JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تفاصيل هذه المقالة الفيديو مباشرة في منهجية الجسم الحي والتي يمكن استخدامها لمنهجية وكفاءة تميز مكونات مسارات الإشارات المعقدة وشبكات تنظيمية في العديد من الأجنة اللافقاريات.

Abstract

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

Introduction

شبكات الجينات التنظيمية (GRNs) وإشارة مسارات نقل تنشئ التعبير المكاني والزماني للجينات خلال التطور الجنيني التي تستخدم لبناء خطة الكبار جسم الحيوان. خلية الى خلية مسارات نقل الإشارة هي المكونات الأساسية لهذه الشبكات التنظيمية، وتوفير الوسائل التي تتواصل الخلايا. هذه التفاعلات الخلوية إنشاء وصقل التعبير عن الجينات التنظيمية والتمايز في ومن بين المناطق المختلفة خلال مرحلة التطور الجنيني 1 و 2. التفاعلات بين جهري يفرز خارج الخلية (بروابط، الخصوم)، المستقبلات، وشارك في مستقبلات السيطرة على أنشطة مسارات نقل الإشارة. مجموعة متنوعة من الجزيئات داخل الخلايا transduces هذه المدخلات مما أدى إلى التعبير المعدلة وراثيا، وتقسيم، و / أو شكل الخلية. في حين أن العديد من الجزيئات الأساسية المستخدمة على الصعيدين خارج الخلية والخلايا في مسارات رئيسية هيالمعروف، وهو المعرفة غير مكتملة بسبب في جزء كبير منه إلى تعقيد مسارات الإشارات الفردية. وبالإضافة إلى ذلك، مسارات الإشارات المختلفة غالبا ما تتفاعل مع بعضها البعض إما سلبا أو إيجابا في الخلية، داخل الخلايا، ومستويات النسخي 3، 4، 5، 6. الأهم من ذلك أن المكونات الأساسية لمسارات نقل الإشارة والحفظ جدا في جميع الأنواع metazoan، وبشكل ملحوظ، فإن معظم مسارات الإشارات الرئيسية غالبا ما تؤدي وظائف تنموية مماثلة في العديد من الأنواع عند المقارنة بين الكائنات الحية من من الكائنات الحية ذات صلة وثيقة على وجه الخصوص 7، 8، 9، 10، 11.

دراسة يشير خلال التنمية هي مهمة شاقة في أي كائن حي، وهناكهي عدة تحديات كبيرة لدراسة مسارات إشارات في معظم النماذج ثنائي الفم (الفقاريات، حبليات اللافقارية، نصف حبليات، وشوكيات الجلد): 1) في الفقاريات هناك أعداد كبيرة من الممكن يجند والتفاعلات مستقبلات / المشارك المغير، جزيئات تنبيغ الخلايا، وكذلك التفاعلات المحتملة بين مسارات الإشارات المختلفة نظرا لتعقيد للجينوم 12، 13، 14؛ 2) مورفولوجيا معقدة والحركات التخلق في الفقاريات غالبا ما تجعل الأمر أكثر صعوبة لتفسير التفاعلات الوظيفية في وبين مسارات نقل الإشارة. 3) تحليل في معظم الأنواع اللافقارية نموذج ثنائي الفم غير شوكي-تقتصر من قبل ويندوز قصيرة من الحمول باستثناء بعض الأنواع الغلالة 15 و 16.

القنفذ البحر الجنين لديها عدد قليل من القيود المذكورة أعلاه ويقدم العديد من المزايا الفريدة لإجراء تحليل مفصل لمسارات نقل الإشارة في الجسم الحي. وتتضمن ما يلي: 1) البساطة النسبية للجينوم قنفذ البحر يقلل بشكل ملحوظ من عدد ممكن يجند، مستقبلات / مستقبل مساعد والخلايا جزيء التنبيغ التفاعلات 17؛ 2) GRNs السيطرة على مواصفات والزخرفة من طبقات جرثومية ومحاور الجنينية الرئيسية هي راسخة في الأجنة قنفذ البحر، والمساعدة في فهم السياق التنظيمي للخلية / إقليم تلقي الإشارات 18، 19؛ 3) العديد من مسارات نقل إشارة يمكن دراستها بين مراحل الانقسام والمعيدة في وقت مبكر عندما تتكون الأجنة من ظهارة الطبقات واحدة التي التشكل هو أسهل لتحليل. 4) جزيئات تنطويد في مسارات إشارات في والتلاعب بها بسهولة قنافذ البحر. 5) وحامل العديد من قنافذ البحر لمدة 10 إلى 11 شهرا في السنة (على سبيل المثال Strongylocentrotus purpuratus وLytechinus variegatus).

هنا، فإننا نقدم وسيلة لتمييز منهجي وكفاءة مكونات مسارات الإشارات التي تحدد والأقاليم نمط في الأجنة قنفذ البحر لتوضيح المزايا التي توفرها العديد من الأنظمة نموذج اللافقارية في دراسة الآليات الجزيئية المعقدة.

Protocol

1. استراتيجية تصميم Morpholino إنتاجية عالية

  1. تحديد الجين (ق) من الفائدة (على سبيل المثال نهج الجين مرشح، تحليل رابطة الدول المستقلة التنظيمية، RNAseq و / أو شاشات التفاضلية البروتين).
  2. استخدام الجيني، transcriptomic، وبيانات التعبير الجيني متاح في المواقع التي يتم تحديثها باستمرار (على سبيل المثال SpBase http://www.echinobase.org 20 و S. purpuratus الجينوم البحث المتشعب: ///urchin.nidcr.nih.gov/blast/index هتمل) لتحديد أن ملامح التعبير الزمانية المكانية يتداخل مع آلية تنموية في السؤال. إذا لم يكن هناك بيانات التعبير متاح، ثم تولد التمهيدي QPCR و / أو العقاقير في التحقيق الموقع لتقييم نمط التعبير الجيني.
  3. بعد تحديد نمط التعبير المكاني والزماني، يجب الحصول على تسلسل الحمض النووي من المواقع على شبكة الإنترنت الجينوم.
    1. لتوليد أليغنوكليوتيد] morpholino حجب الترجمة، والحصول على تسلسل سو في "المنطقة تترجم الامم المتحدة (5 '5 UTR) المنبع مباشرة من كودون بدء من أعرب تسلسل العلامة (EST) قواعد البيانات المتاحة على SpBase أو S. purpuratus الجينوم مواقع البحث. إذا كانت هذه المعلومات غير متاحة لهذا الجين من الفائدة، ثم نفذ 5 "سباق.
    2. لتصميم morpholino حجب لصق، ابحث عن تسلسل الجيني بما في ذلك الإكسونات وإنترونات باستخدام أداة سقالة blastn في SpBase أو S. purpuratus الجينوم أداة البحث.
  4. استخدام الموقع النوكليوتيد تصميم http://oligodesign.gene-tools.com من أجل تصميم المطلوب 25 قاعدة تسلسل الزوج morpholino.
    1. لmorpholino حجب متعدية، استخدم تسلسل مرنا من 5 'إلى 3' كمصدر للتسلسل الهدف متعدية. تشمل تسلسل 5 'UTR (ما يقرب من 70 النيوكليوتيدات المنبع للموقع بداية النسخ)، بالإضافة إلى 25 قواعد الترميز المنطقة (المصب من موقع بداية) مع بداية كودون واي ملحوظقوسين ال (ATG).
    2. لmorpholino حجب لصق، حدد إنترون-إكسون أو تسلسل الحدود اكسون-إنترون وتشمل 50 قاعدة (25 قواعد تسلسل اكسون و 25 قواعد تسلسل إنترون) حول المناطق الحدودية. مسح الجينوم مع تسلسل morpholino للتحقق من أن تسلسل فريد من نوعه.

2. Microinjection من Morpholino أليغنوكليوتيد]

  1. إعداد 3 الحلول الأسهم ملم من أليغنوكليوتيد] morpholino بإضافة 100 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه في morpholino قارورة 300 نانومول.
    ملاحظة: لا تستخدم DEPC المياه المعالجة لإعادة تعليق لاثيل pyrocarbonate يمكن أن تلحق الضرر morpholino.
  2. لأول تدور إعادة أسفل القارورة التي تحتوي على محلول المخزون النوكليوتيد لمدة 30 ثانية بأقصى سرعة (14000 - 16000 x ج)، دوامة لفترة وجيزة، الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 5 إلى 10 دقائق، دوامة لفترة وجيزة، والحفاظ على المخزون morpholino في الغرفة درجة الحرارة لمدة 1 ساعة على الأقل. Morpholino حل الأوراق المالية يتم تخزين الصورة من -20 درجة مئوية إلى +4 درجة مئوية.
  3. يعد حل الحقن التي تحتوي على أليغنوكليوتيد] morpholino في التركيز المطلوب. يحتوي هذا الحل عادة 20٪ الجلسرين أو 125 ملي بوكل باعتبارها الناقل و 15٪ FITC-ديكستران (فلوريسئين ثيوسيانات ديكستران 10000 ميغاواط 2.5 ملغ / ميكرولتر حل الأسهم). تستخدم FITC-ديكستران وغيرها تقارن ديكستران الفلورسنت بشكل روتيني لتحديد الأجنة حقن المجهري epifluorescence. حلول حقن مخزن في -20 درجة مئوية.
  4. الحرارة الحل morpholino عند 65 درجة مئوية في كتلة الحرارة أو حمام مائي لمدة لا تقل عن 2 - 5 دقائق.
  5. تدور لفترة وجيزة الحل morpholino لمدة 30 ثانية بأقصى سرعة (14000 - 16000 x ج)، دوامة لمدة 1 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي بسرعة كاملة (14،000 - 16،000 x ج) لمدة 10 دقيقة على الأقل.
  6. تحميل إبر الحقن بمحلول morpholino. لبروتوكول حقن مكروي مفصل يرجى الاطلاع Stepicheva وكلمات 2014 21 وهتاف وEttensohn، 2004"> 22.

3. التثبيت وفي بروتوكول الموضعي في 24 ساعة بعد الإخصاب (HPF) في س purpuratus الأجنة

ملاحظة: يتم تعديل هذا البروتوكول من اريناس-مينا وآخرون. 2000 23 و سيتي وآخرون. 2014 (24).

  1. تثبيت
    1. إضافة عدة قطرات من تثبيتي (انظر أدناه) إلى الآبار التي تحتوي على أجنة، مزيج بلطف قبل pipetting، والسماح لهم لتسوية. إزالة الحل تثبيتي، ثم خلط الأجنة مع اثنين من يغسل 180 ميكرولتر إضافية من تثبيتي.
      ملاحظة: من المهم أن تخلط جيدا الأجنة خلال يغسل طيف من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات. يمكن عدم القيام بذلك تقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
    2. ترك الأجنة لإصلاح في غسل تثبيتي الثاني لمدة 50 دقيقة إلى 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة (RT) في 4٪ المجهر الإلكتروني الصف امتصاص العرق تتكون من 10 ملي اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 0.1٪ توين-20، والاصطناعية seawateص (مضادة للغواصات). جعل هذا الحل جديدة في كل مرة حصول على أفضل النتائج. وبالإضافة إلى ذلك، لسهولة والتطبيق العملي الأجنة يتم إصلاحها في لوحات 96-جيدا.
      1. لمدة 20 مل استخدام مثبت 5 مل 16٪ امتصاص العرق، 15 مل مضادة للغواصات، و 200 ميكرولتر 1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، و 20 ميكرولتر توين-20.
    3. يغسل 5 مرات في RT مع 180 ميكرولتر من اجتماعات الأطراف غسل عازلة مكونة من 0.1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 0.5 M كلوريد الصوديوم و 0.1٪ توين-20 لمدة 5 دقائق على الأقل أو حتى الأجنة ينخفض ​​إلى أسفل البئر. مرة أخرى، ومن المهم أن تخلط جيدا الأجنة في غسل العازلة التي pipetting بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات. غسل العازلة اجتماعات الأطراف يمكن أن تستخدم لمدة 2 أيام إذا تخزينها في 4 ° C.
      1. 40 مل اجتماعات الأطراف غسل استخدام عازلة 4 مل 1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 4 مل 5 M كلوريد الصوديوم، و 32 مل درهم 2 O، و 40 ميكرولتر توين-20.
      2. ويمكن تخزين الأجنة ثابتة عند 4 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
        ملاحظة: إذا تخزين الأجنة ثابتة لفترة أطول، ثم يضاف 0.2٪ أزيد الصوديوم في اجتماعات الأطراف غسل العازلة لمنع نمو البكتيريا.
  2. قبل التهجين
    1. نضح في اجتماعات الأطراف غسل العازلة وإضافة 180 ميكرولتر من نسبة 2: 1 من اجتماعات الأطراف غسل العازلة إلى عازلة التهجين، مزيج الأجنة في حل من قبل pipetting لطيف عدة مرات، واحتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT. يتكون عازلة تهجين من 70٪ الفورماميد، 0.1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 0.5 M كلوريد الصوديوم، 1 ملغ / مل BSA و 0.1٪ توين-20.
      1. 40 مل استخدام عازلة تهجين 4 مل 1 M اجتماعات الأطراف الرقم الهيدروجيني 7.0، 4 مل 5 M كلوريد الصوديوم، 4 مل O 2 درهم، 0.04 ز BSA، و 40 ميكرولتر توين-20. مزيج جيد من قبل vortexing، إضافة 28 مل الفورماميد، ودوامة مرة أخرى.
    2. إزالة نسبة 2: 1 من اجتماعات الأطراف غسل ومخازن التهجين وإضافة 180 ميكرولتر من نسبة 1: 2 من اجتماعات الأطراف غسل العازلة إلى عازلة التهجين، مزيج الأجنة في الحل، واحتضان لمدة 20 دقيقة على الأقل في RT.
    3. قبل التحقيق التهجين المزيج بلطف الأجنة في 100-150 ميكرولتر من العازلة التهجين. احتضان الأجنة عند 50 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1ح.
      ملاحظة: احتضان الأجنة بين عشية وضحاها غير مقبول. قبل تفرخ، وختم الآبار مع ورقة لاصقة من أجل منع التبخر.
  3. تهجين
