الكمي للسلوك الاستمالة ذبابة الفاكهة

Summary

يصف هذا البروتوكول تقنية التحجيم الفردي الاستجالة قابلة للتحلل في ذبابة الفاكهة التي تعطي بيانات قوية، كمية لقياس السلوك الاستمالة. ويستند هذا الأسلوب على مقارنة الفرق في تراكم الصبغة على جثث الحيوانات غير مستعد مقابل الحيوانات على مدى فترة محددة من الزمن.

Abstract

سلوك الاستمالة ذبابة الفاكهة هو برنامج حركي متعدد الخطوات المعقدة التي تتطلب حركة منسقة من كل من الأفرع و هيندليغس. هنا نقدم بروتوكول الفحص الاستمالة وتصميم غرفة الرواية التي هي فعالة من حيث التكلفة وقابلة للدراسات الصغيرة أو الكبيرة على نطاق واسع من الاستمالة ذبابة الفاكهة . يتم غبار الذباب في جميع أنحاء الجسم مع صبغ أصفر باهر وإعطاء الوقت لإزالة الصبغة من أجسادهم داخل الغرفة. ثم تودع الذباب في حجم مجموعة من الإيثانول لذوبان الصبغة. يتم قياس وتسجيل الامتصاصية الطيفية النسبية لعينات الصبغة الإيثانول للحيوانات المستعد مقابل الحيوانات غير المستغلة. بروتوكول ينتج بيانات كمية من تراكم الصبغة للذباب الفردية، والتي يمكن بسهولة متوسط ​​ومقارنة عبر العينات. وهذا يسمح التصاميم التجريبية لتقييم بسهولة القدرة الاستمالة للدراسات الحيوانية متحولة أو التلاعب الدائرة. هذا الإجراء الفعال على حد سواء تنوعا وقابلة للتطوير. نظهر wأورك تدفق البروتوكول والبيانات المقارنة بين الحيوانات وت الحيوانات المتحولة لنوع ذبابة الفاكهة I مستقبلات الدوبامين ( دوبر ).

Introduction

الاستمالة في ذبابة الفاكهة ميلانوغاستر ( D. ميلانوغاستر ) هو السلوك الفطري قوية التي تنطوي على تنسيق برامج المحركات المستقلة متعددة ¹ . الفاكهة الذباب تنظيف أجسادهم من الغبار والميكروبات، ومسببات الأمراض الأخرى التي يمكن أن تمنع وظيفة فسيولوجية طبيعية مثل الرؤية والطيران، أو تؤدي إلى تحديات مناعية كبيرة. في الاستشعار والاستجابة لكل من الميكانيكية ² والتنشيط المناعي ³ ، الذباب تتكاثر ساقيه بشكل متكرر أو على منطقة الجسم المستهدف حتى أنها نظيفة بما فيه الكفاية والاستمالة تقدم إلى جزء آخر من الجسم. الذباب أداء الحركات الاستمالة في نوبات متميزة التي تحدث إلى حد كبير في أنماط نمطية ^{1 ، 4} . ويظهر التسلسل الهرمي السلوكي كما يتم إعطاء الأولوية لإشارات التهيأ. وقد تم تحديد الدوائر وأنماط النشاط في دعم oفا نموذج أن برامج الاستمالة في الجزء العلوي من التسلسل الهرمي تحدث أولا وقمع إشارات موازية من مناطق الجسم التي يتم إعدادها في وقت لاحق ⁵ . وتعطى أولوية قصوى للرأس، ثم البطن، والأجنحة، وأخيرا الصدر ⁵ .

برنامج الاستمالة في D. ميلانوغاستر هو نظام مثالي لدراسة الدوائر العصبية، والإشارات الجزيئية مودولاتوري، والناقلات العصبية. على سبيل المثال، حل وسط من وظيفة النيوروفيبرومين ⁶ ، وفقدان ذبابة الفاكهة هشة X التخلف العقلي البروتين ( dfmr1 ) ⁷ ، والتعرض لالبسفينول A (ببا) ⁸ كل سبب الاستمالة المفرطة والسلوكيات الأخرى التي هي مماثلة لأعراض بشرية منفصلة من الورم العصبي الليفي، والمتلازمة، وجوانب اضطرابات طيف التوحد واضطراب فرط الحركة ونقص الانتباه (أدهد)، على التوالي. السلوك الاستمالة يمكن أيضا أن يكون هابيتواتيد تفاضليا عبر سلالات متحولة ² ، والإقراض هذا البرنامج الحركي لدراسات اللدونة السلوكية. اتساع الظواهر العصبية التي يمكن أن تكون نموذجا من قبل ذبابة الفاكهة يتطلب نهجا مقارنة جديدة لقياس قدرة الذباب على العريس أنفسهم.

وقد تبين العمل المشترك من الناقلين أحادي الأمين الحويصلة وفرة النسبية من الدوبامين والأمينات الحيوية الأخرى في الجسم للتوسط ذبابة الفاكهة السلوك الاستمالة ^{9 ، 10} . أوكتوبامين والدوبامين تحفز نشاط الاستمالة هيندليغ مماثلة في الذباب ديكابيتاتد، في حين أن تيرامين، السلائف من أوكتوبامين، يؤدي أيضا الاستمالة إلى حد أقل ⁷ . تم التعرف على أربعة مستقبلات الدوبامين في D. ميلانوغاستر ^{11 ، 12 ، 13 ، 14} . باستخدام طريقة الفحص الاستمالة وصفها في هذا البروتوكول، قررنا دورا لنوع الأول دوبامين الأسرة مستقبلات دوبر ( دوبر، DDA1، البكم ) في السلوك الاستمالة هيندليغ ¹⁵ .

الاستمالة يمكن أن يكون كميا بشكل غير مباشر من خلال النظر في مدى النظافة التي الحيوان يمكن أن العريس تماما بعد غبار الجسم كله مع صبغ علامة أو غبار الفلورسنت ^{5 ، 16} . ما تبقى من الغبار اليسار على الجسم يمكن أن تستخدم علامة النسبية للسلوك العام. الذباب الغبار بعد إعطاء الوقت الكافي للعريس قد يظهر عجزا محددا في سلوك الاستمالة. كما أصبحت الاستمالة التحقيقات أكثر اتساعا، وأدرجت بروتوكولات مثل ممارسات قطع الرأس لإضافة العلاجات الدوائية على الرقبة الأعصاب الضامة ¹⁰ ، التحفيز عن طريق اللمس من شعيرات لانتزاع استجابة الاستمالة ² ،وتسجيل الفيديو من السلوك ¹⁵ . الملاحظة المباشرة من الاستمالة يمكن دراستها بسهولة باستخدام المراقبة البصرية وتسجيل يدويا وتيرة ومدة الأحداث الاستمالة محددة ⁴ .

قمنا بتصميم غرفة الاستمالة خمسة عشر جيدا التي يمكن بناؤها مع طابعة 3D أو الليزر القاطع، وتصاميم المخطط متوفرة للاستنساخ ¹⁵ . تصميم يستخدم اثنين من لوحات الوسطى انضم مع فتحات المتطابقة وفصلها عن طريق شبكة واثنين من انزلاق لوحات أعلى وأسفل إضافية، والتي يتم تحميل الذباب و / أو الصبغة، على التوالي. بعد السماح للذباب الذباب الوقت العريس، ونحن إيداعها في الإيثانول لذوبان الصبغة وقياس امتصاص هذا الحل في الطول الموجي للصبغة. قارئ لوحة يمكن استخدامها لعينات موازية متعددة أو مقياس واحد قراءة يمكن استخدامها لعينات الفردية. هذا الأسلوب يقلل من الخطأ الناجم عن المناولة و آلانخفاض مستويات المقايسات التي يتم تشغيلها على نطاق أصغر، وكفاءة من حيث التكلفة. يتم اشتقاق هذه الطريقة وتعديلها من أساليب رائدة من قبل جولي سيمبسون وأندرو البذور، الذين يستخدمون غرف الاستمالة أكبر مع عناصر التدفئة لدرجات الحرارة الحساسة التلاعب ⁵ . بروتوكول التالية يعرض الكمي من الاستمالة من الجسم كله، فضلا عن عرض أساليب بديلة لكميات تراكم الصبغة على أجزاء الجسم الفردية. كما نقدم عينة من بيانات المقارنة بين المسوخ وت ودوبر ، وكذلك طرق لحساب مؤشر أداء بسيط لسلوك الاستمالة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد

1. إعداد الشافطة لتحريك ذبابة الفاكهة الحية من قارورة ثقافة إلى غرفة الاستمالة. تسمح الشافطات بنقل الحيوانات الواعية إلى الغرف السلوكية للتأكد من أن التخدير لا يؤثر على الملاحظة السلوكية اللاحقة.
   1. باستخدام مقص قطع 1.5 قدم من تيغون معرف الأنابيب ⅛ "، أود ¼". خفض 1 بوصة على الأقل قبالة غيض من 1 مل طرف المتاح ميكروبيبيت. عقد قطعة 1 سم مربع من شبكة (افتتاح 0.196 بوصة) على طرف قطع.
      ملاحظة: معظم النصائح 1mL لديها خط تدرج حيث يجلس طرف في مربع حزمة، عادة قطع إلى هذا الخط.
   2. وضع مكان الطازجة 1 مل طرف ميكروبيبيت على شبكة / قطع طرف. مراقبة شبكة شكل حاجز ضيق بين النصائح اثنين. داخل الطرف الجديد يخلق غرفة القابضة للذباب.
   3. قطع طرف المدقع من طرف ميكروبيبيت جديدة لتوسيع افتتاح ما يكفي للسماح مرور ذبابة واحدة. هولe سوف تتطابق تقريبا مع افتتاح غرفة الاستمالة (حوالي 1.5-2 ملم في القطر).
   4. تناسب بسهولة نصائح متداخلة على نهاية أنابيب تيغون. دفع النصائح في أنبوب لضمان تناسب ضيق للسماح للضغط فراغ.
   5. على الطرف الآخر من الأنابيب، وقطع غيض من طرف ميكروبيبيت 200 ميكرولتر وتناسب نهاية قطع ضيق في الأنابيب. هذا هو الجانب "الفم" من الشافطة.
2. إعداد أنابيب قسامة الغبار. تزن حوالي 5 ملغ من الصبغة الصفراء الرائعة على ورقة وزنها تاريد. صب الغبار في أنبوب ميكروسنتريفوج 0.6 مل وإغلاق بإحكام الغطاء.
   ملاحظة: ننصح باستخدام قفازات النتريل خلال إعداد قسامة، وبعض قفازات اللاتكس نفاذية للصبغة.
3. كرر الخطوة 1.2) لجميع العينات في التجربة (واحد لكل ذبابة في كل غرفة).
4. إعداد الإيثانول (إتوه) أنابيب: الماصة 1 مل من إتوه 100٪ إلى 1.5 مل أنابيب ميكروسنتريفوج. أنابيب التسمية للأنماط الجينية أو الشروط.
5. كرر الخطوة 1.4) لجميع العينات في التجربة (واحد لكل ذبابة في كل غرفة). كاب وحفظ أنابيب إتوه لاستكمال الفحص الاستمالة. وتشمل أيضا على الأقل واحد "فارغ" العينة التي ستكون فقط 1 مل إتوه دون ذبابة للضوابط السلبية.
6. تجميع كل غرفة الاستمالة عن طريق ثقب لوحة أعلى انزلاق (مع الثقوب الصغيرة) ولكن ترك لوحة أسفل (مع الثقوب الكبيرة) إزالتها لإضافة الغبار.
7. وضع كل غرفة الاستمالة اللازمة شقة على طاولة مع الوجه العلوي إلى أسفل. الجانب دخول يطير هو الوجه لأسفل.
8. تحميل 5 ملغ الرائعة أصفر قسامة صبغ في كل غرفة من خلال الاستفادة من أنبوب ضد سطح الغرفة فوق المطلوب بشكل جيد. اضغط على غرفة ضد الطاولة للتأكد من أن كل من الغبار يقع من خلال شبكة إلى لوحة أعلى.
9. برغي لوحة أسفل على كل غرفة بحيث أن نهايات أوسع من فتحات المخروطية تواجه الخارج والثقوب لا تبقي على الآبار. تأمين بوتلوحة توم بإحكام بحيث لا تنزلق والافراج عن صبغ.
10. الوجه الغرفة على وضربها مسطحة ضد طاولة عدة مرات بحيث الغبار يسقط من خلال شبكة للراحة على لوحة أسفل.
11. حرك لوحة أعلى من الغرفة في "موقف فتح" بحيث الثقوب الصغيرة محاذاة مع خمسة عشر بئرا، والسماح لإدخال الذباب في الآبار الفردية.

2. يطير والغبار والاستمالة

1. تحميل واحد يطير في الشافطة الفم عن طريق امتصاص بلطف من خلال نهاية واحدة من الشافطة كما لو كان استخدام القش. إيداع الذباب عن طريق تهب طفيفة وتوجيه الانفتاح نحو الهدف.
2. نضح ذبابة واحدة في كل بئر تستخدم لهذه التجربة. بعد تحميل بئر، الشريحة أعلى لوحة بحيث يتم المحاصرين في الطاير ووضع شريط على افتتاح ذلك جيدا أثناء تحميل الغرفة بأكملها لمنع الهروب يطير أثناء تحميل الآبار الأخرى. إذا يتم استنشاق الذباب متعددة إلى سينغلحسنا، اترك هذا الافتتاح مكشوفا حتى لا يبقى سوى ذبابة واحدة.
3. بعد كل الآبار اللازمة مليئة الذباب، الوجه الغرفة بحيث لوحة أسفل هو أعلى بحيث الغبار لديه القدرة على معطف الذباب عن طريق السقوط من خلال شبكة.
4. تأمين بإحكام لوحات أعلى وأسفل عن طريق تشديد مسامير، ودوامة الغرفة لغبار الذباب لمدة 4 ثوان.
5. ضرب الغرفة (أعلى لوحة واجهت) ضد طاولة مرتين بحيث الصبغة تقع من خلال إلى الجانب الآخر. ثم، الوجه الغرفة على (أعلى لوحة الوجه متابعة) وتدق الغرفة مرتين لضمان صبغ يستقر على الأرض من الغرفة السفلى بعيدا عن الطاير الذي عقد في الغرفة العليا.
6. لذباب السيطرة التي لا يسمح للعريس، انتقل فورا إلى الخطوة 3 من البروتوكول. بالنسبة للذباب التي ستكمل الفحص، انتقل إلى الخطوة 2.7.
7. بقية غرفة شقة على طاولة أو كونترتوب مع لوحة أعلى التصاعدي لمدة ثلاثين دقيقة للسماح للذباب العريس. وضع تشامبإيه في مساحة خالية من الضوضاء والاهتزاز للحفاظ على البيئة الخاصة بك ثابتة لجميع التجارب الاستمالة (مستويات الإضاءة والرطوبة ودرجة الحرارة). حاضنة الطاولة في رت أو 25 درجة مئوية مع ضوابط الرطوبة مثالية.

3. إعداد العينات وتحليل الامتصاص

1. الحفاظ على مستوى الغرفة مع أعلى لوحة صعودا، وفك بلطف أسفل لوحة وإزالته من الغرفة، مع الحرص على عدم فقدان صبغ.
2. وضع الغرفة على لوحة ذبابة كو ₂ مع تدفق الهواء المنخفض حتى يتم تخدير الذباب.
3. فك اللوحة العلوية من الغرفة. استخدام ملقط بعناية لانتزاع الساق ونقل ذبابة غبار واحد من كل غرفة وإيداعه في أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل تحتوي على إتوه. الوقت نقل لمدة 15 غرفة كل تحتوي على ذبابة واحدة حوالي 3-5 دقيقة. يجب أن يجرب المجارب في أوقات النقل إذا / عندما تجارب مذهلة مع غرف متعددة لضمان كفاءة انطلاق التجارب.
4. مرة واحدة كل أنبوب ميكروسنتريفوج يحتوي على 1 يطير، أغلق الغطاء وعكس الأنبوب ثلاث مرات لتحريض وتخلط الحل من الصبغة والإيثانول.
5. احتضان أنابيب تحتوي على الإيثانول والذباب لمدة 5 ساعات في رت لضمان الإزالة الكاملة للصبغة من الطاير إلى حل. بعد 5 ساعة، ودوامة لفترة وجيزة كل أنبوب (2 ق) لضمان إزالة الصبغة من الذباب.
6. قسامة 50 ميكرولتر من أنبوب 1.5 مل التجريبية في بئر من لوحة 96 جيدا إذا كانت متوفرة، مع الأخذ في الحسبان من موقع كل عينة على لوحة. إضافة 200 ميكرولتر من إتوه لتمييع العينة 5X. التخفيف يخفف آثار السقف من الذباب غبار بشدة أو عيوب الاستمالة الكبيرة.
7. استخدام قارئ لوحة لتحليل كل عينة في 397 نانومتر. بدلا من ذلك، قياس الامتصاصية للعينات الفردية والفراغات على مقياس الطيف القياسية في الطيف المرئي إذا كان قارئ لوحة غير متوفر.
8. قراءة وتسجيل العينة من خلال القارئ لوحة وحفظ جدول البيانات مع السجلd عينات على لوحة.

4 - التحديد الكمي للنتائج

1. تجميع النتائج لجميع العينات وقياس التباين لكل النمط الوراثي أو الشرط.
   ملاحظة: تراكم صبغ في الوقت 0 دقيقة وفي الوقت المحدد 30 دقيقة تعتبر شروط منفصلة باستخدام التحليل الإحصائي عن طريق اتجاه واحد أنوفا وتصحيح بونفيروني أو تصحيحات أخرى لمقارنات متوازية متعددة.
2. حساب الفرق نسبة الاستمالة لكل النمط الوراثي / حالة باستخدام المعادلة التالية: [(الصبغة تراكم متوسط ​​القيمة في الوقت 0 '- تراكم الصبغة يعني القيمة في الوقت 30') / تراكم الصبغة يعني القيمة في الوقت 0] × 100.
3. التعبير عن النسبة المئوية لكل النمط الجيني والحالة في مؤامرات شريط ومقارنة عبر الأنماط الجينية والظروف.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

اختبار الاستمالة ينتج بيانات كمية لتقييم الأداء السلوكي على أساس المتبقية النسبية من الصبغة المتراكمة المتبقية على أجسام الذباب بعد وقت محدد من القياس للاستمالة (30 دقيقة). يتم تسليط الضوء على الصور عينة من انزلاق تصميم غرفة الاستمالة والخطوات الرئ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

المقايسة هي واضحة نسبيا، ولكننا نحرص المجربين على إيلاء اهتمام خاص إلى القضايا التالية. الحفاظ على ختم ضيق عن طريق تشديد مسامير على أعلى وأسفل لوحات بعد إدخال الذباب وصبغ ضروري للنتائج استنساخه. الصبغة الصفراء الرائعة هي غرامة جدا والمفاصل فضفاضة تسمح خسائر الصبغة ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
High-Flex Tygon PVC Clear Tubing	McMaster-Carr	5229K54	ID 1/8", OD 1/4", used with micropipettor tips and mesh to construct mouth aspirators
Micropipette tips (1 mL and 200 μL)	Genesee Scientific	24-165, 24-150R
Nylon Mesh Screen, 2 x 2.6"	McMaster-Carr	9318T44	Used to construct grooming chamber and mouth aspirators
Dumont #5 Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS-5050
Brilliant Yellow Dye	Sigma-Aldrich	201375-25G	we recommend use of nitrile gloves while handling this product
Vortexer	Fisher Scientific	12-812	set to "touch"
Ethanol	Carolina Biological Supply	86-1282
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR International	10025-726
0.65 mL microcentrifuge tubes	VWR International	20170-293	tubes can be reused with successive assays
UV 96-well plate	Corning	26014017
BioTek Synergy HTX Platereader	BioTek	need to download catalog to access product number	http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy_htx_multimode_microplate_reader.html?tab=overview
Gen5 Microplate Reader and Imager Software	BioTek
Microsoft Excel	Microsoft		https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400?tduid=(65d098c0e83b86c952bdff5b0719c83f)(256380)(2459594)(SRi0yYDlqd0-LI..ql4M2LoZBEhcBljvIA)()
Drosophila Incubator	Tritech	DT2-CIRC-TK
1/4" acrylic plastic	McMaster-Carr	8473K341
8 - 32 nuts	McMaster-Carr	90257A009
8 - 32 x 1" hex cap screws	McMaster-Carr	92185A199	the bottom plate needs to be tapped for this size screw
8 - 32 x 1/2" hex cap screws	McMaster-Carr	92185A194	the second plate from the top needs to be tapped
2 - 56 3/8" flat head phillips machine screws	McMaster-Carr	91500A088	these hold the two middle plates together
0.175" ID, 1/4" OD, 0.34" aluminum pipe	McMaster-Carr	92510A044	Manufactured in-house; product listed is approximately the same dimensions and should work for size 8 screws.  These act as sheaths for the 1" screws and set the hex cap up slightly from the surface of the top plate