايا الحية باستخدام عدادة الكريات. لا زرع إذا كان أكثر من 20٪ من الخلايا الميتة.
    2. حساب كمية الخلايا الحية المطلوبة (1 × 107 خلية / مل) ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. إعادة تعليق بيليه خلية في DMEM سائط فارغة. تكرار غسل ثلاث مرات لإزالة كل آثار FBS قبل الزرع.
    3. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد حتى الفئران جاهزة للزرع.
  2. زرع خلايا ورم تحت الجلد في الفئران على الجهة الظهرية.
    1. تخدير الماوس C57BL6 / J البالغ من العمر 6 أسابيع-4- لاستخدام خليط من الكيتامين التخدير وmedetomidine (75 ملغ / كغ و 1 ملغم / كغم، على التوالي)، حقن داخل الصفاق عند 0.1 مل لكل 10 غرام من وزن الجسم.
    2. حلق الجهة اليمنى لفضح الجلد.
    3. باستخدام زوج من الملقط، ورفع الجلد لفصلها عن العضلات الأساسية وحقن 0.1 مل من تعليق خلية (1 × 10 6 خلايا) تحت الجلد بإبرة 24 G. في حين إزالة الإبرة، قرصة موقع الحقن لمدة 5 إلى 10 ثانية بحيث الخلايا السرطانية تفعللا يتسرب من موقع الحقن.
    4. احياء الفأر مع الحقن تحت الجلد من atipamezole (1 ملغ / كلغ) في 0.1 مل لكل 10 غرام من وزن الجسم.
  3. مراقبة نمو الورم كل يومين عن طريق قياس قطر الورم باستخدام الفرجار. يتم حساب حجم الورم باستخدام الصيغة ت = (أ ب 2) / 2، حيث "أ" هو أطول البعد و "ب" هو عرض عمودي، سواء في ملم.
  4. عندما يكون حجم الورم لا يقل عن 50 مم 3 (حوالي 7 أيام)، الموت ببطء الفأر مع CO 2. استئصال كتلة الورم مع زوج من ملقط معقم والمقص تحت ظروف معقمة ومكان في DMEM.
  5. في لوحة الثقافة 6 جيدا، تخطر على الورم إلى أجزاء صغيرة باستخدام المشارط معقمة. استخدام حقنة 1 مل الغطاس بأنه "مدقة" لمواصلة تفصيل الورم.
  6. إضافة 3 مل من اكتمال DMEM والحفاظ على الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  7. مرة واحدة تلتصق الخلايا إلى بلاته (بين يوم ويومين)، وإزالة وسائل الإعلام، والحطام، والخلايا غير ملتصقة بواسطة الشفط بلطف مع ماصة باستير العقيمة. يغسل مرتين مع DMEM. الحرص على عدم تعكير صفو الخلايا.
  8. إضافة 1 مل من DMEM وحصاد الخلايا عن طريق كشط لهم مكشطة الخلية. لتحديد وتوسيع المستعمرات واحد، عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ولوحة 1 خلية لكل بئر في لوحة الثقافة 96 أيضا. ثقافة الخلايا في DMEM مع 200 ميكروغرام / مل هيغروميسين B عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  9. تغيير وسائل الإعلام والمضادات الحيوية كل 4-5 أيام. مراقبة الخلايا حتى تكون في حوالي 80-90٪ متموجة. إعادة لوحة الخلايا على لوحة الثقافة 24 بشكل جيد من قبل pipetting لطرد الخلايا من البئر.
  10. مرة واحدة الخلايا في لوحة الثقافة 24-جيدا متموجة، إزاحتهم عن طريق كشط مع مكشطة الخلية ولوحة منها في لوحة الثقافة 6 جيدا.
  11. فحص الحيوانات المستنسخة مختلفة لإفراز دعم البرامج والإدارة، كما هو موضح في الخطوة 1. كرو-الحفاظ على استنساخ مع أعلى PSA سراأيون واستخدامه لاجراء تجارب الماوس في المستقبل.

4. غرس ورم

ملاحظة: يتم زرع كل الفأر مع 1 × 10 5 خلايا MB49-PSA في 50 ميكرولتر من DMEM وسائل الإعلام فارغة في المثانة. ويرجع ذلك إلى الفضاء الميت في القسطرة، دائما إعداد حجم إضافي (لا يقل عن 100 ميكرولتر إضافية في الماوس). وثمة نهج بديل يتمثل في استخدام حقنة مليئة بالهواء كما وصفها قاسمان وآخرون. 5 بدلا من حقنة مليئة.

  1. الخلايا.
    1. قبل يوم واحد زرع، عندما الخلايا ما يقرب من 80٪ متموجة، والمرور على الخلايا السرطانية MB49-PSA في وسائل الاعلام DMEM كاملة (تستكمل مع FBS 10٪، 2 ملمول / لتر L-الجلوتامين، 0.05 ملغ / مل البنسلين، الستربتوميسين، و 200 ميكروغرام / مل هيغروميسين B) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في نسبة الانقسام من 1: 2.
    2. في يوم من الإجراء، حصاد الخلايا عن طريق كشط لهم بلطف مع مكشطة الخلية معقمة. خلط كميات متساوية من تعليق الخلية و0.4٪ التريبان حل الأزرق. عد الخلايا الحية باستخدام عدادة الكريات. لا زرع إذا كان أكثر من 20٪ من الخلايا الميتة.
    3. حساب كمية الخلايا الحية المطلوبة (2 × 10 6 خلية / مل) ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف. إعادة تعليق بيليه خلية في DMEM سائط فارغة. تكرار غسل ثلاث مرات لإزالة كل آثار FBS قبل الزرع.
    4. الحفاظ على تعليق خلية على الجليد حتى الفئران جاهزة للزرع.
  2. السماح للالبالغ من العمر 6 أسابيع-4- إلى الإناث C57BL / 6J الفئران لتأقلم لمدة أسبوع واحد قبل الإجراء. يجب أن يتم تنفيذ جميع الأعمال الحيوان في خزانة السلامة البيولوجية للحفاظ على ظروف معقمة.
    1. وزن كل فأر وحقن تخدير (75 ملغ / كغ من الكيتامين و 1 ملغ / كغ medetomidine) البريتونى عند 0.1 مل لكل 10 غرام من وزن الجسم. وينبغي أن يكون Bodyweights بين 17 و 22 ز. تأكيد التخدير عن طريق ملاحظة أي RESPONSE بعد قليل أخمص قدميه.
    2. لتحديد الهوية، بمناسبة الأذن باستخدام لكمة الأذن.
    3. حقن هارتمان حل أو الصوديوم مركب اللاكتات البريتونى عند 0.1 مل لكل 10 غرام من وزن الجسم كل 1-2 ساعة لترطيب.
    4. تطبيق مرهم معقم لكلتا العينين باستخدام لمبة القطن المعقم، منذ يتم فقدان المنعكس امض تحت التخدير وعيون تجف. تطبيق عند الضرورة.
    5. وضع الفئران في موقف ضعيف على مناشف ورقية على رأس حزمة الحرارة (تفعيلها من خلال ملامسة الهواء) للحفاظ على درجة حرارة الجسم والشريط رجليه الخلفيتين إلى أسفل.
  3. مع إصبع، وتطبيق ضغط لطيف على منطقة أسفل البطن وجمع البول من المثانة إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. تخدم هذه العينة حيث بلغت قيمة القاعدية من PSA البولية.
  4. سحب عقيمة بولي-L-ليسين (PLL) في حقنة 1 مل ونعلق 24 عيار الرابع القسطرة، مع مرود إبرة إزالة. تطبيق مواد التشحيم لغيض من القسطرة ووظائفERT القسطرة عن طريق مجرى البول إلى المثانة باستخدام ملقط لتوجيه القسطرة. توقف عندما يشعر المقاومة. ملاحظة: يجب على الباحثين يناقش مع الموظفين البيطريين إزاء الحاجة إلى استخدام هلام التشحيم مع مخدر لinstillations داخل المثانة واستخدام المسكنات بعد العملية.
  5. غرس 50 ميكرولتر من PLL ببطء، بمعدل 10 ميكرولتر كل 20 ثانية، لتجنب المثاني الحالبي-الجزر 18. ترك القسطرة في المثانة لمدة 20 دقيقة مع سدادة لمنع خروج التدفق.
  6. بعد 20 دقيقة، وإزالة القسطرة وإخلاء المثانة من أي مضمون عن طريق الضغط بلطف على منطقة البطن السفلية. باستخدام فارغة 1 مل حقنة، طرد أي محتويات المتبقية من القسطرة.
  7. مزيج خلايا MB49-PSA بدقة من قبل pipetting وسحبها إلى حقنة 1 مل. إرفاق القسطرة وتطبيق مواد التشحيم. غرس 50 ميكرولتر من 1 × 10 5 خلايا بمعدل بطيء من 10 ميكرولتر كل 20 ثانية. استبدال سدادة علىالقسطرة. إعطاء السيطرة على الفئران 50 ميكرولتر من المياه المالحة.
  8. بعد 1 ساعة، وإزالة القسطرة وإخلاء المثانة من أي مضمون. إزالة الشريط على رجليه الخلفيتين ووضع الفئران على جنوبهم البطنية. إحياء الفئران عن طريق تحت الجلد حقن المخدرات انعكاس (1 ملغ / كغ atipamezole) في 0.1 مل لكل 10 غرام من وزن الجسم.
  9. مراقبة الفئران حتى لوحظ الحركة. عودة الفئران إلى أقفاصها.
  10. وعند الانتهاء من بروتوكول اكتشاف الورم (أقسام 5، 7، أو 8)، الموت ببطء الفئران باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2. يوصف بعد الوفاة كشف ورم في القسم 6.

5. رصد الورم النمو مع إليسا

ملاحظة: يتم رصد وجود ورم والنمو في الفئران عن طريق قياس إفراز PSA في البول. يجب على الباحثين أن يتشاور مع الموظفين البيطريين على مراقبة صحة الحيوان والرفاه زرع بعد الورم والنهاية إنسانية.

  1. هناك طريقتان لجمع البول من الفئران.
    1. جمع البول خلال الليل عن طريق وضع الماوس واحد في قفص الأيض الفردية المصممة لفصل البول من المواد البرازية. إذا لم يكن لديك انشاء التبريد، إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني (100 ميكرولتر) في أنبوب جمع البول لمنع تدهور PSA بين عشية وضحاها. ومع ذلك، فإن عدد من أقفاص التمثيل الغذائي المتاحة يحد من فائدة هذه الطريقة في جمع البول.
    2. حيث أنه من المستحيل لوجستيا لاستخدام أقفاص الأيض (مثل في غرف ABSL2)، وجمع بقعة البول باستخدام الإصبع للضغط لطيف على منطقة البطن السفلية بينما يتم تخدير الفئران كما هو موضح في الخطوة 4.2.1. وعادة ما يتم ذلك من قبل وتغرس العلاج. من تجربتنا، لا يقل عن 150 ميكرولتر من البول يمكن جمعها 1 ساعة بعد التخدير.
  2. المكان على الفور البول التي جمعت على الجليد. قد يكون بيلة دموية مرئية من الأسبوع الثاني بعد زرع الورم. درجة عالية من عينات hemolyzed قد تؤثر على تحليل ELISA. لذلك، البوليجب أن توضع على الجليد ومعالجتها بسرعة بعد جمع.
  3. أنابيب الطرد المركزي البول في 6700 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لإزالة الخلايا أو الحطام.
  4. لتطبيع الفرق في كمية البول بين الفئران، قسامة البول في أنابيب جديدة وتخزينها في -30 درجة مئوية حتى إجراء تحليلات لدعم البرامج والإدارة باستخدام عدة ELISA 7 والكرياتينين باستخدام عدة فحص 7. على الرغم من أن الفئران التي لا تنتج دعم البرامج والإدارة، وهناك مستويات منخفضة من غير محددة ملزمة الكشف باستخدام ELISA. للحصول على عينات للنظر إيجابية، يجب تعيين العتبة قيم أكبر مما كانت عليه في الفئران العادية + 3 معيار الانحراف (SD) 15.

6. الكشف عن وجود ورم مع الوقت الحقيقي PCR

  1. في الإنهاء، تشريح تجويف البطن من الفأرة وتحديد المثانة. استئصال المثانة ووضعه في cryovial. تجميد فورا في النيتروجين السائل.
  2. استخراج الحمض النووي الريبي المجانسة الأنسجة في EXTR RNAعمل كاشف.
  3. أداء عكس النسخ في الوقت الحقيقي وتحليل PCR لدعم البرامج والإدارة، كما هو موضح أعلاه في القسم 2.

7. رصد الورم النمو مع الإسفار التصوير

  1. تسمية 1 × 10 7 خلايا MB49-PSA مع صبغة الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء القريبة 19.
  2. إعادة لوحة وحصاد الخلايا المسمى في أيام 4، 7، 11، 14، 18، و 21 للتحقق إذا كانت الخلايا تحتفظ سلامة ومضان بواسطة التدفق الخلوي 20.
  3. زرع خلايا المسمى MB49-PSA في قربة الفئران، كما هو موضح أعلاه في القسم 4.
  4. مراقبة نمو الورم باستخدام نظام التصوير مضان كل يومين.
  5. في يوم من التصوير، ووزن وتخدير الفئران باستخدام مزيج من الكيتامين التخدير وmedetomidine (75 ملغ / كغ و 1 ملغم / كغم، على التوالي)، حقن داخل الصفاق عند 0.1 مل لكل 10 غرام من وزن الجسم.
  6. حلق منطقة البطن لفضح الجلد.
  7. وضع الفئران في غرفة التصوير واكتسابصور من قربة باستخدام البرامج المقدمة مع نظام التصوير.
  8. إحياء الفئران عن طريق تحت الجلد حقن المخدرات انعكاس (1 ملغ / كغ atipamezole) في 0.1 مل لكل 10 غرام من وزن الجسم.

8. مراقبة الورم النمو مع ارتفاع وتيرة التصوير بالموجات فوق الصوتية

  1. الأورام زرع في الفئران، كما هو موضح أعلاه في القسم 4.
  2. كل يومين، ورصد نمو الورم باستخدام التصوير بالموجات فوق الصوتية.
  3. في يوم من التصوير، ووزن وتخدير الفئران باستخدام مزيج من الكيتامين التخدير وmedetomidine (75 ملغ / كغ و 1 ملغم / كغم، على التوالي)، حقن داخل الصفاق عند 0.1 مل لكل 10 غرام من وزن الجسم.
  4. حلق منطقة البطن لفضح الجلد.
  5. غرس 100 ميكرولتر من العقيمة 0.9٪ المالحة في المثانة باستخدام 24 عيار الرابع القسطرة. سوف المالحة انتفاخ المثانة وتحسين الرؤية أثناء التصوير بالموجات فوق الصوتية.
  6. ضع الماوس على منصة الموجات فوق الصوتية وتطبيق هلام موصل للترower البطن.
  7. خفض التحقيق يده على الجلد، والحصول على صور B-وضع المثانة على منصة التصوير 21.
  8. إحياء الفئران عن طريق تحت الجلد المخدرات عن طريق الحقن انعكاس (1 ملغ / كغ atipamezole) في 0.1 مل لكل 10 غرام من وزن الجسم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تم العثور على إفراز دعم البرامج والإدارة من خلايا MB49 أن تختلف مع وسائل الإعلام نمو. يزرع MB49-PSA في وسائل الاعلام DMEM لأن هذا يؤدي إلى زيادة إفراز PSA (الشكل 1A). من أجل تحديد حساسية دعم البرامج والإدارة وإليسا في الوقت الحقيقي PCR، وتباينت أعداد مخت...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية في البروتوكول هي 1) الحفاظ بنجاح tumorigenicity من خط الخلية. 2) ضمان إفراز دعم البرامج والإدارة للقياس قبل زرع الخلايا السرطانية في الفئران. 3) توليد تعليق خلية واحدة لزرع ذلك للحد من التباين في حجم الورم. و4) غرس الخلايا بمعدل بطيء لمنع المثاني الحالبي، ا?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MB49-PSA cellsN/AN/Aref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 mediaHyCloneSH30027.01 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mediaBiowestL0102
Fetal Bovine Serum (FBS) South AmericanBiowestS1810
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, PremiumBiowestS181B
Fetal Bovine Serum (FBS)HyCloneSH30088.03 
L-glutamineBiowestX0550
Penicillin-StreptomycinBiowestL0022
Hygromycin BInvitrogen10687-010
free PSA (Human) ELISA kitAbnovaKA0209
TRIzol Reagent for RNA extraction Ambion15596026
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase InhibitorApplied Biosystems4374967
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse ActbApplied Biosystems4331182Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3Applied Biosystems4331182Hs00426859_g1
C57BL/6J female miceIn Vivos4 - 6 wk old
Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine)Local pharmacy
Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole)Local pharmacy
Ear punchElectron Microscopy Sciences72893-01
Hartmann's solution or Compound sodium lactateB Braun
Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointmentAlcon
Heat pack - HotHands handwarmersHeatmax Inc
Introcan Certo IV catheterB Braun425130024 G x 3/4″
Aquagel Lubricating jellyLocal pharmacy
Poly-L-lysine solution, 0.01%,SigmaP4707
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche4693159001
Quantichrom Creatinine Assay KitBioAssay SystemsDICT-50 
Fluorescent dye - VivoTrack 680Perkin ElmerNEV12000 
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition SolutionAmbion4427575
NameCompanyCatalog numberComments
Equipment and Software
7500 Realtime PCR SystemApplied Biosystems
7500 Software v2.3Applied Biosystems
Metabolic CageTecniplast Vertical type rack for 12 cages
BD FACSCanto I system BD Biosciences
BD FACSDiva software v7BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system Caliper Life Sciences 
Living Image Software v3.1Caliper Life Sciences 
Vevo 2100 imaging system VisualSonics 

References

  1. Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
  2. Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  3. Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
  4. Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
  5. Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181(2013).
  6. Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
  7. Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684(2011).
  8. Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
  9. Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
  10. Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3(2016).
  11. Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
  12. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
  13. Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
  14. Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
  15. Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
  16. Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
  17. Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
  18. Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172(2012).
  19. Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075(2007).
  20. Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
  21. Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718(2015).
  22. Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
  23. Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
  24. Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
  25. Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
  26. Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
  27. Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
  28. Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
  29. Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

119

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved