JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا، ونحن بالتفصيل طريقة S تساوي P سورلين كروسلينكد، L إيغاتد، و S المنتخبة H الهجينة (سبلاش)، والتي تمكن رسم الخرائط على نطاق الجينوم التفاعلات داخل الجزيئات وبين الجزيئات رنا-رنا في الجسم الحي . سبلاش يمكن تطبيقها لدراسة رنا تفاعلات الكائنات الحية بما في ذلك الخميرة والبكتيريا والبشر.

Abstract

معرفة كيفية تفاعل الحمض النووي الريبي مع أنفسهم ومع الآخرين هو المفتاح لفهم تنظيم الجينات رنا على أساس في الخلية. في حين أظهرت أمثلة على التفاعلات الحمض النووي الريبي رنا مثل التفاعلات الرنا الميكروي-مرنا لتنظيم التعبير الجيني، والمدى الكامل لتفاعلات الحمض النووي الريبي تحدث في الخلية لا يزال مجهولا. الأساليب السابقة لدراسة التفاعلات الحمض النووي الريبي ركزت في المقام الأول على مجموعات فرعية من الحمض النووي الريبي التي تتفاعل مع بروتين معين أو أنواع الحمض النووي الريبي. هنا، ونحن بالتفصيل طريقة اسمها S تساوي P سورلين كروسلينكد، L إيغاتد، و S المنتخبة H الهجين (سبلاش) التي تسمح التقاط الجينوم واسعة من التفاعلات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي بطريقة غير منحازة. سبلاش يستخدم في الجسم الحي كروسلينكينغ، ربط القرب، وارتفاع تسلسل الإنتاجية لتحديد الجزيئات داخل الجزيئات و بين الجزيئات شركاء الاقتران على الصعيد العالمي. سبلاش يمكن تطبيقها على الكائنات الحية المختلفة بما في ذلك البكتيريا والخميرة والخلايا البشرية، وكذلكs الظروف الخلوية المتنوعة لتسهيل فهم ديناميات منظمة رنا تحت السياقات الخلوية المتنوعة. كامل بروتوكول سبلاش التجريبية يستغرق حوالي 5 أيام لإكمال وسير العمل الحسابي يستغرق حوالي 7 أيام لإكمال.

Introduction

دراسة كيفية جزيئات أضعاف وتفاعل مع بعضها البعض هو المفتاح لفهم تنظيم الجينات في الخلية. في حين تم تركيز الكثير من الجهد في العقد الماضي على فهم كيفية مساهمة الحمض النووي والبروتينات في تنظيم الجينات، أقل نسبيا هو معروف عن تنظيم ما بعد النسخي التعبير الجيني. الحمض النووي الريبي يحمل المعلومات في كل من تسلسلها الخطي وفي هيكلها الثانوي والثالث 1 . قدرتها على قاعدة الزوج مع نفسها ومع الآخرين مهم لوظيفتها في الجسم الحي . وقد وفرت التطورات الأخيرة في إنتاجية عالية رنا التحقيق هيكل الثانوي رؤى قيمة في مواقع المناطق مزدوجة ومفردة الذين تقطعت بهم السبل في ترانسكريبتوم 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، هاولا تزال المعلومات المتعلقة بشركاء التفاعل المقترن مفقودة إلى حد كبير. لتحديد تسلسل الحمض النووي الريبي الذي يتفاعل مع منطقة رنا أخرى في ترانسكريبتوم، نحن بحاجة إلى المعلومات العالمية الحكمة.

إن رسم خرائط تفاعلات الحمض الريبي النووي (رنا) بين الزوجين بطريقة عالمية وغير منحازة كان تقليديا تحديا كبيرا. في حين أن النهج السابقة، مثل كلاش 9 ، هيكليب 10 و راب 11 ، وتستخدم لتحديد تفاعلات الحمض النووي الريبي على نطاق واسع، وهذه التقنيات عادة رسم الاقتران قاعدة الحمض النووي الريبي لمجموعة فرعية من الحمض النووي الريبي التي تتفاعل مع بروتين معين أو أنواع الحمض النووي الريبي. وتشمل التطورات الأخيرة في دراسة التفاعلات رنا العالمية طريقة ربل 12 ، والتي لا استقرار التفاعلات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي ، وبالتالي قد التقاط فقط مجموعة فرعية من التفاعلات في الجسم الحي . وللتغلب على هذه التحديات، طورنا نحن وغيرهم استراتيجيات غير متحيزة على نطاق الجينومp رنا إنتيراكتوميس في الجسم الحي ، وذلك باستخدام إصدارات معدلة من سبورالين كروسلينكر 13 ، 14 ، 15 . في هذا البروتوكول، ونحن تصف تفاصيل لأداء S تساوي P سورلين كروسلينكد، L إيغاتد، و S المنتخبة H الهجين (سبلاش)، والذي يستخدم السورالين البيروكسيديز لربط كروتينك قاعدة رنا في الجسم الحي ، تليها ربط القرب وارتفاع تسلسل الإنتاجية إلى تحديد الحمض النووي الريبي قاعدة الاقتران الشركاء الجينوم واسعة ( الشكل 1 ) 15 .