    1. في أنبوب منفصل إضافة 0،1-0،3 نانوغرام / ميكرولتر من التحقيق و 500 ميكروغرام / مل الخميرة الحمض الريبي النووي النقال إلى عازلة تهجين، ثم دوامة بلطف لخلق حل التحقيق. يضاف الحمض الريبي النووي النقال الخميرة إلى حل التحقيق لخفض غير محددة ملزمة لجنة التحقيق لمكافحة الشعور. سخن هذا الحل إلى 50 درجة مئوية، والعازلة نضح التهجين.
    2. خلط الأجنة المهجنة مسبقا إلى 100 ميكرولتر من محلول التحقيق، وختم مع ورقة لاصقة، وهجن عند 50 درجة مئوية لمدة 2-7 أيام اعتمادا على التحقيق (التحقيق foxq2 يمكن المحتضنة لمدة 2 أيام).
      ملاحظة: سوف تختلف الأوقات الحضانة القائم قبالة التحقيق. بعض الجينات التي أعرب عنها في مستويات منخفضة تتطلب تصل إلى الحضانة لمدة 7 أيام. لوحات 96-جيدا يمكن وضعها في صندوق الرطوبة بمثابة تأمين ضد التبخر إذا كان ADHESفشلت ورقة إيف لختم صحيح.
    3. يغسل 5 مرات في 50 درجة مئوية مع 180 ميكرولتر من اجتماعات الأطراف تقدم طازجة غسل عازلة ليصبح المجموع 3 ساعات. ثم، ويغسل 3 مرات (15 دقيقة) مع 180 ميكرولتر من اجتماعات الأطراف غسل عازلة على RT. تذكر أن مزيج الأجنة في غسل العازلة في كل مرة من قبل pipetting بلطف عدة مرات.
  4. الأجسام المضادة الحضانة
    1. نضح في اجتماعات الأطراف غسل العازلة وخلط الأجنة في 180 ميكرولتر من عرقلة العازلة التي تتكون من 10٪ مصل الأغنام عادي و 5 ملغ / مل BSA في اجتماعات الأطراف غسل العازلة واحتضان لمدة 45 دقيقة على الأقل في RT أو 4 درجات مئوية خلال الليل.
    2. إزالة عازلة تمنع وثم خلط الأجنة في عرقلة العازلة التي تحتوي على التخفيف 1: 1500 من القلوية الأجسام المضادة الفوسفاتيز مترافق مكافحة digoxigenin المخفف في عرقلة العازلة. احتضان بين عشية وضحاها في RT في لوحة مغلقة لتجنب التبخر. ملاحظة: لا تترك الأجسام المضادة لفترة أطول من ليلة وضحاها.
    3. غسل الأجنة 6 مرات (5 دقائق أو حتى إسقاط الأجنة) في اجتماعات الأطراف غسل عازلة على RT. يمكن الأجنةخزنها بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  5. وفي تطور الموقعي
    1. غسل الأجنة 3 مرات (10 دقيقة) في RT مع تقدم طازجة عازلة درجة الحموضة 9.5 تتألف من 0.1 M تريس الرقم الهيدروجيني 9.5، 100 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي MgCl 2، 1 ملم الليفاميزول، و 0.1٪ توين-20.
      1. لمدة 20 مل درجة الحموضة استخدام 9.5 العازلة 2 مل 1 M تريس الرقم الهيدروجيني 9.5، 400 ميكرولتر 5M كلوريد الصوديوم، 1 مل 1 M MgCl 2 و 20 ميكرولتر توين-20، 16.6 مل درهم 2 O، و0.0048 ز الليفاميزول.
    2. احتضان الأجنة عند 37 درجة مئوية في المخزن تلطيخ محمية من الضوء. يتكون عازلة تلطيخ من 10٪ ثنائي ميثيل الفورماميد، 4.5 ميكرولتر / مل 4-نيترو نتروبلو الأزرق كلوريد (NBT)، و 3.5 ميكرولتر / مل 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl فوسفات (BCIP) في تقدم طازجة عازلة درجة الحموضة 9.5 .
      1. ل1 مل من العازلة تلطيخ استخدام 100 ميكرولتر ثنائي ميثيل الفورماميد، 4.5 ميكرولتر NBT، و 3.5 ميكرولتر BCIP.
    3. وقف رد فعل الفوسفاتيز القلوية عن طريق غسل 3-5 مرات في اجتماعات الأطراف غسل العازلة. واي رد فعلعشر التحقيق foxq2 وعادة ما يستغرق 30 دقيقة إلى 1 ساعة. قد يحتاج بعض تحقيقات الحضانة بين عشية وضحاها في أي RT أو 4 درجات مئوية.
    4. خلط الأجنة في حل 70٪ غسل المماسح و30٪ الجلسرين. يوفر الجلسرين معامل الانكسار اللازمة للفحص المجهري. الأجنة يمكن تخزينها في هذا الحل لعدة أسابيع. ختم لوحات مع البارافين البلاستيك لمنع التبخر.
  6. إعداد الشرائح والتقاط صورة
    1. إعداد الشرائح عن طريق ترتيب ثلاث شرائح صغيرة من الشريط على الوجهين في مثلث مع فجوات صغيرة بين الشرائط على شريحة.
    2. نقل الأجنة في غسل المماسح 70٪ و 30٪ الحل الجلسرين إلى مركز المثلث، وتغطي مع ساترة.
    3. ختم ساترة عن طريق تطبيق طبقة من طلاء الأظافر حول حواف ساترة.
    4. التقاط الصور باستخدام مجهر الضوء مركب مع هدف 20X وكاميرا مثبتة.

