JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم في الدراسة الحالية مقايسة على أساس مضان رواية باستخدام الخلايا الليمفاوية المستمدة من الفئران المحورة جينيا. هذا الاختبار هو مناسبة لفحص عالية الإنتاجية (HTS) من جزيئات صغيرة هبوا قدرة أي عرقلة أو تعزيز تنشيط الخلايا اللمفاوية.

Abstract

فحص عالية الإنتاجية (HTS) هو حاليا الدعامة الأساسية لتحديد الكيانات الكيميائية القادرة على تحوير التفاعلات الكيميائية الحيوية أو العمليات الخلوية. مع تقدم التكنولوجيا الحيوية والقدرة متعدية عالية من جزيئات صغيرة، تطورت عدد من الأساليب المبتكرة في اكتشاف المخدرات، وهو ما يفسر اهتمام طالبان في استخدام HTS. مجال علم الأورام ويعمل حاليا في مجال البحوث الأكثر نشاطا لفحص المخدرات، مع عدم وجود تقدم كبير جعل لتحديد المركبات المناعية جديدة تستهدف مضاعفات زرع أو أمراض المناعة الذاتية. هنا، نقدم رواية في المختبر الفئران أساس فلوري فحص الخلايا اللمفاوية تتكيف بسهولة لتحديد المركبات المناعية جديدة. يستخدم هذا الاختبار T أو B الخلايا المشتقة من الفئران المحورة جينيا، التي المروج Nur77 يدفع التعبير GFP على تي أو B-خلية تحفيز مستقبلات. كما تعكس كثافة GFP لتفعيل / النشاط النسخي للخلية المستهدفة، ويعرف لدينا فحص أداة جديدة لدراسة تأثير مركب معين (ق) على الاستجابات الخلوية / البيولوجية. على سبيل المثال، تم إجراء فحص أساسي باستخدام 4398 مركبات في ظل عدم وجود "فرضية الهدف"، والتي أدت إلى تحديد 160 الزيارات المحتملة عرض الأنشطة المناعية. وهكذا، فإن استخدام هذا الاختبار هو مناسبة لبرامج اكتشاف المخدرات استكشاف مكتبات كيميائية كبيرة قبل لزيادة في المختبر / في الدراسات المجراة التحقق من الصحة.

Introduction

فحص عالية الإنتاجية (HTS) هو استراتيجية مؤكدة اعتمدت على نطاق واسع لتحديد جزيئات علاجية جديدة أو لإعادة تنظيم الأدوية وافقت عليها الهيئة في مؤشرات طبية جديدة. 1 وحتى الآن، فإن نجاح HTS حققت يمكن قياسها من قبل عدد كبير من الأدوية المكتشفة سابقا. على سبيل المثال، استخدام المانع lapatinib التيروزين كيناز لعلاج سرطان الثدي، سيتاقلبتين. تمثل dipeptidyl ببتيداز-4 (DPP-4) المانع تستخدم العقاقير المضادة للفرط سكر الدم، والفم BCR-المحمول جوا التيروزين كيناز المانع dasatinib المستخدمة لعلاج سرطان الدم النقوي المزمن أمثلة قليلة من قائمة طويلة من الأدوية المعتمدة اكتشفت أصلا HTS. 2 على الرغم من أن إنتاجية مجال الصناعات الدوائية قد عانت في الآونة الأخيرة من نقص في اكتشاف كيانات كيميائية جديدة، يمكن أن تحسن من احتمالات اكتشاف المخدرات ناجحة من خلال زيادة عدد المبيضات ما قبل السريريةقسم التدريب والامتحانات التي تظهر الخصائص البيولوجية / الكيمياء الحيوية تغييري. وفقا لذلك، يمكن وضع المقايسات HTS جديدة تكييفها لفحص المظهري توفر القدرة على توفير أدوات الدوائية هامة لاكتشاف يضرب دواء جديد. 3، 4، 5، 6 وعلاوة على ذلك، HTS يمكن الآن إجراء بوتيرة أسرع بسبب التحولات التكنولوجية الكبيرة في السنوات الأخيرة بما في ذلك منشآت مصممة خصيصا مرنة الروبوتية، تقنيات قرأ الرواية والتصغير واسعة النطاق. 2، 7 من بين العوامل التي تسهم في الاهتمام المتزايد في استخدام الفحص المظهري (ويعرف أيضا باسم الأمام الصيدلة) هو الاعتقاد بأن تركز على الآثار الوظيفية بدلا من الافتراضات الاختزالية التبسيط بشأن أهداف جزيئية (فحص / التفاعلات الكيميائية الحيوية القائمة على الهدف) هو الأرجح إلى sho الفعالية السريرية ث. وهكذا، وفحص المظهري يبشر لكشف المركبات يحتمل أن تكون علاجية جديدة والمسارات الجزيئية للأمراض غير قابلة للعلاج حاليا. 2

لتحديد مثبطات أو تفعيل لهدف الجزيئية معين أو وظيفة الخلوية بشكل صحيح، لا بد من فحص حساسة للغاية ويمكن الاعتماد عليها من أجل التفريق بين يضرب النية الحسنة وايجابيات كاذبة. لذلك، ما يجعل فحص جيد؟ نوعية فحص معين يجب أن يكون الحكم لأول مرة من قبل نسبة الإشارة إلى الضوضاء (يتجلى من خلال عامل Z). 8 ثانيا، ينبغي أن توضع بوضوح التأثير المستهدف أو الهدف من الشاشة. على سبيل المثال، يمكن للنهج القائم على خلية وظيفية توفر مزايا هامة لفحص مستقبلات بدلا من مقايسة مصممة خصيصا لتقييم يجند مستقبلات ملزمة. والسبب في ذلك هو أن النهج الأخير لا يمكن التفريق بين ناهض وخصم بروابط.SS = "XREF"> 9 في المقابل، هو النهج القائم على خلية من المرجح أن تكون أكثر فعالية وظيفة مستقبلات يمكن تقييم مباشرة في النمط الظاهري البيولوجي (انتشار واعتقال دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، و / أو التمايز). ومع ذلك، لا بد من الإشارة إلى أن فحوصات الكيمياء الحيوية يمكن أن توفر مزايا هامة على فحوصات المظهري لأنها تتعدى على هدف داخل الخلايا المحددة. وهناك فحص كيميائي حيوي جيدا الأمثل عموما أقل مبعثر البيانات من الفحص المظهري في الوقت الذي تبسط بعد ذلك التحقيقات المتعلقة بالآلية الجزيئية المخدرات من العمل. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي لفحوصات القائم على الهدف أو البيوكيميائية هو فرصة لتضخيم معدل ضربات إيجابية كاذبة التي قد تؤثر على أهداف غير محددة عند اختباره في نظام بيولوجي (فقدان خصوصية درس في الأصل في مقايسة البيوكيميائية). 10 على الرغم من أن النقطة الفاصلة الراسخة بين يضرب السلبية والإيجابية يمكن أن تقلل من عدد من ايجابيات كاذبة طن غربلة أولية، واستخدام نظام ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية محاكاة البيئة الخلوية المحلية مثل خلايا سليمة، النسيج كله أو الحيوان كله يبقى جوهر البندول تصميم الفحص. لذلك، وفحص المظهري يمكن اكتشاف الرصاص مع آثار المظهري البيولوجية / مرغوب فيه للأمراض مع أي أهداف المخدرات التي تم تحديدها دون معرفة مسبقة من نشاط المجمع أو طريقة العمل. 11

وتتعلق دراسة هذا القانون وتطوير واختبار وفحص المظهري الأمثل وقابلة للتكرار على أساس عنصرين هامين: نموذج الفأر المتاحة تجاريا وتتجمع الفرعية عائلة من المركبات الكيميائية. وفيما يتعلق نموذج حيواني، ويعتمد الفحص على استخدام الخلايا الليمفاوية المستمدة من سلالة الماوس (Nur77 GFP) بايواء كروموسوم اصطناعي البكتيرية التي تحتوي على الكاسيت الذي هو الدافع وراء التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) من خلال الالبريد Nur77 المروج. 12 ويستند السمة المميزة لهذا التحفيز على حقيقة أن Nur77 هو جين الفورية المبكرة يصل ينظم التالية مستقبلات الخلايا التائية (TCR) أو تحفيز مستقبلات B-الخلية (BCR). 12 أما بالنسبة للطريقة الفرز نفسها، وكان يستخدم نهجا للمساعدة في تجنب فحص نظائرها تافهة مع التقليل من الوقت اللازم لتقييم مكتبة الكيميائية كبيرة (> 10 5 مركبات). للقيام بذلك، واستغلال قاعدة بيانات من المركبات الكيميائية التي اختارها الكيميائيين الطبية باستخدام أدوات الفحص الظاهري لتحديد مركبات مماثلة طبوغرافيا باستخدام هياكل البذور الفعالة المعروفة باسم المراجع. يسمح هذا النهج لنا لفحص المركبات 4398 وهو ما يمثل مكتبة شاملة لأكثر من 136،000 الكيانات الكيميائية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع البروتوكولات الحيوان من قبل لجنة رعاية الحيوان من جامعة مونتريال. الموت الرحيم كانت الفئران عن طريق استنشاق التدريجي من CO 2 حتى وحظت يتبع أي علامات حيوية عن طريق خلع عنق الرحم. تم تنفيذ الإجراء من قبل شخص معتمد للتأكد من أن الحيوانات الموت الرحيم كانت بطريقة إنسانية وفقا لتوصيات المجلس الكندي للرعاية الحيوان.

1. إعداد خلية طحالية المتوسطة والتدفق الخلوي-العازلة

  1. تنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء البيولوجي تنظيف الايثانول 70٪.
  2. إزالة 70 مل من معهد روزويل بارك التذكاري استعد مسبقا (RPMI) 1640 1X المتوسطة (متوفرة تجاريا وتوفيرها في المصفاة 500 مل حجم زجاجات معقمة) ووضعه في أنبوب العقيمة. وسوف تستخدم وسيلة إزالة في وقت لاحق في البروتوكول.
  3. تكملة 430 مل المتبقية من RPMI 1640 1X مع 50 مل المعطل مصل بقري جنيني (FBS)، 5 مل البنسلين / الستربتومايسين، 5مل HEPES، 5 مل الأحماض الأمينية غير الأساسية، 5 مل البيروفات الصوديوم، و 0.05 مل تصفيتها (1M) 2-المركابتويثانول.
    ملاحظة: قبل الدافئ خلية طحالية المتوسطة باستخدام حمام مائي وضعت في 37 درجة مئوية لتجنب خلايا الحرارة صدمة. وهذا أمر مهم لتجنب استحثاث موت الخلايا المبرمج الخلوية.
  4. لإعداد عازلة التدفق الخلوي، إضافة 2 مل من FBS إلى 98 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ويحفظ في الثلاجة حتى استخدامها (ويفضل في غضون ثلاثة أيام).

2. جيل من خلية طحالية تعليق خلية من Nur77 GFP الطحال ماوس

  1. وseptically عزل الطحال من الإناث الماوس Nur77 GFP 6-8 الاسبوع القديمة.
    1. ولتحقيق ذلك، تعمل تحت غطاء العقيمة. نقع التضحية الماوس والفراء، ومقص وملقط في 70٪ من الإيثانول.
    2. وضع الماوس على جانبها الأيمن، وقطع الجلد والعضلات في الربع البطن العلوي الأيسر. تفقد منطقة شق لتحديد مكان واضح في الطحال ثم قطع بها. الحفاظ على الطحالفي المتوسط ​​خلية طحالية على الجليد حتى جاهزة للتنفيذ الخطوة التالية.
  2. وضع الطحال (ق) في 10 سم 2 خلية طبق الثقافة بتري تحتوي على 5 مل من المتوسط خلية طحالية قبل تحسنت.
  3. الهريس والطحال باستخدام المكبس حقنة معقمة حتى الحل هو عكر. ينبغي أن يظل الكولاجين مصفوفة الطحال بحلول نهاية هذا الإجراء.
  4. بعد يهرس واسعة في وسط خلية طحالية، وجمع تعليق خلية وتمريرها من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر وضعت على أنبوب 50 مل لتصفية خارج أي حطام أو جلطات.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. بعد التخلص من طاف، وإعادة تعليق بيليه خلية في 2-3 مل من تحلل العازلة داخل المنتجة أو التجاري خلايا الدم الحمراء. بعد pipetting ل(2-3 مرات) السماح للبقية تعليق لمدة 20-30 ثانية.
  6. إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني أو منطقة عازلة مناسبة للاختيار ثم الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 500 × ز.
  7. إزالة طاف (يجب أن يكون أحمر اللون لأنه يحتوي هي lysed ب الحمراءخلايا lood) وإعادة تعليق بيليه خلية في 2 مل من المتوسط ​​خلية طحالية.
  8. باستخدام عدادة الكريات، والاعتماد على عدد من الخلايا الملون باللون الأزرق التريبان للتمييز بين (نخرية) الخلايا الحية والميتة.

3. خلايا T عزل من تعليق خلية خلية طحالية

  1. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 500 × ز. إعادة تعليق الخلايا في مصل الدم خالية من RPMI المتوسطة (50 مل من الخطوة 1.3) للحصول على تركيز الخلوية من 10 × 10 6 خلية / مل.
  2. نقل الخلايا إلى أنبوب البوليسترين 5 مل وتوضع جانبا قسامة 100 ميكرولتر من splenocytes للنقاء تقييم / مقارنة في نهاية الخطوة تنقية.
  3. إضافة مصل الفئران العادية لتعليق الخلية في 50 ميكرولتر / مل تليها تي العزلة خلية الأجسام المضادة كوكتيل (50 ميكرولتر / مل).
  4. مزيج تعليق الخلية والسماح لها راحة لمدة 10 دقيقة. هذه الخطوة تسمح للكوكتيل الأجسام المضادة لربط كل الخلايا غير المرغوب فيها.
  5. إضافة المجالات السريع streptavidin (المغناطيسحبات جيم) لمدة 2.5 دقيقة، ثم جعل وحدة التخزين إلى 2.5 مل باستخدام المصل خالية المتوسطة.
  6. وضع أنبوب في المغناطيس العزلة خلية لمدة 3 دقائق.
  7. نقل تعليق الخلايا التائية في أنبوب البوليسترين الجديد من خلال عقد المغناطيس وسكب الحل في خطوة واحدة.
    ملاحظة: تعليق معزول يحتوي على خلايا T النقاء. تقام جميع الخلايا غير المرغوب فيها على جانب الأنبوب منضمة إلى حبات streptavidin المغناطيسي.
  8. عد خلايا تي المعزولة باستخدام التريبان الأزرق وعدادة الكريات.
    ملاحظة: في هذه الخطوة على نقاء خلايا تي المعزولة يمكن التحقق (اختياري) عن طريق تحليل نسبة CD3 + الأحداث قبل وبعد T العزلة الخلية عن طريق التدفق الخلوي. 13
    1. لفترة وجيزة، الطرد المركزي 1 مل من تعليق خلية خلية طحالية في 500 × ز. تجاهل طاف وتعليق الخلايا في المخزن التدفق الخلوي بتركيز 1 × 10 6 خلية / مل.
    2. إضافة فلوري الموسومة مكافحة مذكرات التفاهمالأجسام المضادة ه CD3 بتركيز 1: 100. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يغسل مرة واحدة، الطرد المركزي وإعادة تعليق العازلة في التدفق الخلوي (400 ميكرولتر) لتحليلها من قبل التدفق الخلوي.

4. عزل B-خلية من تعليق خلية خلية طحالية

  1. اتبع نفس البروتوكول كما هو موضح للخلايا T (الخطوات 3،1-3،8) ولكن باستخدام طقم العزلة B-الخلية. لتقييم النقاء، استخدام الأجسام المضادة CD19 بدلا من الأجسام المضادة CD3. 13
    1. لتقييم النقاء (اختياري)، واستخدام الأجسام المضادة CD19 بدلا من الأجسام المضادة CD3. الطرد المركزي 1 مل من تعليق خلية خلية طحالية في 500 × ز. تجاهل طاف وتعليق الخلايا في المخزن التدفق الخلوي بتركيز 1 × 10 6 خلية / مل.
    2. الموسومة إضافة الفلورسنت مكافحة فأر CD19 الأجسام المضادة بتركيز 1: 100 واحتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. يغسل مرة واحدة، الطرد المركزي وإعادة تعليق العازلة في التدفق الخلوي (400 ميكرولتر) FOتحليل ص بواسطة التدفق الخلوي.

5. تنشيط خلايا T وتحريض من التعبير GFP

  1. البذور الخلايا T، في تعليق، في لوحة 96-جيدا القاع ذهابا وبتركيز 2.5 × 5 10 خلايا / جيد.
  2. إضافة انترلوكين المؤتلف (IL) -7 في 2 نانوغرام / مل و CD3 / CD28 حبات مغناطيسية (25 ميكرولتر / 10 6 خلايا). الحفاظ على جزء من الخلايا T غير المعالجة مع حبات لتكون بمثابة سيطرة سلبية للقياسات في وقت لاحق أن تمثل خلايا T غير مفعلة.
  3. بعد اثني عشر ساعة، حصاد الخلايا T من لوحة 96-جيدا من قبل pipetting بلطف تعليق خلية في كل بئر صعودا وهبوطا لكسر أي مجمع حبة خلية / الركام. جمع تعليق من جميع الآبار في أنبوب البوليسترين 5 مل.
  4. وضع الأنبوب الذي يحتوي على تعليق داخل نفس المغناطيس عزل الخلايا المستخدمة سابقا لتنقية T أو B الخلايا والسماح لها للراحة لمدة 5 دقائق.
  5. نقل الباحث تي تعليق خليةالزراعة العضوية أنبوب البوليسترين الجديد من خلال عقد المغناطيس وسكب الحل في خطوة واحدة.
  6. الطرد المركزي الخلايا في 500 x ج لمدة 5 دقائق. إعادة تعليق الخلايا في وسط خلية طحالية جديدة للحصول على تركيز 2 × 10 6 خلية / مل.
  7. تقييم GFP التعبير كثافة من التدفق الخلوي (اختياري لمراقبة الجودة) في 12-24 ساعة بعد التحفيز في مقارنة مع خلايا غير المفعلة تي. 12
    ملاحظة: مضان GFP متأصل في خلايا Nur77 GFP T ويتجلى على تفعيل الناجح لTCR. 12
  8. لتقييم الجدوى وتفعيل (اختياري) بواسطة المجهر، وصمة عار على الخلايا تفعيلها مع هويشت 30 دقيقة قبل التحليل بتركيز 0.2 ميكروغرام / مل. إضافة حجم كاف لتعليق الخلية إلى شريحة غطاء أو إلى بئر من لوحة 384 جيدا مسطحة القاع الأسود من جانب وفحص تحت المجهر مضان لتقييم الخلايا الحية. والخلايا الميتة لا تحتفظ النوويةتلطيخ. 14

6. تفعيل B-الخلية وتحريض التعبير GFP

  1. عن طريق ثقافة قارورة T-25، اعادة تعليق الخلايا البائية معزولة في 1 × 10 6 خلية / مل.
  2. إضافة المضادة للماوس مفتش / الغلوبولين المناعي (H + L) في 10 ميكرولتر / مل وCD40L المؤتلف في تركيز 200 نانوغرام / مل. الحفاظ على جزء من الخلايا البائية غير المعالجة لتكون بمثابة سيطرة سلبية للقياسات في وقت لاحق (تمثل الخلايا البائية غير مفعلة).
  3. تقييم GFP التعبير كثافة من التدفق الخلوي في 12 أو 24 ساعة بعد التحفيز في مقارنة مع خلايا غير المفعلة B.
    ملاحظة: مضان GFP متأصل في خلايا Nur77 GFP باء ويتجلى على تفعيل الناجح لBCR. 12
  4. لتقييم الجدوى وتفعيل (اختياري) بواسطة المجهر، وصمة عار على الخلايا تفعيلها مع هويشت 30 دقيقة قبل التحليل بتركيز 0.2 ميكروغرام / مل. إضافة حجم كاف لتعليق الخلية لشريحة غطاء أو إلى بئر من لوحة 384 جيدا مسطحة القاع الأسود من جانب وفحص تحت المجهر مضان لتقييم الخلايا الحية. والخلايا الميتة لا تحتفظ تلطيخ النووي. 14

فحص 7. ارتفاع الإنتاجية من الجزيئات الصغيرة

  1. إعداد تعليق خلية في 2 × 10 6 خلية / مل من الخلايا T أو B المنشط (حبات مغناطيسية أو الأجسام المضادة / CD40L) أو مجموعات غير المفعلة.
  2. لوحة 75،000 خلية / بئر في لوحة 384 جيدا (حجم 40 ميكرولتر). استخدام لوحة 384 جيدا السوداء من جانب القاع المسطح أو المجهر غطاء شريحة لبقاء وتفعيل تقييم بواسطة المجهر الفلورسنت (اختياري مراقبة الجودة خطوة قبل HTS) باستخدام هويشت صمة عار (راجع الخطوات 5.8 و 6.4 لمزيد من التفاصيل). 14
  3. يدويا أو باستخدام نظام الآلي، إضافة إلى عقاقير مفضلة (المنحلة في 0.5٪ DMSO) إلى كل بئر.
  4. إضافة السيارة (DMSO) إلى إيجابي (تفعيل) والسلبية (غير أكتي-vated) آبار المراقبة. ضبط تركيز DMSO إلى حد أقصى قدره 0.5٪.
  5. احتضان لوحات لمدة 24 ساعة (أو حضانة وقت الاختيار) في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  6. في يوم الفرز، يخفف من هويشت 33342 صمة عار حل (1: 3333، على سبيل المثال لإضافة 10 ميكرولتر من الخلايا في لوحات 384 جيدا لتوليد الحجم الإجمالي إلى 50 ميكرولتر). وصمة عار مدة 30 دقيقة قبل تحليل GFP بإضافة حل هويشت لتحقيق تركيز 0.2 ميكروغرام / مل.
  7. ماصة بلطف الخلايا صعودا وهبوطا للحصول على توزيع متجانس في كل بئر.
    ملاحظة: هذه الخطوة مهمة في حالة الاستغناء عن المخدرات (الخطوة 7.3) باستخدام نظام آلي كما تميل الخلايا تتراكم في جانب واحد من البئر، عكس اتجاه التدفق.
  8. تدور لوحات في 45 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  9. ترك لوحات لبقية لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  10. أداء لوحة (ق) قراءة الرافضة، وذلك باستخدام مبائر للأفلام ا نسبة عالية الآليملمسه (HCS) النظام. 15 تحميل لوحة لآلة. تعيين الهدف في 40X أو أعلى التكبير. استخدام الكاميرا رقم 4 لهويشت (مصباح الأشعة فوق البنفسجية) وكاميرا رقم 1 لGFP (ليزر 488). إعداد الجهاز لقراءة 6-10 الحقول لكل بئر. ضبط الجهاز للقيام اثنين من قراءات متتابعة لكل حقل في 488 نانومتر (لقراءة GFP) والأشعة فوق البنفسجية (لقراءة هويشت). تعيين الهدف في 40X أو أعلى التكبير.
    ملاحظة: هذا النظام هو المجهر المحوسب الذي لا يتطلب أي تعديلات. المسافة البؤرية، وشدة الضوء الساقط ووقت التعرض كلها الإعداد تلقائيا من قبل الجهاز.

النتائج

تصميم للمقايسة HTS

تم نقل اثنين من العوامل الهامة في الاعتبار عند تصميم فحص الفلورسنت هنا. أولا، نحن في حاجة إلى تكرار حالة الفسيولوجية التي تي أو B تنشيط الخلايا سوف يمثل مرض (مثل مرض الطعم ضد...

Discussion

وقد تم استغلال العديد من الطرق للقراءة من أجل تطوير فحوصات HTS حساسة وموثوق بها. وتشمل هذه اللونية، الانارة أو أساليب الفلورسنت. على الرغم من أن وسائل اللونية هي بسيطة لانشاء، فإنها تتطلب إضافات متعددة من المواد الكيميائية التي قد تتداخل أو تعطيل الخلايا التي يجري اخت...

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل صناديق ميرك Frosst البدء المقدمة من جامعة مونتريال. ونود أن نشكر الدكاترة جان Duchaine ودومينيك Salois من منصة عالية الإنتاجية في معهد للبحوث في علم المناعة والسرطان لمن المناقشة والتعليقات والتغذية المرتدة. Moutih رافع يحمل للبحوث أون سانتيه كيبيك جائزة فون جديد 1.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Nur77GFP miceThe Jackson LaboratoryMouse strain No. 016617An in house colony was established at our animal facility 
96 wells-U culture plates, sterileVWR International10062-902T-cell activation using the magnetic beads
70 µm cell strainer, sterileCorning Inc.352350Generation of splenocytes cell suspension
5 ml polystyrene round bottom tubes, sterileCorning Inc.352058Generation of splenocytes cell suspension
50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterileVWR International89039-656 Generation of splenocytes cell suspension
10 ml syringe without needle, sterileBecton, Dickinson and Company305482To mash the spleen
T-25 culture flaskGreiner Bio-One690 175To incudabte B cells during activation
5 ml cell culture dish, sterileGreiner Bio-One627 160To mash the spleen
Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL)WISENT Inc.450-200-EL  Component of the splenocyte media
RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamineWISENT Inc.350-002-CL Component of the splenocyte media
MEM non-essential amino acidsWISENT Inc.321-010-EL Component of the splenocyte media
HEPES free acid 1 MWISENT Inc.330-050-EL Component of the splenocyte media
Sodium pyruvate solution (100mM)WISENT Inc.600-110-EL Component of the splenocyte media
Fetal Bovine Serum (FBS) WISENT Inc.080-910 Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer
Phosphate buffered saline (PBS)WISENT Inc.311-010-CLComponent of flow-cytometry buffer
2-Mercaptoethanol (55 mM)Thermo Fisher Scientific21985-023Component of the splenocyte media
T-Cells isolation kitStemcell Technologies19851To isolate T cells
B-Cells isolation kitStemcell Technologies19854To isolate B cells
Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beadsThermo Fisher Scientific11452DTo activate T cells 
Cell isolation magnetStemcell Technologies18000To isolate T cells and remove the magnetic beads 
AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.115-006-068To stimulate B cells
Recombinant Murine IL-7Peprotech217-17 To support T-cell survival during activation
Recombinant CD40LR&D Systems8230-CL/CFTo stimulate B cells
Anti-mouse CD3 antibodyBD Pharmingen561799To stain T cells for flow-cytometry
Anti-mouse CD19 antibodyBD Pharmingen553786To stain B cells for flow-cytometry
Biomek FXpPerkinElmer Inc.A31842To re-suspend cells after 24 h incubation
Opera Phenix High Content Screening SystemPerkinElmer Inc.HH14000000To analyze GFP/Hoechst signal

References

  1. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
  2. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
  3. Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
  4. Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
  5. Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
  6. St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
  7. Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O'Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
  8. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  9. Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
  10. Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
  11. Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
  12. Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
  13. Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
  14. Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
  15. Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
  16. An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
  17. Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
  18. Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
  19. Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
  20. Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
  21. Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
  22. Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
  23. Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
  24. Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
  25. Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
  26. Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
  27. Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

121 Nur77 GFP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved