الخلوية الأكسدة التنميط باستخدام عالية المحتوى المجهري

Summary

تقدم هذه الورقة سير العمل المجهري عالية المحتوى لتحديد الكمي في وقت واحد من مستويات روس داخل الخلايا، فضلا عن إمكانات الغشاء الميتوكوندريا والمورفولوجيا - يشار إليها مجتمعة باسم مورفوفونكتيون الميتوكوندريا - في الخلايا الملتصقة الحية باستخدام الخلايا الخلوية جزيئات مراسل الفلورسنت 5- 6) -كلوروميثيل -2 '، 7'- ثنائي كلورودي هيدروفلورسئين دياسيتات، استر أستيل (سم-H ₂ دسفدا) وتيتراميثيلرودامين ميثيلستر (تمرم).

Abstract

أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) تنظم العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك التعبير الجيني، والهجرة، والتمايز والانتشار. ومع ذلك، فإن مستويات روس الزائدة تحفز حالة من الإجهاد التأكسدي، الذي يرافقه الأكسدة لا رجعة فيه الضرر إلى الحمض النووي، والدهون والبروتينات. وبالتالي، الكمي من روس يوفر بديلا مباشرا للحالة الصحية الخلوية. منذ الميتوكوندريا هي من بين المصادر الخلوية الرئيسية وأهداف روس، التحليل المشترك لوظيفة الميتوكوندريا وإنتاج روس في نفس الخلايا أمر بالغ الأهمية لفهم أفضل للربط في الظروف الفيزيولوجية المرضية. لذلك، تم تطوير استراتيجية عالية المستندة إلى المجهري على أساس الكمي في وقت واحد من مستويات روس الخلايا، والغشاء الميتوكوندريا المحتملة (ΔΨ _م ) والتشكل الميتوكوندريا. لأنه يقوم على الآلي ويبيدفيلد المجهر مضان وتحليل الصور من الخلايا الملتصقة الحية، نمت في لوحات متعددة جيدا، وستيند مع جزيئات مراسل الفلورسنت خلية نفاذية سم-H ₂ دكفدا (روس) و تمرم (ΔΨ _م والتشكل الميتوكوندريا). على النقيض من قياس الفلور أو التدفق الخلوي، وهذه الاستراتيجية تسمح الكمي من المعلمات تحت الخلية على مستوى الخلية الفردية مع ارتفاع القرار الزماني الزماني، قبل وبعد التحفيز التجريبي. الأهم من ذلك، فإن الطبيعة القائمة على الصورة من طريقة يسمح استخراج المعلمات المورفولوجية بالإضافة إلى شدة الإشارة. وتستخدم مجموعة الخصائص المجمعة للتحليل الاستكشافي والإحصائي للبيانات المتعددة المتغيرات لكشف الاختلافات بين المجموعات السكانية الفرعية وأنواع الخلايا و / أو العلاجات. هنا، يتم تقديم وصف مفصل للمقايسة، جنبا إلى جنب مع مثال التجربة التي تثبت قدرتها على التمييز لا لبس فيه بين الحالات الخلوية بعد الاضطراب الكيميائي.

Introduction

وينظم تركيز روس داخل الخلايا بدقة من خلال التفاعل الديناميكي بين روس إنتاج ونظم روس إزالة الغبار. الخلل بين اثنين يثير حالة من الاكسدة. من بين المصادر الرئيسية لل روس هي الميتوكوندريا ¹ . نظرا لدورها في التنفس الخلوي، فهي المسؤولة عن الجزء الأكبر من الفوق الخلايا داخل الخلايا (O ₂ ^{• -} ) جزيئات ² . وهذا ينتج في معظمه من تسرب الإلكترون إلى O ₂ في مجمع 1 من سلسلة النقل الإلكترون في ظل ظروف قوية سلبية سلبية الغشاء الميتوكوندريا الداخلي (Δψ _م )، أي فرط الاستقطاب الميتوكوندريا. من ناحية أخرى، كان الاستقطاب الميتوكوندريا يرتبط أيضا مع زيادة إنتاج روس مشيرا إلى وسائط متعددة من العمل ^{3 ، 4 ، 5 ،}> 6 ^{، 7 ، 8} . وعلاوة على ذلك، من خلال التعديلات الأكسدة في البروتينات من الانصهار الانشطار الآلات، روس تشارك في تنظيم التشكل الميتوكوندريا ^9. على سبيل المثال، يرتبط تجزئة مع زيادة إنتاج روس والموت الخلايا المبرمج ^{10 ، 11} ، في حين تم ربط الميتوكوندريا الخيطية إلى المجاعة المغذية والحماية ضد ميتوفاغي ¹² . ونظرا للعلاقة المعقدة بين روس الخلوية والميتوكوندريا مورفوفونكتيون، كلاهما ينبغي أن يكون مثاليا في وقت واحد في الخلايا الحية. للقيام بذلك بالضبط، وقد وضعت مقايسة التصوير عالية المحتوى على أساس المجهري ويديفيلد الآلي وتحليل الصور من الثقافات خلية ملتصقة ملطخة تحقيقات الفلورسنت سم-H ₂ دكفدا (روس) و تمرم (الميتوكوندريا Δψ _م و مورفولوجيا). التصوير عالي المحتوى يشير إلى استخراج سب( أي عدد كبير من السمات الوصفية) معلومات عن المظاهر الخلوية باستخدام علامات تكميلية متعددة وتحليلات الصور الآلية. عندما يقترن المجهري الآلي يمكن فحص العديد من العينات في موازاة ( أي عالية الإنتاجية)، وبالتالي زيادة القوة الإحصائية للمقايسة. في الواقع، أحد الأصول الرئيسية للبروتوكول هو أنه يسمح للكمي في وقت واحد من المعلمات متعددة في نفس الخلية، وهذا لعدد كبير من الخلايا والظروف.

وينقسم البروتوكول إلى 8 أجزاء (وصفها بالتفصيل في البروتوكول أدناه): 1) خلايا البذر في لوحة 96 جيدا. 2) إعداد حلول الأسهم، حلول العمل والتصوير العازلة؛ 3) إعداد المجهر. 4) تحميل الخلايا مع سم-H ₂ دكفدا و تمرم. 5) الأولى الحية التصوير جولة لقياس مستويات روس القاعدية و مورفوفونكتيون الميتوكوندريا. 6) الثانية الحية التصوير جولة بعد إضافة -تيل البوتيلبيروكسيد (تبهب) لقياس مستويات روس المستحثة؛ 7) الآلي تحليل الصور؛ 8) تحليل البيانات، ومراقبة الجودة والتصور.

وقد وضعت في الأصل أصلا لالألياف الليفية البشرية البشرية الطبيعية (ندف). وبما أن هذه الخلايا كبيرة ومسطحة، فهي مناسبة تماما لتقييم مورفولوجيا الميتوكوندريا في 2D ويديفيلد الصور ^{13 ، 14} . ومع ذلك، مع تعديلات طفيفة، هذه الطريقة تنطبق على أنواع الخلايا الملتصقة الأخرى. وعلاوة على ذلك، بجانب مزيج من سم-H ₂ دكفدا و تمرم، سير العمل يتوافق مع مجموعة متنوعة من أزواج صبغ الفلورسنت مع الخصائص الجزيئية المختلفة ^{1 ، 15} .

Protocol

يوصف البروتوكول أدناه على أنها نفذت للخلايا ندف ومع استخدام لوحات مولتيويل المحددة في ملف المواد. انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة حول سير العمل.

1. إعداد الكواشف

1. إعداد المتوسطة كاملة عن طريق استكمال دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) مع 10٪ V / V مصل البقري الجنين (فبس) و 100 إيو / مل البنسلين و 100 إيو / مل الستربتومايسين (بس). ل 500 مل المتوسطة كاملة، إضافة 50 مل من فبس و 5 مل من بس إلى 445 مل من دمم.
2. إعداد هبس (ه) العازلة التصوير عن طريق استكمال حل الملح المتوازن هانك (مع المغنيسيوم والكالسيوم، ولكن من دون الفينول الأحمر) مع 20 ملي هيبيس. ل 500 ملل ساعة، إضافة 10 مل من محلول الأسهم هيبيس 1M إلى 490 مل هبس. تحقق من الرقم الهيدروجيني، وإذا لزم الأمر، والضبط لدرجة الحموضة 7.2.
3. إعداد 1 ملم سم-H ₂ حل الأسهم دكفدا عن طريق إذابة 50 ميكروغرام من سم-H ₂ دكفدا مسحوق مجفف بالتجميد في 86.5 &# 181؛ L اللامائية دمسو. مزيج من قبل فورتيكسينغ أو بيبتينغ صعودا وهبوطا وجعل 20 أليكوتس ميكرولتر في أنابيب ميكروسنتريفوج البني. مخزن في الظلام في -20 درجة مئوية واستخدامها في غضون 1 أسبوع. إذا تخزينها تحت N- ₂ الغلاف الجوي الجرف الحياة يمكن زيادة تصل إلى 1 شهر على الأقل.
   1. إعداد 1 ملي حل المخزون تمرم عن طريق إذابة 25 ملغ مسحوق تمرم في 50 مل دمسو اللامائية. مزيج بواسطة فورتيكسينغ أو بيبتينغ صعودا وهبوطا وجعل 10 قسامة ميكرولتر في أنابيب ميكروسنتريفوج البني. تخزين في الظلام في -20 درجة مئوية. هذا الحل مستقر لمدة سنة على الأقل.
4. إعداد قسامة جديدة من تيرت -butyl بيروكسيد (تبهب) الأسهم (~ 7 M) لكل تجربة من قبل بيبتينغ مباشرة حجم من الحل الأسهم 70٪ (10 ميكرولتر / 96 جيدا لوحة). إبقاء هذه قسامة في 4 درجات مئوية حتى مزيد من الاستخدام.
5. إعداد الأجسام المضادة حل العمل (أب) عن طريق تمييع اثنين من الأجسام المضادة الثانوية (اليكسا فلور 488 حمار المضادة للأرنب و CY3 حمار المضادة للأرنب) 1،000 مرة في 1X ه-بوffer.

2. إعداد المجهر والبروتوكول اكتساب (± 15 دقيقة)

ملاحظة: يتم تنفيذ اكتساب الصورة مع المجهر حقل واسع مجهزة مرحلة الآلي والمصاريع، ونظام ضبط تلقائي للصورة الأجهزة القائمة باستخدام 20X الهواء خطة تصحيح الهدف (نا = 0.75) وكاميرا إم-كسد. عند إعداد الفحص لأول مرة، يتم استخدام لوحة اختبار تحتوي على خلايا التحكم، ملطخة وفقا لتعليمات البروتوكول لمعايرة المرحلة زي وتحسين إعدادات الاستحواذ. إذا تم بالفعل تحديد إعدادات الاستحواذ، يمكن أن يتم المعايرة باستخدام لوحة فارغة.

1. خفض الهدف إلى مستوى القاعدة المطلقة ومعايرة XY- مرحلة التالية تعليمات البرمجيات.
2. تأكد من تثبيت مكعبات التصفية الصحيحة. لتصور سم-H ₂ دكفدا، استخدم معيار فلتر غفب مكعب مع 472/30 نانومتر مرشح ممر الموجة، 495 نانومتر قطع ديكروومرآة إيك وفلتر انبعاث الموجة العمودية 520/35 نانومتر. ل تمرم، استخدام مكعب فلتر ل تريتك مع 540/25 نانومتر باندباس الإثارة مرشح، 565 نانومتر قطع مزدوج اللون ومرآة و 605/55 نانومتر مرشح انبوب الموجة.
3. إنشاء بروتوكول التصوير باستخدام برنامج الاستحواذ.
   1. حدد النوع الصحيح من لوحة مولتيويل (الشركة المصنعة ورمز) من قائمة لوحات المتاحة المقدمة داخل البرنامج. بدلا من ذلك تحديد شكل لوحة مولتيويل الخاصة باستخدام لوحة وأبعاد جيدا.
   2. محاذاة لوحة جيدا وفقا لتعليمات البرنامج، على سبيل المثال عن طريق تحديد زوايا اثنين من آبار الزاوية الخارجية الأربعة. تغطي هذه الخطوة لتغيير اتجاه الكاميرا.
   3. حدد الآبار التي تحتاج إلى الحصول عليها. إذا كان هذا الخيار غير متوفر في البرنامج، استخدم مجموعة من المواقع زي المحددة يدويا التي تتوافق مع الآبار المحددة.
   4. تحسين إعدادات الاستحواذ (وقت التعرض، وكثافة مصباح، إم الربح) له قناتين بشكل منفصل باستخدام لوحة الاختبار. تقليل التعرض وكثافة كما ضوء الإثارة مضان نفسه يدفع روس. ولكن، تأكد من أن نسبة الإشارة إلى الخلفية هي على الأقل 2 لالقاعدية سم-H ₂ دسفدا و 3 ل تمرم قبل العلاج تبهب، وأنه لا يوجد تشبع بعد العلاج تبهب. إعدادات الاكتساب تعتمد إلى حد كبير على الإعداد المجهري ونوع الخلية المستخدمة، ولكن كمرجع، وإعدادات الإرشادية عند استخدام لمبة هاليد معدنية من 130 W كمصدر للضوء وخلايا ندف الملطخة وفقا لتعليمات البروتوكول هي التالية: لكل من CM- H ₂ دكفدا و تمرم يستخدم وقت التعرض 200 مللي ثانية و ند مرشح 8، جنبا إلى جنب مع كسب إم من 15 (13 ميغاهرتز؛ 14 بت) و 4 (27 ميغاهرتز؛ 14 بت) على التوالي. مرة واحدة الأمثل لنوع معين من الإعداد ونوع الخلية، يمكن تخطي هذه الخطوة.
      ملاحظة: من الضروري أن يتم الاحتفاظ إعدادات الاكتساب نفسه خلال عملية التصوير بأكملها. لتجارب واسعة النطاق، لعدة أيام، مصباح ستابيليتي ينبغي أن تكون مبررة من قبل مراقبة الجودة العادية.
   5. تحديد بروتوكول الاستحواذ، ويتألف من لامدا متتابعة (الطول الموجي) الاستحواذ. حدد قناة سم-H ₂ دسفدا التي سيتم الحصول عليها أولا، لتقليل التعرض للضوء قبل القياس.
   6. تحديد حلقة جيدا لوحة، للحصول على 4 متباعدة بشكل منتظم الصور غير متداخلة المتمركزة حول مركز كل بئر من اختيار جيدا باستخدام بروتوكول الاستحواذ المعرفة في 2.3.4. اختيار الحصول على صورة متعرجة، أي، أولا من اليسار إلى اليمين، من B02 جيدا إلى B11، ثم مرة أخرى، من اليمين إلى اليسار، من جيدا C11 إلى C02 وهلم جرا ( الشكل 2A ). هذا يوفر الوقت مقارنة اليسار إلى اليمين الحصول على الصور. إذا كان هذا الخيار غير متوفر في البرنامج، وضبط مجموعة مخصصة من X- المواقع التي تم إنشاؤها في 2.3.3 لاتخاذ على هذا النمط التصوير.
   7. حفظ الإحداثيات زي من مواقع التصوير (على سبيل المثال في ملف شمل منفصلة)، للسماح سهلة المراجعةنانوغرام في حالة المجهر إعادة معايرة. هذا مهم بشكل خاص إذا كان يجب أن تكون مرتبطة قراءات من هذا الفحص مع المناعي بعد تلطيخ (إف) تلطيخ لنفس الخلايا.

3 - خلايا البذر في لوحة 96 جيدا (45 - 90 دقيقة، اعتمادا على عدد من خطوط الخلايا المختلفة)

1. العمل في بيئة معقمة مثل فئة 2 السلامة الأحيائية مجلس الوزراء وارتداء قفازات.
2. تطهير جميع الأسطح والمواد باستخدام 70٪ v / v الايثانول في الماء المقطر.
3. اتخاذ قارورة ثقافة الخلية مع ثقافة الخلايا متموجة 90٪ من الحاضنة ووضعه في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
4. غسل الخلايا مرتين مع بس 1X.
5. إضافة كمية مناسبة من 0.05٪ التربسين-إدتا الحل على الخلايا، والتأكد من أن يتم تغطية سطح الخلية كاملة (على سبيل المثال ، 1 مل لقارورة T25)، واحتضان لمدة 2 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ كو ₂ .
6. إذا كانت جميع الخلايا منفصلة (تحقق مع المجهر )، إضافة ثقافة المتوسطة (دمم + 10٪ فبس + 1٪ البنسلين ستربتومايسين؛ ± 4 مل في قارورة T25) لتعطيل الحل التربسين إدتا.
7. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ج في درجة حرارة الغرفة.
8. تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية في وسط الاستزراع. تحديد كمية المتوسطة لكل نوع من الخلايا للحصول على تركيز الخلية التي تتوافق مع عد الخلايا. عادة، يحتوي على قارورة T25 متموجة T25 من ندف ما يقرب من 1-1.5 مليون الخلايا، التي معلق في 3-4 مل من وسط الثقافة.
9. عد الخلايا باستخدام غرفة عد الخلايا أو عداد كولتر.
10. البذور 8،000-10،000 الخلايا في كل من 60 بئرا الداخلية لوحة سوداء 96 جيدا مع رقيقة رقيقة البوليسترين أو أسفل الزجاج (أسود لتجنب تشتت والتقاطع بين الآبار المجاورة أثناء التصوير). عند استخدام ظروف مختلفة / العلاجات / خطوط الخلايا، وتوزيع مواقع البذر الخاصة بهم متجانسة على لوحة وذلك للحد من الآثار لوحة (التين "> الشكل 2 أ)، ولا تستخدم الآبار الخارجية، باستثناء البئر B01 و A01، لأنها أكثر عرضة لآثار الحافة.
11. البذور 8،000-10،000 الخلايا في B01. وسيتم استخدام هذا جيدا لتعديل التركيز، فقط قبل الحصول على الصور.
12. ملء الآبار الخارجية الفارغة مع المتوسطة لتقليل التدرجات (درجة الحرارة والرطوبة، وما إلى ذلك ) بين الآبار والبيئة.
13. اضغط برفق على لوحة ثلاث مرات قبل وضعها مرة أخرى في الحاضنة لتجنب الخلايا من النمو في بقع.
14. ثقافة الخلايا لمدة 24 ساعة، أو ما يصل إلى درجة التقاء تقريبا. 70٪.
15. احفظ معلومات المعالجة للتجربة في جدول بيانات يسمى "Setup.xlsx". يجب أن يحتوي الملف على أربعة أعمدة وسيتم استخدامها لربط العلاجات مع الآبار ومعلومات الصورة أثناء تحليل البيانات. الأعمدة الأربعة هي: 'حسنا'، 'تراتمنتنمبر'، 'العلاج' و 'السيطرة' (صف واحد لكل بئر). يقترن كل علاجمع عدد معالجة فريدة من نوعها، والذي يستخدم أثناء التصور البيانات لتحديد ترتيب العلاجات على محور X من المؤامرات. يحدد عمود التحكم العلاج الذي يعمل كعلاج للتحكم في الصف الحالي. يتم توضيح الرسوم التوضيحية للتخطيط التجريبي نموذجي وملف الإعداد المقابلة في الشكل 2 .

4. تحميل الخلايا مع سم-H ₂ دكفدا و تمرم (± 45 دقيقة)

ملاحظة: يمكن أن يتم التعامل مع الخلايا في يوم التجربة في بيئة معقمة (مجلس الوزراء السلامة الأحيائية)، ولكن هذا ليس إلزاميا لأن الخلايا سيتم تجاهلها أو إصلاحها مباشرة بعد الفحص.

1. تسخين ه-العازلة إلى 37 درجة مئوية.
2. إعداد 20 ميكرومتر حل تمرم العمل عن طريق تمييع الحل الأسهم ملم 1 مرات في ه-العازلة (إضافة 490 ميكرولتر من ه-العازلة إلى قسامة 1 من 10 ميكرولتر حل الأسهم تمرم).
3. إعداد الحملإنغ مع 2 ميكرومتر سم-H ₂ دكفدا و 100 نم تمرم. تحقيقا لهذه الغاية، تمييع 1 ملم سم-H ₂ دكسفدا حل الأسهم 500X و 20 ميكرومتر تمرم حل العمل 200X في ه-العازلة.
   1. عادة، لمدة 60 بئرا، وإعداد 7.5 مل من محلول التحميل عن طريق إضافة 15 ميكرولتر من سم-H ₂ دسفدا و 37.5 ميكرولتر من حل تمرم إلى 7447.5 ميكرولتر من سمو.
4. تجاهل الوسط الثقافي من الخلايا عن طريق تحويل لوحة رأسا على عقب في حركة السائل واحد.
5. غسل بلطف الخلايا مرتين مع ه-العازلة باستخدام ماصة الأقنية (100 ميكرولتر / جيدا). تجاهل ه-العازلة في بين خطوات الغسيل عن طريق تحويل لوحة رأسا على عقب في حركة السائل واحد.
6. تحميل الخلايا مع سم-H ₂ دكفدا و تمرم عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من حل التحميل إلى كل بئر، مرة أخرى باستخدام ماصة الأقنية. احتضان لمدة 25 دقيقة في الظلام، في درجة حرارة الغرفة. لا ننسى جيدا B01.
7. خلال هذه 25 دقيقة، وإعداد حلول العمل من تبهب أكسدة وتأكد من تشغيل المجهر والأجهزة التبعي على.
   1. إعداد حل العمل الأول: تمييع الحل 7M الأسهم 70X إلى 100 ملم (10 الأسهم ميكرولتر في 690 ميكرولتر ه-العازلة).
   2. إعداد حل العمل الثاني: تمييع وس أنا 100X إلى 1 ملم (10 ميكرولتر وس I في 990 ميكرولتر ه-العازلة).
   3. إعداد حل العمل الثالث: تمييع وس إي 25X إلى 40 ميكرومتر (لمدة 60 بئرا إضافة 300 ميكرولتر وس الثاني في 7200 ميكرولتر العازلة س).
8. بعد 25 دقيقة، وغسل الخلايا مرة أخرى مرتين مع 100 ميكرولتر ه-العازلة كما هو موضح من قبل.
9. إضافة 100 ميكرولتر من ه-العازلة إلى جميع الآبار الداخلية 60.

5. أول لايف التصوير جولة لقياس مستويات بروس روس والميتوكوندريا مورفوفونكتيون (± 15 دقيقة)

1. تأكد من أن برنامج الاستحواذ قيد التشغيل ويتم تحميل بروتوكول التصوير.
2. تثبيت لوحة على المجهر، بدوره على الأجهزة باسيد ضبط تلقائي للصورة واستخدام B01 جيدا لضبط ضبط تلقائي للصورة تعويض باستخدام قناة تمرم. كما يؤدي هذا الإجراء زيادة في كثافة إشارة سم-H ₂ دكفدا، يتم استبعاد هذا جيدا من تحليل الصورة المصب.
3. تشغيل بروتوكول التصوير.

