الفئران الأرواح سحق إصابة: كفاءة<em&gt; في فيفو</em&gt; نموذج من انتشار الخلايا العضلية السلس والوظيفة البطانية

Dan Yu; George Makkar; Rajabrata Sarkar; Dudley K. Strickland; Thomas S. Monahan

doi:10.3791/55201

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

تضيق بعد إجراءات القلب والأوعية الدموية (جراحة الالتفافية، قسطرة، أو الدعامات) هو مشكلة كبيرة تقلل من متانة هذه الإجراءات. العلاج المثالي من شأنه أن تمنع الخلايا العضلية الملساء (فسمك) انتشار مع تعزيز تجديد البطانة. نحن تصف نموذجا للتقييم في وقت واحد من انتشار فسمك والوظيفة البطانية في الجسم الحي.

Abstract

إعادة بناء الشرايين، سواء قسطرة أو جراحة الالتفافية، ينطوي على صدمة علاجي المنشأ تسبب اضطراب البطانية والأوعية الدموية الخلايا الملساء العضلات (فسمك) انتشار. نماذج الفئران الشائعة دراسة السفن الصغيرة مثل الشرايين السباتية والفخذية. هنا نحن تصف نظام في الجسم الحي الذي كل من انتشار فسمك والوظيفة حاجز بطانية يمكن تقييمها في وقت واحد في وعاء كبير. درسنا استجابة الأبهر إنفرارينال للإصابة في C57BL / 6 الفئران. أصيب الشريان الأورطي من الوريد الكلوي الأيسر إلى التشعب الأبهر بواسطة 30 سحق ترانزميورال من 5 ثوان مدة مع قضيب القطن ذات الرؤوس. تم تقييم التغيرات المورفولوجية مع الأنسجة التقليدية. تم قياس سمك الجدار الأبهر من سطح اللمعية إلى أدفنتيتيا. تم استخدام إيدو التكامل ومكافحة تلطيخ مع دابي وألفا أكتين لإثبات انتشار فسمك. تنشيط ERK1 / 2، وهو مشرف معروف من تشكيل تضخم باطنة، وردعالملغومة بواسطة تحليل لطخة الغربية. تم تحديد تأثير الالتهاب بواسطة المناعية للخلايا البائية، والخلايا التائية، والضامة . في مواجهة أقسام من البطانة تم تصور مع المجهر الإلكتروني المسح (سيم). تم تحديد وظيفة الحاجز البطانية مع تلطيخ ايفانز الأزرق. أسفرت إصابات ترانسمورال في سماكة الجدار الأبهر. هذه الإصابة الناجم عن انتشار فسمك، والأكثر بروزا في 3 أيام بعد الإصابة، والتفعيل المبكر ل ERK1 / 2 وانخفض ^{التعبير} p27 kip1. لم تسبب الإصابة في زيادة خلايا B، خلايا T، أو تسلل الضامة في جدار الوعاء الدموي. تسببت إصابة جزئية البطانية خلية التعكر وفقدان خلية الخلية الاتصال. أسفرت الإصابة عن خسارة كبيرة في وظيفة الحاجز البطانية، والتي عادت إلى خط الأساس بعد سبعة أيام. يوفر نموذج إصابة الشريان الأبهر حادة الفئران نظام فعال لدراسة في وقت واحد على حد سواء انتشار فسمك وظيفة الحاجز البطانية في وعاء كبير.

Introduction

عودة التضيق في أعقاب إجراءات القلب والأوعية الدموية (جراحة الالتفافية، قسطرة، أو الدعامات) هي مشكلة كبيرة تقلل من متانة هذه الإجراءات. يعاني جميع عمليات إعادة التوعي من إعادة التضيق. الاستراتيجيات الحالية لمنع تضيق (الدعامات التي تطلق على المخدرات والبالونات المغلفة المخدرات) تمنع كل من خلايا العضلات الملساء الوعائية (فسمك) وتكاثر الخلايا البطانية (إيك). وبالتالي، فإن هذه التدخلات منع فسمك بوساطة تضيق، ولكن أيضا منع تجديد البطانة. دون بطانة سليمة، والمطلوب من المرضى أن يكون على وكلاء مضاد للصفيحات قوية للحد من خطر تخثر في الموقع في خطر حدوث مضاعفات النزيف. العلاج المثالي من شأنه أن يمنع انتشار فسمك مع تعزيز تجديد البطانة. وهكذا، هناك حاجة إلى دراسة في وقت واحد انتشار فسمك والحاجز البطانية وظيفة ط ن فيفو .

في الوقت الحاضر، هناك قطعنماذج الفأر من تضيق ¹ . وتشمل هذه النماذج ربط السباتي وإصابة سلك الشريان الفخذي ² . وتشمل نماذج الأبهر وضع الدعامة ³ ، إصابة البالون ⁴ ، والأبهر مزروع ⁵ . جميع النماذج الحالية محدودة. ربط السباتي يولد آفة نيوينتيمال بوساطة تدفق وليس لديها إصابة بطانية. بالإضافة إلى ذلك، كل من الشرايين السباتية والفخذية لديها العديد من أضعاف طبقات الخلايا أقل من الأوعية البشرية، مما يحد من قيمتها متعدية. الشريان الأورطي الماوس الذي هو ما يقرب من 1.3 ملم في القطر، هو السفينة الوحيدة التي تقترب سريريا ذات الصلة (الشريان التاجي) الشريان البشري (3).

على الرغم من إمكانيات متعدية من النماذج الأبهرية الفئران من المرض، والنماذج الحالية لديها قيود. هذه النماذج تتطلب المهارات المجهرية المتقدمة والمعدات المتخصصة مثل بالونات الأوعية الدموية والدعامات. هنا، نقدمرواية، تقنية استنساخ لحث في وقت واحد انتشار فسمك وتعطيل وظيفة الحاجز البطانية.

Protocol

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على بروتوكولات التعامل مع الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) من جامعة ماريلاند (بروتوكول رقم 0416009) وأجريت وفقا لمعايير آلاك الدولية.

1. الإجراء الجراحي

تقنية التخدير
1. تعقيم جميع الأدوات المستخدمة في جراحة البقاء على قيد الحياة مع التعقيم بالبخار عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. تخدير التخدير عن طريق خزان الحث مع 100٪ O ₂ و 2.5٪ إيسوفلوران تسليمها عن طريق المرذاذ الدقة. بعد الحث، وقف إيسوفلوران ودافق الغرفة مع O ₂ . الحفاظ على التخدير مع 1.5-2٪ إيسوفلوران عن طريق قناع الوجه و 1 L / دقيقة O ₂ عن طريق الاستنشاق.
3. إرفاق كل من غرفة التعريفي وقناع الوجه إلى زبال الفحم ل امتزاز الغاز النفايات لحماية الموظفين. ضمان مستوى مخدر كاف من قبل ديمونترمع عدم وجود استجابة للمؤثرات الضارة (أخمص القدمين قرصة).
4. إنشاء حقل منطوق يتكون من علبة جراحية مع وسادة متساوية الحرارة لتوفير الدعم الحراري أثناء الجراحة. وهناك وسادة متساوية الحرارة إضافية توفر الدعم الحراري للحيوانات في قفص الانتعاش بهم.
إعداد الحيوان
1. إجراء التحقيق التالية على 10-12 أسابيع من العمر الذكور C57BL / 6 الفئران.
2. إزالة الشعر على سطح بطني البطن من الحيوان من القص إلى المنطقة الإربية مع وكيل مزيل الشعر أو المقص الكهربائية مع عدد 40 شفرة.
  1. في حالة وكيل مزيل الشعر، وتطبيق هذا المركب إلى منطقة الجراحية لمدة 2-3 دقائق ثم إزالته مع القطن. نحن نستخدم مركب متاح تجاريا من هيدروكسيد الكالسيوم وهيدروكسيد الصوديوم.
3. الإعدادية المنطقة على الكتف مع 70٪ الكحول وحقن تحت الجلد كاربروفين (5 ملغ / كلغ) مع 25 قياس أو أصغر إبرة تتحمل. هذهوالعلاج توفر تسكين بعد العملية الجراحية للحيوان.
4. نقل الحيوان إلى الحقل الجراحي وموقف في الاستلقاء الظهري.
5. إعداد الموقع الجراحي عن طريق الغسل 8-12٪ بروفيد اليود مع قضيب القطن نظيفة أو القطن الشاش. ثم شطف الجلد مرتين مع الكحول 70٪.
6. مكان زيوت التشحيم العين في كلا العينين للحد من حدوث جفاف القرنية. تغطية الموقع الجراحي مع ثنى العقيمة.
تقنية المنطوق
1. جعل وسط البطن البطن شق حوالي 2-2.5 سم في الطول مع مشرط بداية الذيلية فورا عملية الخنجري وتمتد نحو الحوض.
2. حشد الأمعاء الدقيقة والاثني عشر وتعكس أفقيا إلى اليمين. نشمر شريط من القطن معقمة معقمة وغارقة مع محلول ملحي معقم للحقن للسماح للتعبئة من الأحشاء لتحسين التعرض.
3. مع الأمعاء الدقيقة حشدت إلى الجانب الأيمن منالبطن، وفضح خلف الصفاق و فضح الشريان الأورطي البطني من الوريد الكلوي الأيسر إلى التشعب الأبهر ( الشكل 1 ).
4. مع قضيب معقمة القطن ذات الرؤوس، وتقديم 30 سحق متتالية، كل خمس ثوان في المدة.
5. إزالة التعبئة والسماح للأحشاء للعودة إلى وضعهم الأصلي.
6. إغلاق اللفافة مع تشغيل 4-0 خياطة حيدة لامتصاص (بوليديوكسانون). يتم إغلاق الجلد مع تشغيل 6-0 غير قابلة للامتصاص خياطة حيدة (النايلون).
الإنعاش والرعاية ما بعد الإجراءات
1. بعد هذا الإجراء، ضع الحيوان في قفص الانتعاش مع الفراش نظيفة على وسادة متساوية الحرارة لمواصلة الدعم الحراري حتى الحيوان قادر على أمبولات بشكل طبيعي. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى أنه يدل على القدرة على الحفاظ على الاستلقاء القصية.
2. مراقبة الحيوان كل ساعة لمدة 4 ساعات الأولى بعد الجراحة. مرة واحدة في الحيوان هو الإسعاف العودة عادة ط t إلى غرفة التربية المخصصة. لن يتم إيواء الحيوان في شركة حيوان آخر حتى تعافى تماما.
3. مراقبة الحيوان مرتين يوميا لمدة 72 ساعة الأولى بعد الجراحة و 3 مرات على الأقل في الأسبوع بعد ذلك. ويشمل الرصد وزن الحيوان ثلاث مرات في الأسبوع.
4. إدارة كاربوفين (5 ملغ / كلغ) تحت الجلد مرتين يوميا لأول 72 ساعة بعد الجراحة.

2. شراء الأنسجة

طريقة القتل الرحيم
1. الموت ببطء الحيوانات في نقاط زمنية محددة سلفا.
2. تخدير التخدير عن طريق خزان الحث مع 100٪ O ₂ و 2.5٪ إيسوفلوران تسليمها عن طريق المرذاذ الدقة.
  1. لدراسة سلامة البطانة، إدارة إيفانز الأزرق صبغ للحيوان.
    ملاحظة: ايفانز الأزرق هو صبغ أزو سالبة مشحونة مع تقارب ملزمة عالية لالزلال، ويمكن فقط وصمة عار الأوعية الدموية في غياب بطانة سليمةs = "كريف"> 6.
  2. لدراسات سلامة البطانية، في وقت القتل الرحيم، يروي الحيوانات مع 5 مل من 0.3٪ ايفانز الأزرق صبغ تليها 5 مل بس في الضغط الفسيولوجي لمدة 5 دقائق. يتم الحفاظ على الحيوان في طائرة جراحية من التخدير أثناء إجراء نضح.
3. بعد تحقيق مستوى مخدر عميق، فتح الصدر مع القص. جعل تهتك في الأذين الأيمن للسماح تصريف الدم من الحيوان والوصول إلى البطين الأيسر هو الوصول مع إبرة 21 G وحقن الفوسفات مخزنة المالحة (بس) حتى النفايات السائلة من الأذين الأيمن واضح.
4. بعد نضح مع برنامج تلفزيوني، أدخل البطن من خلال شق خط الوسط.
5. مرة أخرى، وتعبئة الأمعاء الدقيقة إلى الجانب الأيمن من البطن تعريض الشريان الأورطي إنفرارينال، تشريح حاد الشريان الأبهر من الأنسجة المجاورة والخصم من الوريد الكلوي الأيسر إلى التشعب الأبهر.
6. تخزين الشريان الأورطي استئصال في بارافورمالد 4٪حل إهيد حتى يحدث معالجة الأنسجة.
  1. لدراسات سلامة البطانية، وفتح الشريان الأبهر طوليا وتعلق عليه إلى ورقة الشمع تعريض كامل سطح اللمعية ⁶ . إجراء تقييم نوعي للسلامة البطانية من قبل درجة تلطيخ مع ايفانز الأزرق صبغ ⁶ .
  2. لفحوصات نسيجية أخرى، قسم الشريان الأورطي عرضية وتضمينها في درجة حرارة القطع الأمثل (أكتوبر) المركبات كما تمليها الطريقة النسيجية لاستخدامها ⁷ .

النتائج

عرضت الشريان الأورطي عرضية جزءا لا يتجزأ من أكتوبر مقطوع، وملطخة الهيماتوكسيلين ويوزين ثم مكافحة ملطخة فيرهويف فان جيسون (ففغ) وصمة عار لتحديد الصفيحة المرنة الداخلية والخارجية ⁷ . إصابة سحق الناجم عن سماكة الأبهر سماكة بالمقارنة مع أو...

Discussion

لقد تميزت آثار نموذج إصابة الأبهر الفئران الذي يؤدي إلى تضخم الإنسي وخلل الحاجز البطانية. كرت مفرزة إيك الجزئية على طول الشريان الأورطي البطانية فقدان الاتصال خلية خلية وتعزيز نتوءات الخلية. في المقابل، ضعف وظيفة الحاجز البطانية بشكل ملحوظ، مما حفز مسارات الإشارات ...

Disclosures

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة شؤون المحاربين القدامى التطوير الوظيفي جائزة (1IK2BX001553-01) (تسم) والعلاج الوعائي إج ويلي للمنح الدراسية (تسم).

Acknowledgements

نشكر هسيا رو تشينغ دكتوراه، من المجهر الإلكتروني مرفق الأساسية من كلية الطب بجامعة ميريلاند، لدعمها التقني في تجهيز العينات المسح المجهري الإلكتروني.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ocular lubricant	Dechra	17033-211-38	Pharmaceutical agents
Isoflurane	VetOne	502017	Pharmaceutical agents
Carprofen	Zoetis	26357	Pharmaceutical agents
Precision vaporizer	Summit Medical	10675	Surgical supplies
Charcoal scavenger	Bickford Inc.	80120	Surgical supplies
Isothermal pad	Harvard Apparatus	50-7053-R	Surgical supplies
Sterile cotton-tipped applicator	Fisher Scientific	23-400-124	Surgical supplies
4-0 absorbable monofilament suture	Ethicon, Inc	J310	Surgical supplies
5-0 non-absorbable monofilament suture	Ethicon,Inc	1666	Surgical supplies
21-gauge x 1 inch needle	BD Biosciences	305165	Surgical supplies
25-gauge x 1 inch needle	BD Biosciences	305125	Surgical supplies
Dry sterilizer	Cellpoint	7770	Surgical supplies
Fine scissors	Fine Science Tools	14058-09	Surgical instruments
Adson forceps	Fine Science Tools	11006-12	Surgical instruments
Dumont #5 fine forceps	Fine Science Tools	11254-20	Surgical instruments
Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge	Fine Science Tools	15000-00	Surgical instruments
Needle driver	Fine Science Tools	91201-13	Surgical instruments
Scalpel handle #4	Fine Science Tools	10004-13	Surgical instruments
Scalpel blades #10	Fine Science Tools	10010-00	Surgical instruments
PBS	Lonza	17-516F	Reagents for tissue processing
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129	Reagents for tissue processing
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Reagents for tissue processing
Modeling wax	Bego	40001	Reagents for tissue processing
OCT compound	Tissue-Tek Sakura	4583	Reagents for tissue processing
Mayer's hematoxylin solution	Sigma-Aldrich	MHS16	Reagents for immunohistological analysis
Eosin Y solution alcoholic	Sigma-Aldrich	HT110316	Reagents for immunohistological analysis
Elastin stain kit	Sigma-Aldrich	HT25A	Reagents for immunohistological analysis
Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit	Invitrogen	C10337	Reagents for immunohistological analysis
Anti-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4695	Reagents for immunohistological analysis
Anti-phospho-Erk1/2 antibody	Cell Signaling Technology	4370	Reagents for immunohistological analysis
Anti-p27kip1 antibody	Cell Signaling Technology	3698	Reagents for immunohistological analysis
Trichloroacetic acid	Sigma-Aldrich	T9159	Reagents for immunohistological analysis

References

Carmeliet, P. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med. 6 (4), 389-395 (2000).
Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff's elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, S15-S20 (2009).
Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation - kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated:

الفئران الأرواح سحق إصابة: كفاءة

In This Article