في هذه المخطوطة، ونحن تصف الخطوات لأداء سبلاش باستخدام الخلايا الملتصقة مثقف، في هذه الحالة خلايا هيلا. نفس البروتوكول يمكن أن تتكيف بسهولة لخلايا الثدييات تعليق والخميرة والبكتيريا الخلايا. لفترة وجيزة، يتم معالجة الخلايا هيلا مع السورالين البيروكسيديز والأشعة في 365 نانومتر إلى كروسلينك التفاعل أزواج قاعدة الحمض النووي الريبي في الجسم الحي. ثم يتم استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا، مجزأة وإثراء لمناطق تشابك الارتباط باستخدام الخرز ستريبتافيدين. ثم يتم ربط ليغاتد شظايا التفاعل الحمض النووي الريبي معا باستخدام ربط القرب وجعلها إلى مكتبة [كدنا] لتسلسل عميق. عند التسلسل، يتم تعيين رنا الخيميري على ترانسكريبتوم / الجينوم لتحديد المناطق التفاعلية رنا التي يتم إقرانها مع بعضها البعض. لقد استخدمت بنجاح سبلاش لتحديد الآلاف من التفاعلات الحمض النووي الريبي في الجسم الحي في الخميرة والخلايا البشرية المختلفة، بما في ذلك الجزيئات داخل الجزيئات و بينا الجزيئات الاقتران في فئات متنوعة من الحمض النووي الريبي، مثل سنورناس، لكرناس و مرناس، لمحة عن التنظيم الهيكلي وأنماط التفاعل من رنا في الخلية.

Protocol

1. علاج خلايا هيلا مع السورالين بيوتينيلاتد واستخراج الحمض النووي الريبي

  1. ثقافة خلايا هيلا في دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) تستكمل مع 10٪ مصل بقري الجنين (فبس) و 1٪ البنسلين الستربتومايسين (بس) في لوحة 10 سم.
  2. غسل خلايا هيلا مرتين مع 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X. استنزاف بس الزائدة تماما من الطبق عن طريق وضع الطبق عموديا لمدة 1 دقيقة.
  3. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 200 ميكرومتر من السورالين البيروكسيديز و 0.01٪ ث / د ديجيتونين، إلى الخلايا بشكل موحد واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. في حين أن السورالين البيروكسيديز يمكن أن يدخل الخلية، نفاذية له هو أعلى بكثير عندما تتعرض الخلايا لكميات قليلة من ديجيتونين (0.01٪) لمدة 5 دقائق
  4. إزالة غطاء لوحة 10 سم تحتوي على خلايا هيلا المعالجة ووضع الطبق شقة على الجليد. إشعاع طبق يحتوي على الخلايا مع 365 نانومتر الأشعة فوق البنفسجية لمدة 20 دقيقة على الجليد، على مسافة 3 سم من لمبات الأشعة فوق البنفسجية، وذلك باستخدام كروسلينكر الأشعة فوق البنفسجية.
  5. عزل tرنا أوتل من خلايا هيلا بواسطة غوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-الكلوروفورم استخراج بعد بروتوكول الشركة المصنعة. إضافة 1: 1 حجم الأيزوبروبانول لترسب الحمض النووي الريبي في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية في الأيزوبروبانول إلى أجل غير مسمى. لا يمكن أن يؤديها لطخة نقطة في هذه الخطوة للتحقق من أن السورالين البيروكسيديز قد دخلت بنجاح الخلايا ولها رنا كروسلينكد في الجسم الحي ( الشكل 2 ).
  6. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي الريبي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ إلى بيليه رنا لغسل الحمض النووي الريبي.
  7. الطرد المركزي العينات في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف والهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. إضافة نوكليس خالية من المياه إلى بيليه رنا وتحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد ولاش تجميد في النيتروجين السائل.

2. تجزئة الحمض النووي الريبي

  1. سخن 15 ميكرولتر من 2X رنا العازلة تجزئة و 10 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي (1 ميكروغرام / ميكرولتر) بشكل فردي في أنابيب 0.2 مل ير، في 95 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. مزيج 10 ميكرولتر من ساخنة 2X رنا العازلة تجزئة مع 10 ميكرولتر عينة الحمض النووي الريبي التي بيبتينغ صعودا وهبوطا. احتضان العينة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. وقف رد فعل من قبل المفاجئة تبريد رد فعل على الجليد.
  2. نقل وتجميع ردود الفعل 2 تجزئة إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. إضافة 40 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس إلى رد فعل، 10 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم، 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 300 ميكرولتر من الايثانول 100٪ إلى رد فعل تجزئة. احتضان الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل لترسيب الحمض النووي الريبي.
  3. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة، وإزالة طاف وغسل الحمض النووي الريبي باستخدام 1 مل من الايثانول 70٪.
  4. الطرد المركزي رنا في 20،000 زغ لمدة 15 دقيقة، ريمفوق طاف وحل رنا في 20 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس.

3. الحمض النووي الريبي حجم اختيار وشطف

  1. إضافة 20 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل صبغ إلى الحمض النووي الريبي المستردة في أنبوب ميكروفوج. تسخين الحمض النووي الريبي مع صبغ تحميل الحمض النووي الريبي في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ووضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  2. إضافة 3 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل صبغ إلى 0.25 ميكرولتر من 10 نت سلم الحمض النووي في أنبوب ميكروفوج. تسخين السلم في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ووضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  3. تحميل سلم التشويه والتحريف على 8.6 سم × 6.8 سم 6٪ تب اليوريا هلام وحجم تجزئ بواسطة الكهربائي لمدة 40 دقيقة في 180 V. وصمة عار هلام في 10 مل من العازلة تب تحتوي على 1: 10،000 من حمض هلام وصمة عار لمدة 5 دقيقة في الظلام.
  4. ثقب نظيفة 0.6 مل أنبوب ميكروفوج في الجزء السفلي باستخدام إبرة 24 G ووضعه في أنبوب ميكروفوج 2 مل.
  5. تصور العصابات على هلام ما بعد الملون باستخدام ترانزيلوميناتور وقطع شريحة هلام المقابلة ل 90-110 نت. نقل شريحة هلام في أنبوب مثقب 0.6 مل ميكروفوج في أنبوب ميكروفوج 2 مل. يتم تنفيذ هذا التحديد حجم للسماح للشظايا الخيميري أن يكون الحد الأدنى لطول لخريطة ل ترانسكريبتوم والتمييز بين المنتجات ليغاتد القرب مقابل المنتجات أونليغاتد في الخطوات اختيار حجم المصب.
  6. أجهزة الطرد المركزي شرائح هلام في 12000 زغ في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة لتمزيق شريحة هلام وجمعه في أنبوب ميكروفوج 2 مل. تجاهل فارغة 0.6 مل ميكروفوج أنبوب. إضافة 700 ميكرولتر من العازلة شطف لشريحة هلام تمزيقه في أنبوب ميكروفوج 2 مل واحتضان عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها مع دوران مستمر، للسماح نشر العينات في المخزن المؤقت.
  7. نقل شرائح هلام والعازلة شطف لتصفية أنبوب الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 2 دقيقة. سيتم حبس شرائح هلام في الجزء العلوي من مرشح. تجاهل شرائح هلام وأعلى المقصورة.
  8. إضافة 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 700 ميكرولتر من الأيزوبروبانول 100٪ إلى الترشيح في أنبوب ميكروفوج وترسب الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو بين عشية وضحاها.
    نقطة وقفة: يمكن أن يعجل الحمض النووي الريبي في الأيزوبروبانول إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية.
  9. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي الريبي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ لغسل بيليه رنا. الطرد المركزي بيليه غسلها في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  10. إزالة غسل العازلة وإضافة 20 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس ل ريسوسبيند رنا. كوانتيتات تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل.

4. إثراء المناطق المتشابكة رنا

  1. دوامة ستريبتافيدين المغلفة الخرز المغناطيسي بقوة ل ريسوسبيند الخرز متجانسة في الأنبوب. نقل 100 ميكرولتر من الخرز إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل ووضعه على المغناطيسإيك الوقوف لمدة 1 دقيقة للسماح الخرز التمسك الجانب المغناطيسي من الأنبوب. إزالة المخزن المؤقت التخزين من الخرز بعناية واتخاذ أنبوب من موقف المغناطيس.
  2. إضافة 1 مل تحلل العازلة إلى الخرز في أنبوب ميكروفوج وماصة صعودا وهبوطا. وضع الخرز ميكروفوج التي تحتوي على موقف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة لفصل الخرز من غسل العازلة. كرر هذا لما مجموعه 3 يغسل.
  3. إزالة غسل العازلة من الخرز عن طريق وضع الخرز ميكروفوج تحتوي على موقف المغناطيسي لمدة 1 دقيقة. إضافة المانع ريبونوكلياز (1: 200) إلى العازلة تحلل وإضافة 100 ميكرولتر من العازلة تحلل إلى الخرز غسلها في أنبوب ميكروفوج.
  4. إضافة 2 مل من العازلة التهجين الطازجة، 1 مل من العازلة تحلل تستكمل، 1.5 ميكروغرام من حجم رنا مجزأة و 100 ميكرولتر من الخرز معلق إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي المخروطية. دوامة الأنبوب بلطف.
  5. احتضان أنبوب الطرد المركزي المخروطية 15 مل في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع نهاية إلى نهاية التناوب.قبل الحارة غسل العازلة عند 37 درجة مئوية.
  6. وضع 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية على موقف المغناطيسي لمدة 15 مل أنابيب لمدة 2 دقيقة لفصل الخرز من المخزن المؤقت. ماصة العازلة بعناية من الأنبوب وتجاهل ذلك.
  7. إضافة 1 مل من قبل غسلها العازلة غسل إلى الخرز، ماصة صعودا وهبوطا ونقل الخرز إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. احتضان في الخرز عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، مع نهاية إلى نهاية التناوب.
  8. طرد مركزي لفترة وجيزة أسفل محتويات أنبوب ميكروفوج. وضع 1.5 مل غسلها الخرز في أنابيب ميكروفوج على موقف المغناطيسي لمدة 2 مل أنابيب لمدة 1 دقيقة، لفصل الخرز من غسل العازلة. إزالة المخزن المؤقت من الخرز عن طريق بيبتينغ بلطف المخزن المؤقت للخروج من أنبوب ميكروفوج.
  9. إضافة 1 مل من قبل غسلها العازلة غسل إلى الخرز وماصة صعودا وهبوطا لتكرار غسل. إجراء ما مجموعه 5 يغسل. في نهاية غسل ال 5، إزالة العازلة غسل عن طريق وضع الخرز ميكروفوج التي تحتوي على موقف المغناطيس ل1 دقيقة.

5. ربط القرب

  1. إضافة 1 مل من الباردة T4 بولينوكليوتيد كيناز (بنك) العازلة إلى الخرز غسلها واحتضان الخرز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، مع نهاية إلى نهاية التناوب. وضع أنبوب ميكروفوج تحتوي على الخرز على الشريط المغناطيسي لمدة 1 دقيقة وإزالة بلطف العازلة T4 بنك. كرر هذه الخطوة لما مجموعه 2 يغسل وإزالة العازلة T4 بنك بعد غسل الماضي.
  2. إضافة المخازن المؤقتة إلى الخرز، وفقا للجدول 1 . لتمكين 3 'ينتهي من جزء رنا ليغاتد إلى 3' محولات أدناه، احتضان الخرز في المخزن المؤقت في 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات مع التحريض المستمر لتحويل 3 'مجموعة الفوسفات الحلقية في نهاية الحمض النووي الريبي إلى 3 'أوه.
  3. إضافة المخازن المؤقتة إلى رد الفعل السابق، وفقا للجدول 2 . لتمكين 5 'نهاية شظايا الحمض النووي الريبي لتكون ربط المختصة، احتضان رد فعل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع التحريض المستمر في وجود أتب، لتحويل 5 'أوه على الحمض النووي الريبي إلى 5' الفوسفات.
  4. إضافة المخزن المؤقت إلى رد الفعل السابق لأداء ربط القرب، وفقا للجدول 3 . احتضان رد فعل في 16 درجة مئوية لمدة 16 ساعة، مع التحريض المستمر،
  5. وضع ميكروفوج تحتوي على رنا ليغاتد على موقف المغناطيس لمدة 1 دقيقة. إزالة طاف بعناية وإضافة 1 مل من الغرفة درجة حرارة غسل العازلة إلى الخرز. ريسوسبيند التي كتبها بيبتينغ صعودا وهبوطا.
  6. وضع أنبوب ميكروفوج على موقف المغناطيس لمدة 1 دقيقة وإزالة العازلة غسل بعناية. إجراء ما مجموعه 2 يغسل، وإزالة العازلة غسل من الخرز في نهاية الغسيل الثاني.
  7. إضافة 100 ميكرولتر من رنا بيكاي العازلة إلى الخرز و ريسوسبيند التي بيبتينغ صعودا وهبوطا. تسخين العينات في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة على كتلة الحرارة.
  8. البرد العينة على الجليد لمدة 1 دقيقة وإضافة 500 ميكرولتر من غوانيدينيوم ثيوسيانات الفينول الكلوروفورم إلى العينة. مزيج بواسطة فورتيكسينغ بقوة لمدة 10 ثانية. احتضان ميكستوإعادة في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في غوانيدينيوم ثيوسيانات-الفينول-الكلوروفورم في -80 درجة مئوية لبضعة أشهر.
  9. إضافة 100 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى غوانيدينيوم ثيوسيانات الفينول الكلوروفورم العينات المستخرجة. دوامة بقوة لمدة 10 ثانية. الطرد المركزي العينات في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  10. نقل 400 ميكرولتر من طبقة مائي إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل جديد. إضافة 800 ميكرولتر (2 مجلدات) من الايثانول بنسبة 100٪ وتخلط بيبتينغ صعودا وهبوطا.
  11. نقل حل الحمض النووي الريبي لأعمدة تنظيف الحمض النووي الريبي واستعادة رنا تعليمات الشركة المصنعة التالية، وضمان أن يتم الاحتفاظ حتى رنا صغيرة. أزل الحمض النووي الريبي في 100 ميكرولتر من نوكليس خالية من المياه.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل.

6. عكس كروسلينكينغ من السورالين البيروكسيديز

  1. نقل 100 ميكرولتر من عينات إلوتد في بئر من 24 بل جيداأكل. إزالة الغطاء وإشعاع العينة تحت الأشعة فوق البنفسجية 254 نانومتر، لمدة 5 دقائق على الجليد.
  2. نقل عينة كروسلينكد العكسي إلى أنبوب ميكروفوج نظيفة. إضافة 10 ميكرولتر من خلات الصوديوم، 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 300 ميكرولتر من الايثانول 100٪ ويعجل الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو بين عشية وضحاها.
    نقطة وقفة: يمكن أن يعجل الحمض النووي الريبي في الإيثانول إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية.
  3. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي الريبي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ لغسل بيليه رنا.
  4. الطرد المركزي بيليه غسلها في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة العازلة غسل وإضافة 4.25 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس ل ريسوسبيند رنا. نقل الحمض النووي الريبي إلى أنبوب 0.2 مل ير.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل.

7. النسخ العكسي و [كدنا] التعميم

  1. إضافة 0.75 ميكرولترمن رنا رابط (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) إلى العينة معلق في أنبوب ير والحرارة في 80 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. وضع العينة على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  2. إضافة المخازن المؤقتة إلى العينة التشويه والتحريف ل 3 'ربط محول، وفقا للجدول 4 . احتضان رد فعل عند 25 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة.
  3. نقل رد فعل إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. إضافة 90 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس إلى رد فعل، تليها 10 ميكرولتر من خلات الصوديوم، 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. يعجل الحمض النووي الريبي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو بين عشية وضحاها.
    نقطة وقفة: يمكن أن يعجل الحمض النووي الريبي في الإيثانول إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية.
  4. الطرد المركزي رنا عجلت في 20،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي الريبي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ لغسل بيليه رنا.
  5. الطرد المركزي بيليه غسلها في 20،000 ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة غسل ريسوسبيند العازلة بيليه في 5 ميكرولتر من نوكليس مجانا ثالعاطر.
  6. إضافة 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل صبغ إلى الحمض النووي الريبي المستردة في أنبوب ميكروفوج. تسخين الحمض النووي الريبي مع صبغ تحميل الحمض النووي الريبي في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ووضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  7. إضافة 3 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل صبغ إلى 0.25 ميكرولتر من 10 نت سلم الحمض النووي في أنبوب ميكروفوج. تسخين السلم في 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق ووضعه على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  8. أداء تجزئة حجم باستخدام 8.6 سم × 6.8 سم 6٪ تب اليوريا هلام كما في الخطوات 3.3 و 3.4.
  9. تصور هلام ملطخة مع وصمة عار حمض النووي باستخدام ترانزيلوميناتور وقطع شريحة هلام المقابلة ل 110-140 نت على سلم. نقل شريحة هلام في أنبوب ثقب 0.6 مل ميكروفوج في أنبوب ميكروفوج 2 مل واتبع بروتوكول من الخطوات 3.6- 3.9.
  10. إضافة 5 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس ل ريسوسبيند بيليه الحمض النووي الريبي. نقل الحمض النووي الريبي إلى أنبوب 0.2 مل ير.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل.
  11. إضافة 1 ميكرولتر من التمهيدي رت في 1.2581؛ M إلى الحمض النووي الريبي في أنبوب ير والحرارة في 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. وضع العينة على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  12. إضافة المخازن المؤقتة للنسخ العكسي وفقا للجدول 5 . احتضان رد فعل عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  13. إضافة 1.1 ميكرولتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم إلى التفاعل والحرارة في 98 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. وضع رد فعل على الجليد.
  14. نقل رد فعل إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. إضافة 90 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس إلى رد فعل، تليها 10 ميكرولتر من خلات الصوديوم، 1 ميكرولتر من الجليكوجين و 300 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. يعجل الحمض النووي في -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل أو بين عشية وضحاها.
    نقطة وقفة: الحمض النووي يمكن عجلت في الإيثانول إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية.
  15. الطرد المركزي الحمض النووي عجلت في 20،000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية لاستعادة الحمض النووي. إزالة طاف وإضافة 1 مل من الايثانول البارد 70٪ لغسل بيليه الحمض النووي. الطرد المركزي بيليه غسلها في 20،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة غسل ريسوسبيند العازلة بيلواسمحوا في 5 ميكرولتر من نوكليس المياه مجانا.
  16. أداء تجزئة حجم باستخدام 8.6 سم × 6.8 سم 6٪ تب اليوريا هلام كما في الخطوات 3.3 و 3.4.
  17. تصور هلام ما بعد الملون باستخدام ترانزيلوميناتور وقطع شريحة هلام المقابلة ل 200-240 نت على سلم. و كدنا المكتوبة العكسية الآن 96 قواعد أطول من جزء رنا بسبب إضافة 96 قاعدة رت التمهيدي. نقل شريحة هلام في أنبوب مثقب 0.6 مل ميكروفوج في أنبوب ميكروفوج 2 مل.
  18. أجهزة الطرد المركزي شرائح هلام في 12000 زغ في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة لتمزيق شريحة هلام وجمعه في أنبوب ميكروفوج 2 مل. تجاهل فارغة 0.6 مل ميكروفوج أنبوب.
  19. إضافة 700 ميكرولتر من العازلة شطف لشريحة هلام تمزيقه في أنبوب ميكروفوج 2 مل واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة مع دوران مستمر. اتبع البروتوكول كما هو موضح في الخطوات 3.7- 3.8.
  20. إضافة 6 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس ل ريسوسبيند بيليه الحمض النووي. نقل الحمض النووي إلى أنبوب 0.2 مل ير.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي في -80 درجة مئوية بعد تجميد فلاش في النيتروجين السائل.
  21. إضافة المخازن المؤقتة إلى رد فعل لتعميم [كدنا]، وفقا للجدول 6 . احتضان رد فعل في 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة والحرارة في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لتعطيل التفاعل.
  22. نقل رد فعل إلى أنبوب ميكروفوج 1.5 مل. تنقية كدنا دائرية باستخدام عمود تنظيف الحمض النووي التالية تعليمات الشركة الصانعة. إضافة 20 ميكرولتر من المياه الحرة نوكليس إلى العمود إلى أزل كدنا المنقى.
    نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية لبضعة أشهر.

8. ير التضخيم (مقياس صغير ير)

  1. إضافة المخازن المؤقتة إلى رد فعل وفقا للجدول 7 ل ير التضخيم لاختبار الحد الأدنى من دورات تحتاج إلى تضخيم المكتبة.
  2. إعداد ظروف الدراجات ير وفقا للجدول 8 . وقفة رد فعل ونقل 5 ميكرولتر منتفاعل ير في 10 و 15 و 20 دورات، في أنابيب 1.5 مل ميكروفوج منفصلة.
  3. إضافة 1 ميكرولتر من 6X دنا هلام صبغ التحميل لكل من 5 ميكرولتر تفاعل ير في دورات مختلفة. أداء الكهربائي هلام على هلام الاغاروز 3٪، في 120 V، لمدة 1 ساعة لتصور المنتجات ير.
    1. استخدام أقل عدد من دورات ير (Y) التي تظهر التضخيم في حوالي 250 قواعد (في الشكل 3 ، هناك فرقة قوية في 15 دورات من التضخيم وحزمة خافتة في 10 دورات.من المرجح أن دورات 12 من التضخيم ير يرتكز على توليد ما يكفي من المواد لتسلسل عميق كما كمية من [كدنا] المستخدمة هو 10 أضعاف ذلك على نطاق صغير ير التضخيم).

9. ير التضخيم (ير مقياس كبير) وتنقية

  1. إضافة المخازن المؤقتة إلى رد فعل وفقا للجدول 9 ل ير التضخيم ل ير على نطاق واسع.
  2. إعداد ظروف الدراجات ير وفقا لالجدول 10 .
  3. إضافة 5 ميكرولتر من 6X دنا هلام صبغ التحميل إلى 25 ميكرولتر من تفاعل ير وتحميلها في بئر من هلام الاغاروز 3٪. تحميل 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووي في بئر منفصل. أداء الكهربائي هلام في 100 V، لمدة 1.5 ساعة.
  4. تصور هلام الانتهاء باستخدام الأشعة فوق البنفسجية ترانزيلوميناتور.
  5. حجم استخراج شريحة هلام تحتوي على المنتجات ير من 200-300 قواعد ونقل هلام إلى نظيفة 2 مل أنبوب ميكروفوج.
  6. إضافة 1 مل من العازلة للذوبان هلام، من مجموعة استخراج هلام الحمض النووي، إلى شريحة هلام واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة، أو حتى هلام يذوب، مع التحريض المستمر.
  7. إضافة 200 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى هلام المذاب وتخلط جيدا عن طريق بيبتينغ. نقل 700 ميكرولتر من العينة إلى الحمض النووي استخراج هلام تنظيف العمود وأجهزة الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 30 ثانية. إبقاء نقل العينة المذابة إلى العمود حتى يتم تحميل كل من العينة على العمود.
  8. إضافة 500 ميكرولتر العازلة للذوبان هلام،تليها 700 ميكرولتر من العازلة غسل العمود، إلى العمود، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. إضافة 12 ميكرولتر من نوكليس خالية من المياه إلى وسط العمود لاستباق الحمض النووي. نقطة وقفة: يمكن تخزين الحمض النووي في -20 درجة مئوية.
  9. كوانتيتات تركيز الحمض النووي باستخدام القياس الكمي فلوروميتريك. إذا تم إنشاء مكتبات متعددة وتجميعها معا للتسلسل، إضافة كمية متساوية من كل عينة إلى التجمع، لارتفاع تسلسل الإنتاجية.

النتائج

الشكل 1 يصور التخطيطي لسير العمل سبلاش. على إضافة السورالين البيروكسيديز في وجود 0.01٪ ديجيتونين، والأشعة فوق البنفسجية يشابك، يتم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا ويتم تنفيذ نقطة لطخة لضمان أن يشابك من البيروكسيديز إلى ?...

Discussion

هنا، نحن تصف بالتفصيل سير العمل التجريبي والحسابي ل سبلاش، وهي الطريقة التي تسمح لنا لتحديد التفاعلات الحمض النووي الريبي الزوجين الحكمة في طريقة الجينوم واسعة. لقد استخدمنا بنجاح سبلاش في الثقافات البكتيرية والخميرة والثقافات البشرية، وتوقع أن الاستراتيجية يمكن ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

نشكر أعضاء مختبر وان ومختبر ناغاراجان للمناقشات بالمعلومات. ويدعم N.Nagarajan بتمويل من A * ستار. يتم دعم Y.Wan بتمويل من A * ستار والمجتمع في العلوم-برانكو فايس الزمالة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb Plus DNA LadderLife Technologies Holdings Pte Ltd10787026DNA ladder
10 bp DNA ladderLife Technologies Holdings Pte Ltd10821-015DNA ladder
20% SDS solutionFirst BASEBUF-2052-1L  
20x SSCFirst BASEBUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate SolutionFirst BASEBUF-1151-1L-pH5.2  Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1Bio-Rad1610145TBE Urea gel component
Ambion Buffer KitLife Technologies Holdings Pte LtdAM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade  PromegaV3131 TBE Urea gel component
Bromophenol BlueSigma-AldrichB0126-25G
ChloroformMerck1.02445.1000RNA extraction
Single strand DNA ligaseEpicentreCL9025KCircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filtersSigma-AldrichCLS8160-96EACostar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINESigma-AldrichD5628-1GFor cell treatment
Dark Reader Transilluminator Clare Chemical ResearchDark Reader DR89X TransilluminatorBlue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6x)Life Technologies Holdings Pte LtdR0611Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle MediumPan BioTechP04-03500For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beadsLife Technologies Holdings Pte Ltd65002Dynabeads MyOne Streptavidin C1 
Magnetic stand for 15 mL tubesLife Technologies Holdings Pte Ltd12301DDynaMag-15
Magnetic stand for 15 mL tubesLife Technologies Holdings Pte Ltd12321DDynaMag-2
ThermoMixerEppendorf5382 000.015Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralenLife Technologies Holdings Pte Ltd29986EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL HitachiF8T5/BL 365 nm UV bulb
Fetal Bovine SerumLife Technologies Holdings Pte Ltd10270106  Components of Hela medium
FormamidePromegaH5052  Component in hybridization buffer
G8T5Sankyo-DenkiG8T5254 nm UV bulb
GlycogenLife Technologies Holdings Pte Ltd10814010Required for nucleic acid precipitation
NanodropLife Technologies Holdings Pte LtdNanodrop 2000Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water First BASEBUF-1180-500ml  
Penicillin Streptomycin  Life Technologies Holdings Pte Ltd15140122  Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)Life Technologies Holdings Pte LtdF531L Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1New England BiolabsE7335L PCR primers
DNA Gel Extraction KitQIAgen28106QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kitLife Technologies Holdings Pte LtdQ32854Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kitQiagen74106RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase InhibitorLife Technologies Holdings Pte LtdAM2696SUPERase In
Reverse transcriptaseLife Technologies Holdings Pte Ltd18080400SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel StainLife Technologies Holdings Pte LtdS11494SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide KinaseNew England BiolabsM0201LEnd repair enzyme
T4 RNA Ligase 1New England BiolabsM0204LEnzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQNew England BiolabsM0373LEnzyme for adaptor ligation
TemedBio-Rad1610801TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroformLife Technologies Holdings Pte Ltd15596018TRIzol® Reagent for RNA extraction
UreaFirst BASEBIO-2070-5kg  
UV crosslinkerStratagene400072UV Stratalinker 1800
UV TransilluminatorUVP95-0417-01For visualizing of bands
Xylene Cyanol FFSigma-AldrichX4126-10G
DNA cleanup itZymo Research D4004Zymo DNA concentrator-5 
List of software required
FastQC software0.11.4http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software1.0.7https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software0.7.12http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software1.2.1http://www.htslib.org/
PULLSEQ software1.0.2https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software2.5.0chttps://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON scriptPYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON scriptPYTHON 2.7.11https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK scriptAWK GNU 4.1.2https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer 
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2x RNA fragmentation buffer
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8.3
2x RNA loading Dye
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1 mM EDTA
3' RNA adapter sequence:
5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence:
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG

References

  1. Wan, Y., Kertesz, M., Spitale, R. C., Segal, E., Chang, H. Y. Understanding the transcriptome through RNA structure. Nat.Rev.Genet. 12 (9), 641-655 (2011).
  2. Kertesz, M., et al. Genome-wide measurement of RNA secondary structure in yeast. Nature. 467 (7311), 103-107 (2010).
  3. Wan, Y., et al. Genome-wide Measurement of RNA Folding Energies. Mol.Cell. 48 (2), 169-181 (2012).
  4. Wan, Y., Qu, K., Ouyang, Z., Chang, H. Y. Genome-wide mapping of RNA structure using nuclease digestion and high-throughput sequencing. Nat.Protoc. 8 (5), 849-869 (2013).
  5. Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505 (7485), 706-709 (2014).
  6. Spitale, R. C., et al. Structural imprints in vivo decode RNA regulatory mechanisms. Nature. 519 (7544), 486-490 (2015).
  7. Ding, Y., et al. In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features. Nature. 505 (7485), 696-700 (2014).
  8. Rouskin, S., Zubradt, M., Washietl, S., Kellis, M., Weissman, J. S. Genome-wide probing of RNA structure reveals active unfolding of mRNA structures in vivo. Nature. 505 (7485), 701-705 (2014).
  9. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA-RNA interactions in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  10. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  11. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  12. Ramani, V., Qiu, R., Shendure, J. High-throughput determination of RNA structure by proximity ligation. Nat.Biotechnol. , (2015).
  13. Lu, Z., et al. RNA Duplex Map in Living Cells Reveals Higher-Order Transcriptome Structure. Cell. 165 (5), 1267-1279 (2016).
  14. Sharma, E., Sterne-Weiler, T., O'Hanlon, D., Blencowe, B. J. Global Mapping of Human RNA-RNA Interactions. Mol.Cell. 62 (4), 618-626 (2016).
  15. Aw, J. G., et al. In Vivo Mapping of Eukaryotic RNA Interactomes Reveals Principles of Higher-Order Organization and Regulation. Mol.Cell. 62 (4), 603-617 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

123

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved