التمايز كفاءة الخلايا الجذعية المحفزة لNKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; البنكرياس أسلاف

Summary

نحن هنا وصف بروتوكول 4-مرحلة لتمييز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لNKX6-1 ⁺ الأسلاف البنكرياس في المختبر. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول لمجموعة متنوعة من خطوط الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان.

Abstract

الخلايا الجذعية المحفزة لديها القدرة على الذات تجديد وتميز لأنساب متعددة، مما يجعلها مصدرا جذابا لتوليد الخلايا الاولية البنكرياس التي يمكن استخدامها لدراسة والعلاج في المستقبل من مرض السكري. توضح هذه المقالة بروتوكول التمايز أربع مراحل مصممة لتوليد الخلايا الاولية البنكرياس من خلايا جذعية جنينية بشرية (hESCs). ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى عدد من خطوط الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSC). النهج المتبع لتوليد الخلايا الاولية البنكرياس هو التفريق hESCs لنموذج بدقة المراحل الأساسية للتنمية البنكرياس. هذا الأمر يبدأ تحريض الأديم الباطن نهائي، الذي يتحقق من خلال زراعة الخلايا في وجود Activin A، الخلايا الليفية عامل النمو الأساسي (bFGF) وCHIR990210. مزيد من التمايز والزخرفة مع عامل الخلايا الليفية النمو 10 (FGF10) وDorsomorphin يولد خلايا تشبه المعى الأمامي الخلفي. إضافة ريتينحمض منظمة المؤتمر الإسلامي، رأس، سان-1 وFGF10 يميز خلايا الخلفي المعى الأمامي إلى خلايا مميزة من الأديم البنكرياس. وأخيرا، فإن الجمع بين عامل نمو البشرة (EGF)، نيكوتيناميد ورأس يؤدي إلى توليد كفاءة PDX1 ⁺ / ⁺ NKX6-1 الخلايا. التدفق الخلوي يتم تنفيذه لتأكيد التعبير عن علامات معينة في مراحل رئيسية من تطوير البنكرياس. وPDX1 ⁺ / ⁺ NKX6-1 الأسلاف البنكرياس في نهاية المرحلة 4 هي قادرة على توليد خلايا β الناضجة على زرع في الفئران العوز المناعي ويمكن زيادة متباينة على توليد خلايا منتجة للأنسولين في المختبر. وبالتالي، فإن الجيل كفاءة PDX1 ⁺ / ⁺ NKX6-1 الأسلاف البنكرياس، كما هو موضح في هذا البروتوكول، أهمية كبيرة، حيث أنه يوفر منبرا لدراسة تطوير البنكرياس البشرية في المختبر، ويوفر مصدرا للخلايا مع إمكانية التفريق ل خلايا بيتا التي يمكن أن EVentually أن تستخدم لعلاج مرض السكري.

Introduction

انتشار مرض السكري في تزايد وفقا للجمعية الكندية للسكري، تشير التقديرات إلى أن أكثر من 11 مليون شخص في كندا والسكري أو prediabetic، مع 5-10٪ من هؤلاء الأفراد جود مرض السكري نوع 1 (T1D) ^1. T1D هو أحد أمراض المناعة الذاتية التي يسببها تدمير خلايا بيتا المنتجة للأنسولين التي تقع ضمن جزر لانجرهانز. حاليا، والأفراد الذين يعيشون مع T1D تتطلب مصادر خارجية للأنسولين ^2. على الرغم من التقدم في العلاج بالأنسولين، يستمر المرضى T1D لديهم الوقت الصعب تنظيم مستويات الجلوكوز في الدم وما زالت تعاني على حد سواء تحت؛ دون وارتفاع السكر في الدم. نموذج واعد للعلاج لاستعادة سوائية سكر الدم في T1D هو استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs)، والتي يمكن استخدامها لتوليد امدادات غير محدودة من الانسولين إنتاج خلايا بيتا على حد سواء في المجراة في المختبر ^{3، 4، 5، 6، 7.} التفريق hESCs إلى بيتا تشبه الخلايا يمكن أن يجعل من الممكن لدراسة مرض السكري في المختبر، والسماح لتحديد أهداف علاجية جديدة لمرض السكري من النوع 2، وتوفير الخلايا للزرع في المرضى T1D.

المحاولة الأكثر نجاحا في توليد خلايا منتجة للأنسولين من hESCs في المختبر هي تلخيص للأحداث الجنينية التي تحدث أثناء تطور البنكرياس ^{4، 5.} وهذا ينطوي على تلاعب من مسارات إشارات واضحة لنموذج بدقة المراحل الأساسية من البنكرياس النامية. تبدأ تطوير البنكرياس مع تحريض من الأديم الباطن نهائي، الذي يتميز التعبير عن CXCR4 وCD117 (ج-KIT) ^{8، 9.} التنظيم الدقيق للdefinitمطلوب منظمة الأديم إيف لتشكيل الأنبوب امعاء، والتي يخضع آنذاك الأمامي إلى الخلفي الزخرفة والبطنية الظهرية. ظهري وبطني براعم البنكرياس الخروج من منطقة المعى الأمامي الخلفي الذي يعبر عن البنكرياس والاثنى عشر علبة مثلية الجين (Pdx1)، وهو أمر ضروري لتطوير البنكرياس ^10. ظهري وبطني براعم الصمامات لتشكيل البنكرياس، والذي يخضع لثم إعادة الظهارية واسعة النطاق والتوسع ^11. ويرافق الالتزام الغدد الصماء وخارجية الإفراز النسب من قبل جيل من الخلايا الاصلية متعددة القدرات (البلدان المتوسطية الشريكة) أن أعرب، من بين أمور أخرى، والنسخ عوامل Pdx1، Nkx6.1 وPtf1a ^{12 و 13.} البلدان المتوسطية الشريكة التي ستصبح الغدد الصماء والأقنية الخلايا تستمر في التعبير عن Nkx6-1 بينما تتناقص التعبير Ptf1a. وخلافا لذلك، فإن الخلايا الإفرازية النسب تفقد expressioن من Nkx6-1 والحفاظ على Ptf1a التعبير ^12.

عامل النسخ Nkx6-1 دورا رئيسيا في تطوير البنكرياس، ولا سيما خلال تمايز الخلايا الاصلية الغدد الصماء لبيتا الخلايا. كما هو موضح سابقا، حذف النتائج Nkx6-1 في تشكيل ضعف الخلايا β خلال تطوير البنكرياس ^14. لذلك، وتوليد خلايا بيتا المنتجة للأنسولين في كل من المختبر والمجراة يتطلب تحريض كفاءة Nkx6-1.

نحن وضعت مؤخرا على بروتوكول لتوليد بكفاءة PDX1 ⁺ / ⁺ NKX6-1 الأسلاف البنكرياس من hPSCs. هذه الأسلاف البنكرياس المستمدة hPSC-توليد خلايا β الناضجة على زرع في الفئران العوز المناعي ^3. ويمكن تقسيم بروتوكول التمايز في 4 مراحل من سمات: 1) الاستقراء الأديم الباطن نهائي2) الزخرفة الخلفي المعى الأمامي، 3) مواصفات البنكرياس و4) الحث NKX6-1. هنا نقدم وصفا مفصلا لكل خطوة من التمايز الموجهة.

Protocol

1. إعداد حلول والإعلام

ملاحظة: تحضير جميع وسائل الإعلام لزراعة الخلايا في بيئة معقمة. وسائل الاعلام يجب ان يتم واستخدامها على الفور. وتقدم تفاصيل الكاشف في جدول المواد.

1. التمايز وسائل الإعلام
   1. إعداد يوم 0 التفاضل وسائل الإعلام: RPMI المتوسطة مع 1٪ الجلوتامين، 2 ميكرومتر CHIR 99021، 100 نانوغرام / مل Activin A، 10 ⁴ M MTG.
   2. إعداد يوم 1-2 التمايز وسائل الإعلام: RPMI المتوسطة مع 1٪ الجلوتامين، 100 نانوغرام / مل Activin A، 10 ⁴ M MTG، 5 نانوغرام / مل bFGF، حمض 50 ميكروغرام / مل الاسكوربيك.
   3. إعداد يوم 3-5 التمايز وسائل الإعلام: RPMI المتوسطة مع 1٪ الجلوتامين، 1٪ B27، 10 ⁴ M MTG، 0.75 ميكرومتر Dorsomorphin، 50 نانوغرام / مل FGF10.
   4. إعداد يوم 6-7 التمايز وسائل الإعلام: DMEM مع 1٪ الجلوتامين، 1٪ B27 و 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك، 50 نانوغرام / مل FGF10، 0.25 ميكرومتر SANT-1، 2 ميكرومتر الريتينويك حمض، 50 نانوغرام / مل رأس.
      ملاحظة: الريتينويكوينبغي أن يضاف حمض إلى وسائل الإعلام أخيرا، وينبغي أن تكون محمية وسائل الإعلام من ضوء لمنع تدهور التأكسدي ^15.
   5. إعداد يوم 12/8 التمايز وسائل الإعلام: DMEM مع 1٪ الجلوتامين، 1٪ B27 و 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك، 50 نانوغرام / مل رأس، و 100 نانوغرام / مل hEGF، 10 ملي نيكوتيناميد.
2. إعداد نظام مراقبة الأصول الميدانية العازلة: 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني، ناقص الكالسيوم والمغنيسيوم.

2. HESC التمايز

وإذابة HESC، passaged وتوسيعها على الماوس المشع الليفية الجنينية في وجود وسائل الإعلام على أساس KOSR تستكمل مع bFGF ^16: ملاحظة. HESCs جاهزة للتمايز عندما تصل خلايا 80-95٪ confluency. في هذا الوقت ينبغي أن تكون مستعمرات كبيرة مع حدود محددة و"domelike 'هيكل (الشكل 1A). يتم تنفيذ جميع زراعة الخلايا في أسفل شقة، زراعة الأنسجة المعالجة لوحات مغلفة مع الجيلاتين 0.1٪. عادة، وتزرع الخلايا في 6 أولوحات 12-جيدا، في مجلدات وسائل الاعلام من 2 مل أو 1 مل على التوالي.

1. في اليوم 0، يبدأ التمايز عن طريق استبدال وسائل الإعلام على أساس KOSR مع يوم 0 التفاضل وسائل الإعلام.
2. في أيام 1 و 2، ويهز بلطف لوحة لإزالة أي خلايا ميتة من أحادي الطبقة قبل الشفط. استبدال يوم 1-2 التمايز وسائل الإعلام.
3. في يوم 3، وخلايا الحصاد لالتدفق الخلوي. إذا كانت الخلايا تعبر عن أكثر من 90٪ CXCR4 ⁺ / ⁺ CD117، انتقل إلى الخطوة 2.4.
4. في أيام 3 و 5، ويهز بلطف لوحة لإزالة أي خلايا ميتة من أحادي الطبقة قبل الشفط. استبدال يوم 3-5 التمايز وسائل الإعلام.
5. في أيام 6 و 7، مع استبدال يوم 6-7 التمايز وسائل الإعلام.
6. في أيام 8 و 10 و 12، مع استبدال يوم 12/8 التمايز وسائل الإعلام.
7. في يوم 13، وخلايا الحصاد لالتدفق الخلوي لتحديد PDX1 والتعبير NKX6-1.

3. خلايا حصاد لتحليل التدفق الخلوي

1. فصل الخلايا مع1X حل التربسين التجاري وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
2. إزالة الحل التربسين التجاري و resuspend الخلايا وحيدة في 1000 ميكرولتر FACS العازلة مع 30 ميكرولتر الدناز أولا
3. تصفية الخلايا باستخدام 35 ميكرومتر شبكة النايلون مصفاة خلية ونقلها إلى أنبوب microcentrifuge.
4. خلايا الطرد المركزي في 455 x ج لمدة 5 دقائق. إعداد الخلايا إما تلطيخ حية أو الثابتة.

4. تلطيخ لالتدفق الخلوي

1. تدفق استعدادا لتلطيخ العيش في اليوم 3
   1. Resuspend الخلايا في 1000 ميكرولتر FACS العازلة. نقل 200 ميكرولتر (حوالي 1-3 × 10 ⁵ خلايا) في بئرين من لوحة 96-جيدا (للعينات غير ملوثين والملون).
   2. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 931 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف بواسطة قلب اللوحة.
   3. وصمة عار مع الأجسام المضادة الأولية مترافق، CXCR4: APC وCD117: PE (انظر M المقيدين الجدول) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعيدا عن الضوء.
   4. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 931 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف بواسطة قلب اللوحة.
   5. عينات resuspend في 100 ميكرولتر FACS العازلة.
   6. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 931 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف بواسطة قلب اللوحة.
   7. resuspend كل عينة ونقل في إجمالي حجم 300-500 ميكرولتر FACS العازلة إلى 1 مل أنابيب اختبار صغيرة أو 5 مل أنابيب جولة القاع.
   8. عينات تعمل على قياس التدفق الخلوي ^17. إذا لا يمكن تشغيل عينات على الفور، وتخزين عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
2. تدفق استعدادا لتلطيخ الثابتة في يوم 13
   1. resuspend الكرية خلية في التجاري الحل تثبيت / permeabilization لمدة 24 ساعة في 4 درجات مئوية.
   2. الطرد المركزي العينة في 455 x ج لمدة 5 دقائق. resuspend في 400 ميكرولتر بيرم / غسيل حل.
   3. نقل 200 ميكرولتر من العينة (حوالي 0.5-1 × 10 ⁶ خلايا) إلى TWس آبار لوحة 96-جيدا (من أجل السيطرة مفتش وPDX1 / NKX6-1 تلطيخ). أجهزة الطرد المركزي في 931 x ج لمدة 2 دقيقة.
   4. Resuspend والكريات الخلايا في 100 ميكرولتر بيرم / غسيل محلول يحتوي على مضاد للPDX1 وNKX6-1 أضداد السيطرة الأولية أو نمط إسوي (انظر المواد الجدول). احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
   5. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 931 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف بواسطة قلب اللوحة. عينات resuspend في 100 ميكرولتر بيرم / غسيل حل.
   6. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 931 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف بواسطة قلب اللوحة.
   7. Resuspend والعينات في 100 ميكرولتر بيرم / غسيل تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة محمية من الضوء.
   8. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 931 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف بواسطة قلب اللوحة.
   9. عينات resuspend في 100 ميكرولتر بيرم / محلول الغسيل.
   10. أجهزة الطرد المركزي لوحة في 931 x ج لمدة 2 دقيقة. إزالة طاف بواسطة قلب اللوحة.
   11. ممثلأكل خطوة 4.2.9 و4.2.10.
   12. resuspend كل عينة ونقل في إجمالي حجم 300-500 ميكرولتر FACS العازلة إلى 1 مل أنابيب اختبار صغيرة أو 5 مل أنابيب جولة القاع.
   13. عينات تعمل على قياس التدفق الخلوي ^17. إذا لا يمكن تشغيل عينات على الفور، وتخزين عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء.

النتائج

جيل فعال من الأسلاف البنكرياس يعتمد على النمو السليم والحفاظ على خلايا غير متمايزة تليها إضافة دقيقة من الجزيئات يشير محددة خلال بروتوكول التمايز، كما هو موضح في التخطيطي في الشكل 1A. في اليوم 0، وينبغي أن تكون خلايا غير متمايزة 80-95٪ متكدسة ?...

Discussion

توليد بنجاح NKX6-1 ⁺ الأسلاف البنكرياس من hPSCs في المختبر يعتمد على استخدام الثقافات جودة عالية من hPSCs والتمايز الموجهة على التنظيم الدقيق لمسارات الإشارات المحددة التي تحكم مراحل النمو الرئيسية خلال تطوير البنكرياس. على الرغم من أن هذا البروتوكول يمكن أن تست?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and cytokines
1-Thioglycerol (MTG)	Sigma	M6145
Activin A	R&D	338-AC/CF
Ascorbic Acid	Sigma	A4544
B-27 Supplement	Life Technologies	12587-010
BD Cytofix/Cytoperm Buffer	BD Bioscience	554722
BD Perm/Wash buffer, 1x	BD Bioscience	554723
bFGF	R&D	233-FB
CHIR990210	Tocris	4423a
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11995
DNase I	VWR	80510-412
Dorsomorphin	Sigma	P5499
EGF	R&D	236-EG
Fetal Bovine Serum (FBS)	Wisent	88150
FGF10	R&D	345-FG
Gelatin from porcine skin	Sigma	G1890
Glutamine	Life Technologies	25030
Nicotinamide	Sigma	NO636
NOGGIN	R&D	3344-NG
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15070-063
Retinoic acid	Sigma	R2625
RPMI Medium 1640	Life Technologies	11875
SANT-1	Tocris	1974
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red	Life Technologies	12605-010
Name	Company	Catalogue Number	Comments
Antibodies for flow cytometry (working dilutions)
CD117 PE (1:100)	Life Technologies	CD11705
CXCR4 APC (1:50)	BD  Bioscience	551966
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L), Alexa Fluor 647 conjugate (1:400)	Life Technologies	A-31571
Donkey Anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488 (1:400)	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	705-546-147
Isotype Control Mouse IgG	Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.	015-000-003
Isotype Control Goat IgG	R&D	AB-108-C
NKX6-1 (1:2,000)	DSHB	F55A10
PDX1 (1:100)	R&D	AF2419