6. الثانية لايف التصوير جولة بعد إضافة تبهب لقياس مستحث روس مستويات (± 20 دقيقة)

1. إزالة بعناية لوحة 96 جيدا من المجهر.
2. إضافة 100 ميكرولتر من تبهب وس الثالث (40 ميكرومتر) إلى كل بئر باستخدام ماصة الأقنية (وهذا يؤدي إلى تركيز 20 ميكرومتر تبهب في الآبار). يستخدم هذا المركب كسيطرة إيجابية داخلية لتلطيخ سم-H ₂ دكفدا (يجب أن ترتفع الإشارة)، فضلا عن وسيلة لقياس مستويات روس المستحثة.
   ملاحظة: H2 O ₂ يمكن أن تستخدم أيضا بدلا من تبهب، ولكن هذا المركب هو أقل استقرارا وبالتالي أقل موثوقية.
3. انتظر 3 دقائق على الأقل للسماح رد فعل كامل من تبهب wإيث سم-H ₂ دكفدا.
4. خلال هذا الوقت، إضافة 100 ميكرولتر الأضداد حل العمل (1/1000) إلى A01 جيدا.
5. جبل لوحة مرة أخرى على المجهر والتحقق من التركيز مرة أخرى باستخدام B01 جيدا.
6. الحصول على نفس المواقف كما في الجولة التصوير الأولى باستخدام نفس بروتوكول التصوير.
7. تصدير مجموعات البيانات المكتسبة في مجلد واحد كملفات تيف الفردية باستخدام تسميات موحدة تتضمن إشارة إلى لوحة، قبل أو بعد تبهب العلاج، حسنا، الحقل والقناة، مفصولة سفلية، على سبيل المثال . 'P01_Pre_B02_0001_C1' للوحة 1، والعلاج قبل تبهب، حسنا B02، الحقل 1 والقناة 1. سيتم استخدام هذه المعلومات أثناء تحليل الصور (على سبيل المثال لتحديد إعدادات تجزئة المناسبة)، وكذلك أثناء تحليل البيانات (لربط بيانات التحليل مع العلاجات الصحيحة).
8. الحصول على صور حقل شقة لكلا القنوات على جميع المراكز الأربعة في جميع أنحاء مركز A01 جيدا باستخدام بروتوكول الاستحواذ. حفظ ثإم كملفات تيف الفردية في نفس المجلد مثل الصور الأخرى باستخدام التسميات الموحدة التالية: 'P01_FF_A01_0001_C1' للوحة 1، الحقل 1 والقناة 1. تأكد من أن الإشارات هي داخل النطاق الديناميكي. في حالة التشبع، استخدام تركيز أقل من حل العمل الأجسام المضادة.
9. تجاهل لوحة أو حفظ لمزيد من المعالجة.
   ملاحظة: بدلا من إزالة لوحة من المجهر واستخدام ماصة الأقنية لإضافة حل تبهب، ماصة الآلي يمكن تركيبها على مرحلة المجهر ومتصلة مع برنامج الاستحواذ وذلك للعمل عند تلقي الزناد. وهذا يسمح لإضافة تبهب إلى كل بئر مباشرة بعد عملية الاستحواذ الأولى، قبل الانتقال إلى بئر المقبل. بهذه الطريقة، عند الانتهاء من الجولة التصوير الأولى، والثانية يمكن أن تبدأ على الفور، وسوف يكون جميع الآبار وقتا حضانة متساوية مع تبهب.

7. معالجة الصور وتحليلها (± 30 دقيقة لكل96-جيدا لوحة)

ملاحظة: يتم تنفيذ جميع معالجة الصور في فيجي (http://fiji.sc)، نسخة معبأة من إيماجيج مجانية. كتب مكتوب مخصص للتحليل الآلي للإشارات ROS- الميتوكوندريا داخل الخلايا، وكذلك المعلمات المورفولوجية (RedoxMetrics.ijm، وهي متاحة عند الطلب). يتم وصف الخوارزميات الكامنة في سيبراث إت آل. ^{1 -}

1. تأكد من تثبيت فيجي وتشغيلها.
2. بدء فيجي وتثبيت مجموعة الماكرو (الإضافات -> وحدات الماكرو -> تثبيت ...). وهذا سوف استدعاء عدد من الأوامر الماكرو الجديدة فضلا عن مجموعة من أدوات العمل لتحسين إعدادات التحليل، كما هو مبين في الشكل 3A .
3. فتح واجهة الإعداد لضبط إعدادات التحليل عن طريق النقر على زر 'S' ( الشكل 3B ).
   1. حدد نوع الصورة، وعدد القنوات والبئر الذي تم استخدامهللحصول على صور مسطحة.
   2. تشير إلى القناة التي تحتوي على خلايا (سم-H ₂ قناة دكفدا) أو الميتوكوندريا (تمرم قناة) وضبط معلمات ما قبل المعالجة والتجزئة لكل قناة اعتمادا على جودة الصورة ( الشكل 3B ). ضع علامة على خانات "الخلفية" و "التباين" لأداء الطرح الخلفية أو النقيض محدود التكيف الرسم البياني المعادلة ¹⁶ ، على التوالي. تحديد سيغما لخلط غاوس من الخلايا وتعزيز لابلاسيان الميتوكوندريا. حدد خوارزمية عتبة تلقائية وتملأ حدود استبعاد الحجم (بالبكسل). إذا تم اختيار عتبة ثابتة بدلا من خوارزمية العتبة التلقائية، املأ العتبة العليا.
   3. اختبار إعدادات تجزئة على عدد قليل من الصور المحددة لمجموعات البيانات المكتسبة عن طريق فتحها والنقر على أزرار 'C' أو 'M' في القائمة لخلية أو الميتوكوندريا تجزئة على التوالي،وضبط الإعدادات إذا لزم الأمر. ويرد مثال النتيجة في الشكل 3C .
4. تشغيل تحليل دفعة على مجلد (ق) من الفائدة عن طريق النقر على زر '#' واختيار المجلد مع الصور. لكل مجلد، وهذا سوف ينتج الدليل 'الإخراج' الجديد، التي تحتوي على مجموعات روي الفردية (ملفات زيب) وملفات النتيجة (.txt) لكل صورة. لكل من القنوات ملف النتائج يحتوي على الكثافة والوصف المورفولوجية. يحتوي ملف النتائج (الخلايا) سم-H ₂ دكفدا (الخلايا) على كل واصف متوسط ​​القيمة لعائدات الاستثمار المجمعة ضمن صورة واحدة. بالنسبة لقناة تمرم، يحتوي ملف النتائج على كل واصف القيمة لكل عائد استثمار ميتوكوندريا فردي مجزأ.
5. بعد تحليل دفعة، والتحقق بصريا أداء تجزئة على "كومة التحقق"، فرط ضغط من جميع الصور مع تراكب روي منها عن طريق النقر على زر 'V'. وبهذه الطريقة، فإن التحف،/ التفكك السفلي، من الصور البؤرية أو جزيئات الغبار / الألياف في الصور يمكن رصدها بسرعة. ويمكن إجراء المزيد من التنظيم أثناء مراقبة جودة البيانات (الفقرة 8).

8. تحليل البيانات، مراقبة الجودة (ق) والتصور

يتم معالجة وتحليل البيانات الخام باستخدام R مجانية إحصائية (http://www.rproject.org - الإصدار 3.3.2) و رستوديو (http://www.rstudio.com/ - الإصدار 1.0.44). للحصول بسرعة و تصور النتائج، وقد تم تصميم تصور بديهية لامعة ¹⁷ (المتاحة عند الطلب) أن يدمج ويصور البيانات في هيتمابس و بوكسلوتس، ويؤدي أيضا التحليلات الإحصائية. بشكل عام، يتكون سير العمل من خطوتين متتاليتين. أولا، تتم معالجة البيانات وتفتيشها في لوحة 96-جيدا للكشف عن نقاط البيانات الشاذة. ثانيا، يتم تجميع البيانات المنسقة من جميع لوحات تجربة معينة وتحليلها باستخدام غير المعلمة متعددةاختبارات الاختلاف 18 وتحليل المكون الرئيسي.

1. تأكد من تثبيت R و رستوديو وتشغيلها.
2. بدء رستوديو.
3. فتح تطبيق لامعة ريدوكسمتريكس وتشغيل التطبيق (اختيار لتشغيله في متصفح خارجي).
4. في الصفحة "إدخال"، حدد الدليل حيث توجد ملفات النتائج من RedoxMetrics.ijm.
5. تأكد من وجود "Setup.xlsx" (تم إنشاؤه في الخطوة 3.15) أيضا داخل هذا الدليل.
6. يتم استيراد ملفات النتائج ومعلومات الإعداد تلقائيا، وإعادة ترتيب وتصور.
   1. تعرض صفحة "الإعداد التجريبي" تخطيط التجربة. استخدم هذه الصفحة للتحقق منها.
   2. الصفحة التالية، 'النتائج لكل لوحة' يظهر البيانات لكل لوحة على حدة في تخطيط لوحة متعددة بلون مرمزة وكذلك في بوكسلوتس مع القيم المتطرفة المسمى مع اسم جيدا ورقم الصورة. هذا الأخير يسمح التفتيش وهوية(القيم العالية أو المنخفضة للغاية مقارنة بالمتوسط ​​القيم المقاسة لتلك المعاملة المحددة - انظر الشكل 4 للحصول على مثال).
      باستخدام هذه المعلومات، تحقق من الصور المقابلة للنقاط الشاذة. إذا تم الكشف عن تشوهات، يجب إزالتها من التحليل. وتحدث معظم الشذوذ عن تجزئة غير لائق عندما (جزء) من الصورة هو خارج التركيز، أو عندما جزيئات الغبار الفلورسنت عالية تخل التقسيم الصحيح. يمكن بالفعل رصد الحالات المتطرفة بسرعة باستخدام أداة المكدس التحقق (الخطوة 7.5)، ولكن يتم اكتشاف المزيد من الحوادث الدقيقة في هذه الخطوة. عندما لا يمكن العثور على سبب واضح أو تقني للقيمة الشاذة، لا ينبغي إزالة الصورة من التحليل.
   3. اختياري: إنشاء جدول بيانات جديد يسمى 'Drop.xlsx' مع عمود واحد فقط يسمى 'قطرة'. في هذا العمود، قم بإدراج أسماء الملفات (بما في ذلك ".tif" ملحق) من جميع الصورالتي يجب إزالتها من التحليل (المحدد في الخطوة 7.5 أو الخطوة 8.6.2). حمل هذا الملف باستخدام صفحة "الإدخال".
   4. تعرض صفحة "نتائج التجربة بأكملها" النتائج من جميع اللوحات مجتمعة. إذا تم تحميل ملف إسقاط، يتم استخدام هذا الملف لإزالة نقاط البيانات المحددة من التحليل.
      لكل معلمة على حدة، يتم تطبيع البيانات لكل لوحة وفقا لضوابط كل منها. ثم يتم تجميع البيانات من جميع لوحات، تليها اختبارات متعددة المتغيرات غير المعلمية من حزمة نباربكوم ¹⁸ . إذا تمت مقارنة اثنين فقط من العلاجين يتم إجراء اختبارين عينة للمشكلة ببارنز فيشر غير بارامتري. لأكثر من 2 العلاجات، يتم استخدام اختبار مقارنة متعددة على أساس التباين غير البارامترية. يتم تصور النتائج باستخدام بوكسبلوتس.
   5. صفحة "تحليل العنقودية" تظهر نتائج تحليل المكون الرئيسي (يكا - R الأساسية "حزمة" احصائيات). البيانات من 5 معلمات (باسال و التي يسببها روس، والغشاء الميتوكوندريا المحتملة، وحجم ودورية) جنبا إلى جنب لتمييز العلاجات المختلفة على أساس الشخصية الأكسدة الحساسة. وتحقيقا لهذه الغاية، يتم تنفيذ تحليل المكون الرئيسي (يكا) (R الأساسية 'احصائيات' حزمة). وتصور النتائج باستخدام بيبلوت (حزمة غبيبلوت - http://github.com/vqv/ggbiplot).
   6. استخدم صفحة "تنزيل البيانات" لتنزيل أطر بيانات الواجهة الخلفية التي تحتوي على البيانات التي تمت معالجتها وإعادة ترتيبها بحيث يمكن إعادة استخدامها للحصول على تصور بيانات أكثر تقدما أو تحليلات إحصائية.
      ملاحظة: المزالق النموذجية والحلول المحتملة مدرجة في الجدول 1 .

النتائج

وقد تم قياس مقايسة باستخدام العديد من التجارب السيطرة، ونتائجها وصفها في سيبراث وآخرون. ^{1 -} وباختصار، فإن استجابة مضان سم-H ₂ دكفدا و تمرم إلى التغيرات التي يسببها خارجيا في روس الخلايا و Δψ _{م، على} التوالي تم تحديدها لتحد?...

Discussion

تصف هذه الورقة طريقة عالية المجهر المحتوى للكمية في وقت واحد من مستويات روس داخل الخلايا و مورفوفونكتيون الميتوكوندريا في ندف. وأظهرت أدائها مع دراسة حالة عن ندف الصندوق العالمي للمصايد. النتائج تدعم الأدلة السابقة من الأدب التي زادت مستويات روس أو ضعف الميتوكوندري...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Tetramethylrhodamine, Methyl Ester, Perchlorate (TMRM)	ThermoFisher Scientific	T668
CM-H2DCFDA (General Oxidative Stress Indicator)	ThermoFisher Scientific	C6827
Dimethyl sulfoxide	Sigma)Aldrich	D8418
MatriPlate 96-Well Glass Bottom MicroWell Plate 630 µL-Black 0.17 mm Low Glass Lidded	Brooks life science systems	MGB096-1-2-LG-L
HBSS w/o Phenol Red 500 mL	Lonza	BE10-527F
DMEM high glucose with L-glutamine	Lonza	BE12-604F
Phosphate Bufered Saline (PBS) w/o Ca and Mg	Lonza	BE17-516F
HEPES 1 M 500 mL	Lonza	17-737F
Trypsin-Versene (EDTA) Solution	Lonza	BE17-161E
Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-166-152	Antibody used for acquiring flat-field image
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson	711-546-152	Antibody used for acquiring flat-field image
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Nikon Ti eclipse widefield microscope	Nikon
Perfect Focus System (PFS)	Nikon		hardware-based autofocus system
CFI Plan Apo Lambda 20X objective	Nikon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 with JOBS module	Nikon		This software is used to steer the microscope and program/perform the automatic image acquisition prototocol
ImageJ (FIJI) Version 2.0.0-rc-43/1.50g
RStudio Version 1.0.44	Rstudio
R version 3.3.2