3D تجميع المغناطيسي الخلايا الجذعية ومفاعل حيوي النضج لتجديد الغضروف

Summary

تكون الغضروف من الخلايا الجذعية يتطلب ضبط الأوضاع الثقافة. هنا، نقدم نهج المغناطيسي لتكثيف الخلايا، وهي خطوة ضرورية لبدء تكون الغضروف. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا أن نضوج الحيوي في مفاعل حيوي ينطبق التحفيز الميكانيكي للبنيات الخلوية ويعزز الغضروفية إنتاج المصفوفة خارج الخلية.

Abstract

تبقى الهندسة الغضروف تحديا يرجع إلى صعوبات في خلق زرع في المختبر وظيفية مماثلة لأنسجة الأم. نهج استكشافها مؤخرا لتطوير بدائل ذاتي ينطوي على تمايز الخلايا الجذعية إلى غضروفية. لبدء هذا تكون الغضروف، وعلى درجة من الضغط من مطلوب الخلايا الجذعية. وبالتالي، أثبتنا جدوى خلايا التكثيف مغناطيسيا، سواء داخل السقالات سميكة وخالية من سقالة، وذلك باستخدام مصادر المجال المغناطيسي المنمنمة كما الجذابون الخلية. وقد استخدم هذا النهج المغناطيسي أيضا لتوجيه الانصهار الكلي ولبناء خالية من سقالة، نظمت، ثلاثي الأبعاد (3D) الأنسجة عدة مليمترات في الحجم. بالإضافة إلى وجود حجم المعزز، قدمت الأنسجة التي شكلتها انصهار مدفوعة المغناطيسي زيادة كبيرة في التعبير عن الكولاجين II، ولوحظ اتجاه مماثل للتعبير aggrecan. كما تعرض الغضروف الأصلي للقوات رقبعة أثرت هيكل 3D لها، وقد أجريت أيضا نضوج ديناميكي. تم استخدام مفاعل حيوي التي توفر المحفزات الميكانيكية للثقافة السقالات المصنف مغناطيسيا على مدى فترة 21 يوما. مفاعل حيوي نضوج تحسنت إلى حد كبير تكون الغضروف في السقالات cellularized. وكانت المصفوفة خارج الخلية التي تم الحصول عليها في ظل هذه الظروف الغنية في الكولاجين II وaggrecan. يحدد هذا العمل إمكانات مبتكرة من التكثيف المغناطيسي للخلايا الجذعية وصفت ونضوج الحيوي في مفاعل حيوي لتحسين التمايز مكون للغضروف، سواء خالية من سقالة وضمن السقالات السكاريد.

Introduction

يتم استخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية بالفعل في العيادة وكلاء النقيض للتصوير بالرنين المغناطيسي (MRI)، وتطبيقاتها العلاجية الحفاظ على التوسع. على سبيل المثال، فقد تبين مؤخرا أن الخلايا المسمى يمكن التلاعب في الجسم الحي باستخدام مجال مغناطيسي خارجي، ويمكن أن توجه و / أو الاحتفاظ بها في موقع محدد من زرع ^{1، 2، 3.} في مجال الطب التجديدي، ويمكن استخدامها لهندسة الأنسجة المنظمة في المختبر ^4، بما في ذلك الأنسجة الوعائية ^{5، 6، 7، 8} العظام، والغضاريف ^9.

مغمورة الغضروف المفصلي في بيئة اوعائية، مما يجعل إصلاح مكونات المصفوفة خارج الخلية محدودة للغاية عندما تحدث الأضرار. لهذا السبب، researcوتركز حاليا على ح هندسة استبدال غضروف زجاجي يمكن زرعها في موقع الخلل. من أجل إنتاج بديل ذاتي، وبعض المجموعات البحثية واستكشاف استخدام غضروفية ذاتي كمصدر الخلية ^{10 و 11،} في حين يؤكد آخرون قدرة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSC) على التمايز إلى غضروفية ^{12 و 13.} في الدراسات السابقة خصت هنا، اخترنا MSC، وأخذ العينات نخاع العظام هي بسيطة نسبيا ولا تتطلب التضحية من غضروفية الصحية، التي تخاطر بفقدان النمط الظاهري على ^14.

خطوة مبكرة ضرورية لبدء تمايز الخلايا الجذعية المولدة للغضروف هي التكثيف بهم. تتشكل مجاميع الخلايا عادة باستخدام الطرد المركزي أو ثقافة MICROMASS ^15؛ ومع ذلك، هذه الأساليب التكثيف neitheص تقديم القدرة على خلق مجموعات الخلايا داخل السقالات سميكة ولا القدرة على السيطرة على مزيج من الركام. في هذه الورقة، ونحن تصف نهجا مبتكرا لتكثيف الخلايا الجذعية باستخدام MSC وضع العلامات المغناطيسي والجذب المغناطيسي. وقد ثبت هذا الأسلوب لتشكيل خالية من سقالة يبني 3D عن طريق مزيج من المجاميع مع بعضها البعض للحصول على الأنسجة الغضروفية ملليمتر النطاق ^9. وقد سمح بذر المغناطيسي السقالات سميكة وكبيرة أيضا إمكانية زيادة حجم الأنسجة المهندسة وتصميم شكل بسهولة أكبر فائدة للزرع، وتنويع إمكانية التطبيقات السريرية في إصلاح الغضروف. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول لبذر المغناطيسي للجنة السلامة البحرية في السقالات التي يسهل اختراقها مكونة من السكريات الطبيعية، بولولان، وديكستران، السقالات المستخدمة سابقا لحصر الخلايا الجذعية ^{16 و 17.} كان التمايز مكون للغضروف finallيقوم ذ في مفاعل حيوي لضمان المواد الغذائية المستمرة ونشر الغاز في صلب مصفوفة من السقالات المصنف مع كثافة عالية من الخلايا. وإلى جانب توفير المواد الغذائية، والعوامل المولدة للغضروف النمو، والغاز إلى الخلايا، عرضت مفاعل حيوي التحفيز الميكانيكي. وعموما، فإن التكنولوجيا المغناطيسية المستخدمة لحصر الخلايا الجذعية، جنبا إلى جنب مع نضوج الحيوي في مفاعل حيوي، يمكن أن تحسن بشكل ملحوظ التمايز مكون للغضروف.

Protocol

1. بناء الأجهزة المغناطيسية

ملاحظة: الأجهزة المستخدمة لزرع الخلايا تختلف تبعا لتطبيق (الشكل 1). لتشكيل المجاميع، ويقتصر عدد الخلايا إلى 2.5 × 10 ⁵ / مجموع المباراتين، وبالتالي فإن نصائح المغناطيسية يجب أن تكون رقيقة جدا (750 ميكرون في القطر). البذور 1.8 سم ^2/7 السقالات ملم سميكة، ويجب أن يكون المغناطيس أكبر (3 مليمتر في القطر)، وسوف تضمن الهجرة الخلية من خلال مسام السقالة.

1. بناء جهاز مع المغناطيس الصغيرة للتشكيل الكلي (الشكل 1A)
   1. جعل ثقوب صغيرة مع حفر 0.8 ملم من خلال لوحات الألومنيوم (3 سم وقطرها 6 مم).
   2. إدراج غيض المغناطيسي (750 ميكرون في القطر) في كل حفرة من لوحة.
   3. وضع هذا القرص على المغناطيس النيوديميوم الدائم الذي يضمن مغنطة من التشبع.
2. بناء جهاز لالبذر سقالة ( الشكل 1B)
   1. قطع البوليسترين الثابت إلى 2.4 سم ² الساحات.
   2. إدراج 9 مغناطيس صغير (3 ملم وقطرها 6 مم لونغ) على مسافة متساوية على مساحة 1.6 سم ^_2.
   3. وضع هذا الجهاز على المغناطيس النيوديميوم دائم.

2. الجذعية وسم الخلية

ملاحظة: وصفت الخلايا الجذعية مع 0.1 ملي النانوية المغناطيسية لمدة 30 دقيقة (2.6 ± 0.2 خريج الحديد / خلية) لتشكيل مجاميع، في حين أنها وصفت مع 0.2 ملي النانوية المغناطيسية لمدة 30 دقيقة (5 ± 0.4 خريج الحديد / خلية) البذور السقالات. وقد استخدمت هذه التركيزات جسيمات متناهية الصغر وحضانة مرات سابقا، ونشرت لجنة السلامة البحرية والخلايا الأخرى ^{18 و 19،} وتقرر أن الجسيمات النانوية أثرت ولا خلية حيوية ولا قدرة التمايز MSC. وقد تم قياس كتلة الحديد تأسست من قبل الخلايا الجذعية عن طريق واحد مmagnetophoresis ^{19 و 20} ليرة لبنانية.

1. ثقافة الخلايا البشرية الجذعية الوسيطة (MSC) في كامل الجذعية الوسيطة المتوسطة نمو الخلايا (MSCGM) عند 37 درجة مئوية وCO ₂ 5٪ حتى بالقرب من التقاء (~ 90٪).
2. إعداد وضع العلامات حل المغناطيسي عن طريق خلط 0.1 أو 0.2 ملي maghemite المغلفة سترات أكسيد الحديد (γFe ₂ O _3؛ الأساسية: 8 نانومتر القطر) في وسط 5A مكوي وخالية من المصل تعديل في معهد الحديقة التذكارية روزويل (RMPI) دون الجلوتامين وتحتوي على 5 ملي سيترات الصوديوم.
3. تجاهل المتوسطة، وشطف الخلايا مع المصل خالية RPMI المتوسطة دون الجلوتامين، وإضافة 10 مل من الحديد الحل أكسيد جسيمات متناهية الصغر في 150 سم ² قارورة الثقافة، الحد الأدنى للحجم المطلوب لتغطية جميع الخلايا.
4. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و CO ₂ 5٪ ثم تجاهل الحل جسيمات متناهية الصغر. شطف لمدة 5 دقائق مع خالية من المصل RPMI المتوسطة دون الجلوتامين لاستيعاب نانoparticles لا تزال تعلق على غشاء البلازما.
5. تجاهل المتوسطة RPMI وإضافة 25 مل من المتوسط ​​MSCGM الكامل في قارورة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.

3. المغناطيسي البذر الخلية

1. طازجة إعداد المتوسطة المولدة للغضروف باستخدام Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) ارتفاع نسبة الجلوكوز مع L-الجلوتامين بإضافة 50 ميكرومتر حمض L-الاسكوربيك 2-فوسفات و 0.1 ميكرومتر ديكساميثازون، 1 ملم البيروفات الصوديوم، 0.35 مم L-البرولين والثقافة العالمية 1٪ ملحق يحتوي على الأنسولين، ترانسفيرين الإنسان وحمض selenous (ITS-بريمكس)، و 10 نانوغرام / مل النمو التحويلي عامل بيتا 3 (TGF-β3).
2. فصل الخلايا المغناطيسية باستخدام 8 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA لكل 150 سم ² الثقافة قارورة وأجهزة الطرد المركزي الخلايا فصل في 260 × ز لمدة 5 دقائق. نضح المتوسطة وعدد الخلايا مع وقف التنفيذ إعادة.
3. وضع طبق بتري زراعة الخلايا القاع الزجاجي (35 ملم) على رأس كل من الأجهزة المغناطيسية.
4. إلى mتشكيل agnetically المجاميع، وإضافة 3 مل من المتوسط مكون للغضروف إلى طبق بتري وبلطف إيداع أصغر حجم ممكن (لا يزيد عن 8 ميكرولتر) تحتوي على 2.5 × 10 ⁵ الخلايا المسمى في مجموع المباراتين (ما يصل الى 16 المجاميع يمكن أن تودع). ترك طبق بيتري لمدة 20-30 دقيقة دون نقله، والسماح لها لتشكيل الأجسام الشبه الكروية، ثم ضع الجهاز كاملة، بما في ذلك طبق بتري تحتوي على 16 المجاميع، في حاضنة عند 37 درجة مئوية وCO ₂ 5٪.
5. المجاميع تحكم النموذج باتباع نفس البروتوكول واستبدال المتوسطة كاملة مع المتوسطة المولدة للغضروف بدون TGF-β3.
   1. لتوليد مجموعها بناء 3D، ضع 2 المجاميع على اتصال في يوم 8 إلى تشكيل 8 الحلل، والشروع في الانصهار. في يوم 11، ودمج 2 الحلل لتشكيل 4 تواءم. وأخيرا، صهر 4 تواءم في يوم 15 للحصول على الهيكل النهائي.
   2. وفي الوقت نفسه، تشكل الحصى بواسطة الطرد المركزي 2.5 × 10 ⁵ وصفت الخلايا الجذعية في 26015؛ ز لمدة 5 دقائق في 15 مل الأنابيب مع 1.5 مل من المتوسط ​​مكون للغضروف مع أو بدون TGF-β3 (لعينة والسيطرة على التوالي).
6. لمغناطيسيا السقالات البذور، ووضع كل سقالة المجفف في طبق بتري. استخدام السكاريد السقالات مسامية مصنوعة من بولولان / ديكستران ^21. لكل سقالة، وتمييع 2 × 10 ⁶ خلايا الجذعية المسمى في 350 ميكرولتر من المتوسطة المولدة للغضروف بدون TGF-β3 وبعناية ماصة الخلايا على منصة الاعدام.
   1. احتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية للسماح لاختراق خلية كاملة داخل سقالة ثم إضافة بلطف 3 مل من المتوسط ​​مكون للغضروف مع أو بدون TGF-β3 (لعينة أو السيطرة، على التوالي) إلى طبق بيتري.
   2. احتضان سقالة cellularized على جهازها المغناطيسي عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ لمدة 4 أيام للسماح للهجرة الخلايا من خلال المسام سقالة والحبس.
7. وفي الوقت نفسه، البذور السقالات مع 2 × 10 ⁶ الخلايا الجذعية المسمى باتباع نفس الطريقة واحتضان دون المغناطيس للحصول على السقالات المصنفة موحد كما الضوابط الإيجابية.

4. التمايز إلى غضروفية

ملاحظة: بعد 4 أيام من الحضانة، وإزالة المغناطيس ومواصلة النضج مكون للغضروف إما في طبق بتري (شروط ثابتة) أو في مفاعل حيوي (الظروف الديناميكية). ونضجت عينات السيطرة السلبية في ظروف ثابتة مع المتوسطة المولدة للغضروف بدون TGF-β3.

1. في ظروف ثابتة، والحفاظ على السقالات cellularized أو المجاميع في نفس طبق بيتري. تغيير المتوسطة المولدة للغضروف مرتين في الأسبوع لمدة 21 يوما.
2. في الظروف الديناميكية، وإعداد مفاعل حيوي.
   1. قطع أنابيب السيليكون في الطول المناسب وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   2. الأوتوكلاف جميع المواد: 500 مل غرفة الثقافة، وأنابيب، الدوارات 2-الطريقة، وأقفاص.
   3. وضع أجزاء مفاعل حيوي في microbio معقم محطة سلامة المنطقية. قم بتوصيل أنابيب إلى 2 في اتجاه والدوارات وإلى غرفة الثقافة باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
   4. نقل بعناية السقالات cellularized في أقفاص تعقيمها باستخدام ملعقة معقمة. ضع 2 السقالات في قفص. عندما أقفاص جاهزة، إدراجها في إبر من غطاء لمنعهم من التحرك خلال مزيد من التناوب. تملأ الغرفة الثقافة مع المتوسطة المولدة للغضروف وإغلاقه مع غطاء تحتوي على أقفاص.
3. بدوره على مضخة تحوي لملء الأنابيب مع المتوسطة المولدة للغضروف والقضاء على فقاعات الهواء.
4. وضع وتأمين غرفة شغل في السيارات من مفاعل حيوي وتشغيل الكمبيوتر، والتي تسيطر على تناوب كل من الذراع ومن الغرفة.
5. تطبيق سرعة دوران من 5 التناوب في الدقيقة (دورة في الدقيقة) على كل من الذراع والغرفة. ضبط مضخة تحوي بمعدل تدفق 10 دورة في الدقيقة لتغذية مستمرة من السقالات cellularized.

الحمار = "jove_title"> 5. استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل التعبير الجيني

ملاحظة: قبل استخراج الحمض النووي الريبي، هضم السقالات مع حل الأنزيمية.

1. إعداد 1 مل من محلول الأنزيمية وذلك بإضافة 100 ميكرولتر من pullulanase (40 U / مل) و 50 ميكرولتر من دكستراناز (60 ملغ / مل) إلى 850 مل من مصل خالية DMEM المتوسطة.
2. شطف السقالات مرتين مع المصل خالية DMEM المتوسطة، تجاهل المتوسطة، وإضافة 800 ميكرولتر من الحل الأنزيمي في السقالة. احتضان لمدة 15-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت الإثارة لطيف.
3. عندما يذوب السقالة تماما، ونقل محلول يحتوي على خلايا لأنبوب 1.5 مل، أجهزة الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة، ونضح بعناية المتوسطة، وشطف مرتين مع العقيمة 1 × الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 10 دقيقة، وإعادة تعليق الخلايا في حل RNA العزلة.
4. لاستخراج الحمض النووي الريبي من المجاميع، ووضع الكروية في حل RNA العزلة وسحقهم تماما باستخدام الخالط قبل تنفيذ استخراج الحمض النووي الريبي.
5. عزل الحمض النووي الريبي باستخدام طقم لمجموع استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
6. توليف الحمض النووي مكملة من 400 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام الناسخ العكسي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، وذلك باستخدام 250 نانوغرام الاشعال عشوائية، 1 ميكرولتر من مزيج dNTP (10 ملم لكل منهما)، و 40 U / مل ريبونوكلياز المانع. الحجم النهائي من التفاعل 20 ميكرولتر. في نهاية التفاعل، إضافة 80 ميكرولتر من الماء المقطر للحصول على الحجم النهائي من 100 ميكرولتر.
7. لالكمي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، واستخدام مزيج PCR التي تحتوي على كاشف الفلورسنت لقياس التعبير النسبي للجينات الفائدة، مثل aggrecan (AGC) والكولاجين II (العقيد II)، مع 10 × المخفف [كدنا]. تطبيع مستويات التعبير الجيني مع بروتين خاص بالريبوسوم الجين المرجعية، كبير، P0 (RPLP0). إجراء العمليات الحسابية مع 2 ^- صيغة ^ΔΔCTحيث ΔΔCT = ΔCT من حالة متباينة - يعني ΔCT من حالة السيطرة، وكل ΔCT يمثل CT من الجينات في المصالح - وCT من الجين المرجعية (RPLP0).
8. تحديد القياسات الإحصائية كما ± القيم يعني الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM). إجراء تحليل مع ن ≥ 2 تجارب مستقلة. استخدام اختبار t الطالب على تحليل فروق ذات دلالة إحصائية بين الكريات طرد واندماج المغناطيسي (* ف <0.05). تحديد أهمية مع اختبار كروسكال واليس (في اتجاه واحد ANOVA امتثابت) لتحليل فروق ذات دلالة إحصائية بين السقالات متباينة، ومع سقالة التحكم (* ف <0.05).

6. تحليل النسيجي

1. شطف السقالات cellularized أو المجاميع مع معقم 1 × PBS، اصلاحها في 10٪ من محلول الفورمالين لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، وشطف مع 1 × PBS.
2. إزالة PBS، تضمين العينات في cuttin الأمثلز درجة حرارة مجمع (أكتوبر)، وتجميدها في حمام نظير البنتان مغمورة في النيتروجين السائل. تخزين العينة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية. قطع العينات مع ناظم البرد الحصول على cryosections 8 ميكرون وحدات لأو 12 ميكرون لالسقالات cellularized.
3. وصمة عار في cryosections مع 0.5٪ طولويدين حل الأزرق لمدة 2 دقيقة ثم يشطف في ماء الصنبور، يذوى مع الإيثانول بنسبة 100٪، وتوضيح باستخدام التولوين، وتركيب الشرائح مع وسيلة متزايدة لالمجهر الضوئي.

النتائج

أولا، وحدات يمكن تشكيلها على حدة باستخدام المغناطيس الصغيرة عن طريق إيداع 2.5 × 10 ⁵ الخلايا الجذعية المسمى (الشكل 2A). هذه المجاميع واحدة (~ 0.8 مم في الحجم) ويمكن بعد ذلك أن تنصهر في الهياكل أكبر بفضل متتابعة، والانصهار الناجم مغناطيسيا. عل...

Discussion

أولا، لأن التقنيات المعروضة هنا تعتمد على استيعاب النانوية المغناطيسية، وقضية واحدة مهمة هي نتائج النانوية بمجرد توطين داخل الخلايا. صحيح أن جزيئات الحديد قد يؤدي السمية المحتملة أو ضعف القدرة على التمايز اعتمادا على حجمها، والطلاء، ووقت التعرض ^{19 و<...}

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Iron oxide (maghemite) nanoparticules (γ-Fe2O3)	PHENIX - University Paris 6	Made and given by C. Ménager	Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge
Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds	LIOAD - University Nantes	Made and given by C. Le Visage	Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10 M NaOH). Porosity: 185-205 µm; Thickness: 7 mm; Surface area: 1.8 cm2.
TisXell Regeneration System	QuinXell Technologies	QX900-002	Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber
Cage for scaffolds: Histosette II M492	VWR	720-0909
Mesenchymal Stem Cell (MSC)	Lonza	PT-2501	Three independant batches have been used
MSCGM BulletKit medium	Lonza	PT-3001	For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium
DMEM with Glutamax I	Life Technologies	31966-021	No sodium pyruvate, no HEPES
RPMI medium 1640, no Glutamine	Life Technologies	31870-025	No sodium pyruvate, no HEPES
PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2	Life Technologies	14190-094
0.05% Trypsin-EDTA (1x)	Life Technologies	25300-054
Penicillin (10,000 U/mL) / Streptomycin (10,000 µg/mL)	Life Technologies	15140-122
ITS Premix Universal Culture Supplement (20x)	Corning	354352
Sodium pyruvate solution 100 mM	Sigma	S8636
L-Ascorbic Acid 2-phosphate	Sigma	A8960	Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously
L-Proline	Sigma	P5607	Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Dexamethasone	Sigma	D4902	Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20 °C
TGF-beta 3 protein 10 µg	Interchim	30R-AT028
Tri-sodium citrate	VWR	33615.268	Prepare the 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4 °C
Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus	Sigma	P2986
Dextranase from Chaetomium erraticum	Sigma	D0443
NucleoSpin RNA Extraction Kit	Macherey-Nagel	740955.5
SuperScript II Reverse Transcriptase	Life Technologies	18064-014
Random Primer - Hexamer	Promega	C1181	500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample
Recombinant RNAs in ribonuclease inhibitor	Promega	N2511	40 U/µL: put 1 µL per sample
PCR nucleotide dNTP mix (10 mM each)	Roche	10842321
SyBr Green PCR Master Mix	Life Technologies	4368708
Step One Plus Real-Time PCR System	Life Technologies	4381792
Formalin solution 10% neutral buffered	Sigma	HT5012
OCT solution	VWR	361603E
Isopentane	Sigma	M32631
Toluidine blue O	VWR	1.15930.0025
Ethanol absolute	VWR	20821.310
Toluene	VWR	1.08323.1000
Mounting medium Pertex	Histolab	840
RPLP0 Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3'; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3'
Aggrecan Primer for qPCR	Eurogentec		5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3'; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'
Collagen II Primer for qPCR	Eurogentec		5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3'; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'