النتائج

في جنين قنفذ البحر أظهرنا أن 3 إشارات Wnt مختلف فروع (WNT / β-كاتينين، WNT / JNK، وWNT / بي كي سي) 4، 25 تفاعل لتشكيل شبكة الإشارات WNT الذي يحكم الأمامي الخلفي (ا ف ب) الزخرفة. إحدى النتائج الأكثر أهمية في هذه الأحداث يشير هو أن أعرب ع...

Discussion

منهجية المعروضة هنا هي مثال يوضح قوة باستخدام الأجنة مع أقل التعقيد الجيني والصرفي من الفقاريات لفهم مسارات الإشارات تنبيغ وGRNs التي تحكم آليات التنموية الأساسية .. العديد من المعامل تستخدم المقايسات مماثلة خلال تطوير قنفذ البحر في وقت مبكر لتشريح مسارات الإشارات ال...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Dr. Robert Angerer for his careful reading and editing of the manuscript. NIH R15HD088272-01 as well as the Office of Research and Development, and Department of Biological Sciences at Mississippi State University provided support for this project to RCR.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholinoGene Tools LLCCustomizedMore information at www.gene-tools.com
GlycerolInvitrogen15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate)Invitrogen, Life TechnologiesD1821Make 25 mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM GradeElectron Microscopy Sciences15710
MOPSSigma AldrichM1254-250G
Tween-20Sigma Aldrich23336-0010
FormamideSigma Aldrich47671-1L-F
Yeast tRNAInvitrogen15401-029
Normal Goat SerumSigma AldrichG9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibodyRoche11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole)Sigma AldrichL9756-5G
Tris Base UltraPureResearch Products Internationall Corp56-40-6
Sodium ChlorideFisher ScientificBP358-10
Magnesium chlorideSigma Aldrich7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphateRoche11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT)Roche11 383 213 001
Dimethyl FormamideSigma AldrichD4551-500mL
Potassium ChlorideSigma AldrichP9541-5KG
Sodium BicarbonateSigma AldrichS5761-500G
Magnesium SulfateSigma AldrichM7506-2KG
Calcium ChlorideSigma AldrichC1016-500G

References

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
  3. Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
  4. Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).
  5. Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
  6. Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
  7. Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
  8. Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
  9. Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
  10. Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
  11. Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434 (2015).
  12. Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
  13. Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
  14. Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
  15. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  16. Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
  17. Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
  19. Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).
  20. Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
  21. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).
  22. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
  23. Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
  24. Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
  25. Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).
  26. Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
  27. Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
  28. Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
  29. Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
  30. Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
  31. Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
  32. Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
  33. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
  34. Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).
  35. Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
  36. Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
  37. Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
  38. Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

120 WNT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved