توليف حيويا الكريستال السائل المرنة كسوات كما السقالات الخليوي لزراعات الخلايا 3D المكانية

Summary

تقدم هذه الدراسة منهجية لإعداد 3D، قابلة للتحلل، السقالات خلية تشبه الرغوة على أساس الجانب سلسلة اللدائن الكريستال السائل حيويا (LCEs). تبين التجارب المجهري متحد البؤر التي LCEs مثل رغوة تسمح لمرفق الخلية، والانتشار، والمحاذاة التلقائية للmyoblasts C2C12s.

Abstract

هنا، نقدم إعداد خطوة بخطوة ل3D، قابلة للتحلل، مثل رغوة خلية سقالة. والتي عبر ربط كتلة النجم المشارك البوليمرات يضم وحدات الكولسترول كمجموعات الجانبية سلسلة قلادة، مما أدى إلى smectic-A (SMA) اللدائن الكريستال السائل (LCEs) التي أعدت هذه السقالات. السقالات تشبه الرغوة، أعدت باستخدام قوالب معدنية، ميزة microchannels المترابطة، مما يجعلها مناسبة كما السقالات زراعة الخلايا 3D. الخصائص المشتركة للهيكل منتظم من رغوة المعادن ونتيجة المطاط الصناعي في سقالة خلية 3D تعزز العالي ليس فقط تكاثر الخلايا بالمقارنة مع الأفلام التقليدية التي يسهل اختراقها قالب، ولكن الإدارة أيضا أفضل من النقل الجماعي (أي المواد المغذية والغازات والنفايات ، وما إلى ذلك). طبيعة القالب المعدني تسمح للتلاعب السهل من الأشكال رغوة (أي، لفات أو الأفلام) ولإعداد السقالات أحجام المسام المختلفة للدراسات مختلفة من الخلايا مع الحفاظ على interconnecتيد طبيعة المسامية من القالب. عملية الحفر لا يؤثر على كيمياء اللدائن، والحفاظ على طبيعتها حيويا والقابلة للتحلل. وتبين لنا أن هذه LCEs smectic، عندما نمت لفترات زمنية واسعة، وتمكين دراسة بنيات الأنسجة ذات الصلة ومعقدة سريريا مع تعزيز نمو وانتشار الخلايا.

Introduction

وهناك العديد من الأمثلة من المواد الاصطناعية البيولوجية وحيويا لتطبيقها في دراسات الخلايا وتجديد الأنسجة التي تهدف إلى مرفق الخلية وانتشار ^{1، 2، 3، 4، 5.} وكانت هناك أمثلة قليلة من المواد حيويا، والمعروفة باسم اللدائن الكريستال السائل (LCEs)، يمكن أن يستجيب للمؤثرات الخارجية مع متباين الخواص الجزيئية طلب ^{6 و 7.} LCEs هي مواد المحفزات متجاوبة التي تجمع بين الخواص الميكانيكية ومرنة من اللدائن مع وظيفة البصرية وترتيب الجزيئية من البلورات السائلة ^{8 و 9.} يمكن LCEs تجربة تغييرات في الشكل وتشوه الميكانيكية، وسلوك مرن، والخصائص البصرية ردا على STIM الخارجيةاولي (أي.، الحرارة، والإجهاد، والضوء، وما إلى ذلك) ^{10، 11، 12، 13، 14، 15، 16.} وقد أظهرت دراسات سابقة أن البلورات السائلة (خطابات الاعتماد) يمكن الشعور نمو وتوجيه الخلايا ^{4، 17.} ومن ثم من الممكن أن نفترض أن LCEs قد تكون مناسبة للتطبيقات البيولوجية والطبية ذات الصلة، بما في ذلك السقالات الخلية والمحاذاة. لقد ذكرت سابقا إعداد smectic الأفلام حيويا، قابلة للتحلل، ويلقي مصبوب، وLCEs رقيقة يضم "نوع السويسري الجبن" مورفولوجيا التي يسهل اختراقها ^{6، 18.} ونحن على استعداد أيضا LCEs حيويا خيطي مع التشكل كروي كما السقالات لنمو الخلايا ¹⁹ <سوب>، ^20. ويهدف عملنا في ضبط الخواص الميكانيكية للمواد بحيث تتطابق مع تلك الأنسجة من الفائدة ^21. أيضا، وتركز هذه الدراسات على فهم التفاعلات المطاط الصناعي خلايا، فضلا عن الاستجابة الخلوية عندما اللدائن تخضع للمؤثرات الخارجية.

كانت التحديات الرئيسية في جزء منه إلى تكييف المسامية من LCEs للسماح لمرفق الخلية وتخلل من خلال مصفوفة المطاط الصناعي والنقل الجماعي أفضل. مسامية من هذه الأفلام رقيقة ⁶ سمحت تخلل الخلية من خلال الجزء الأكبر من المصفوفة، ولكن لم تكن كل المسام مترابطة كليا أو كان حجم أكثر انتظاما (متجانسة) المسام. نحن بعد ذلك تقريرا عن حيويا اللدائن LCE خيطي مع الأشكال التضاريسية الكروية. هذه اللدائن خيطي سمحت للمرفق وتكاثر الخلايا، ولكن تراوح حجم المسام فقط 10-30 ميكرومتر، والتي منعت أو استخدام هذه محدودةاللدائن مع مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا ^{19 و 20.}

الأعمال السابقة التي الكونغ آخرون. المتعلقة بتشكيل الرغاوي الجرافين باستخدام "الأضاحي" قالب معدني أظهرت أن رغوة الجرافين التي تم الحصول عليها كان لها التشكل التي يسهل اختراقها العادية جدا التي يمليها قالب معدني اختيار ^22. تقدم هذه المنهجية السيطرة الكاملة على المسامية وحجم المسام. في الوقت نفسه، على تطويع والمرونة من القالب المعدني تسمح لتشكيل قالب مختلف الأشكال قبل إعداد الرغوة. تقنيات أخرى، مثل الرشح المواد ^23، النموذجيه الغاز ^24، أو ألياف نسج الكهربائية ^{25 و 26} كما تقدم إمكانية إعداد المواد المسامية، لكنها أكثر استهلاكا للوقت، وفي بعض الحالات، يقتصر حجم المسام ل فقط عدد قليل من ميكرومتر. رغوةتشبه LCEs 3D أعدت باستخدام قوالب معدنية تسمح لتحميل خلية العالي؛ تحسين معدل انتشار. شارك في زراعة؛ وأخيرا وليس آخرا، وتحسين إدارة النقل الجماعي (أي المواد الغذائية، والغازات، والنفايات) لضمان تنمية الأنسجة الكاملة ^27. تظهر مثل رغوة LCEs 3D أيضا إلى تحسين المواءمة الخلية؛ وهذا هو الأرجح فيما يتعلق المعلقات LC الاستشعار عن نمو الخلايا والتوجه الخلية. وجود الأنصاف LC داخل LCE يبدو لتعزيز التوافق خلية فيما يتعلق موقع خلية داخل سقالة LCE. خلايا محاذاة داخل الدعامات من LCE، في حين لوحظ أي اتجاه واضح حيث تنضم الدعامات معا (تقاطعات) ^27.

وعموما، لدينا LCE منصة خلية سقالة كوسيلة دعم الخلية تتيح فرصا لضبط التشكل المطاط الصناعي وخصائص المرونة وتحديدا توجيه محاذاة (الفرد) أنواع الخلايا لخلق أمر والترتيبات المكانية سخلايا مماثلة لو المنظومات الحية. وبصرف النظر عن تقديم سقالة قادرة على الحفاظ وتوجيه نمو الخلايا على المدى الطويل وانتشار، LCEs تسمح أيضا للتجارب الحيوية، حيث يمكن تعديل توجيه الخلايا والتفاعلات على الطاير.

Protocol

ملاحظة: الخطوات التالية ل3D LCE إعداد مثل رغوة باستخدام 3-ذراع كتلة نجم من البوليمرات وتظهر في الشكل 1. لتوصيف النووي بالرنين المغناطيسي (NMR)، يتم تسجيل الأطياف في الكلوروفورم بالديوتيريوم (CDCl ₃₎ في درجة حرارة الغرفة على بروكر DMX 400 ميغاهيرتز الصك وداخليا المشار القمم المتبقية في 7.26. تحويل فورييه الأشعة تحت الحمراء (FT-IR) الأطياف يتم تسجيلها باستخدام بروكر المتجهات 33 FT-IR مطياف باستخدام الكلي وضع الانعكاس الموهن. لكل خطوة من بروتوكول التالية، من المهم أن ارتداء الملابس الواقية الشخصية المناسبة (PPE).

1. توليف α-كلورو-ε-caprolactone (الأحادي) (وفقا لإجراءات في جيروم وآخرون. ²⁸⁾

1. قبل البدء في تجميع وتنقية 27 غرام من حامض 3-chloroperbenzoic على النحو التالي:
   1. في 800 مل من الماء المقطر، إضافة 1،28 غرام من الصوديومالفوسفات أحادي القاعدة الهيدرات و8.24 غرام من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة مائى. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 (باستخدام هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك) والاحتياطي 30 مل من هذا الحل. هذا هو الحل العازلة.
   2. باستخدام قمع فصل، ويحل حامض 3-chloroperbenzoic في 35 مل من ايثر. غسل حل العضوي مع 10 مل من محلول منظم (المعد في الخطوة 1.1.1). تكرار غسل ثلاث مرات.
   3. إضافة 3 غرام من كبريتات الصوديوم مباشرة إلى حل العضوي. هذا عامل التجفيف تمتص الماء من المحلول العضوي.
   4. تصفية الحل لإزالة عامل التجفيف. التركيز الترشيح تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 850 مليبار و 40 درجة مئوية.
2. إذابة 18.5 غرام من تنقية حامض 3-chloroperbenzoic في 150 مل من ثنائي كلورو ميثان الجاف عن طريق اثارة في حمام بالموجات فوق الصوتية. هذه العملية تستغرق عادة 20 دقيقة. وضع الحل داخل قمع فصل.
3. داخل الرقبة اثنين، دورق كروي،حل 13،1 غراما من 2 chlorocyclohexanone في 15 مل من ثنائي كلورو ميثان الجاف باستخدام محرك مغناطيسي تحت غاز النيتروجين. الحفاظ على اثارة.
4. تناسب قمع فصل يحتوي على محلول حمض 3-chloroperbenzoic (من الخطوة 1.2) إلى قارورة اثنين الرقبة في الخطوة 1.3. مسح نظام مع غاز النيتروجين. ضبط افتتاح قمع فصل بحيث يسقط محلول حمض chloroperbenzoic قطرة قطرة في حل 2-chlorocyclohexanone (1 قطرة كل البعض الثاني) وتستمر اثارة الخليط تحت غاز النيتروجين لمدة 96 ساعة.
5. تبريد خليط التفاعل إلى -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة لترسيب ثانوية م حامض -chlorobenzoic (م -CBA).
6. تصفية حمض -chlorobenzoic م (م -CBA) ويغسل الحل المتبقي مع حلول المشبعة من ثيوكبريتات الصوديوم، وبيكربونات الصوديوم، وكلوريد الصوديوم.
7. إزالة المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 850 مليبار و 40 درجة مئوية. تنقية أصفر باهت، LIQU لزجمعرف عن طريق التقطير تحت ضغط منخفض عند 2.3 عربة و 96 درجة مئوية.
8. مراقبة نجاح عملية التوليف باستخدام ¹ قمم H NMR التالية. ¹ H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl _3، δ [المليون]): 4،75-4،68 (م، 1H، C H ClCO)، 4،37-4،26 (م، 1H، C H ₂ O)، 4،18-4،05 (م، 1H ، C H ₂ O)، و2،06-1،58 (م، 6H، -C H ₂ -) ^{6، 27.}

2. تجميع α-ثلاثة تسليح ستار كتلة كوبوليمر (SBC-αCl) من خلال حلقة بالتطعيم افتتاح (شارما وآخرون. ⁽⁶⁾ وأمسدن وآخرون. ²⁹⁾

1. قبل التوليف، silanize أمبولة 20 مل من ملئه مع (/ ت ت) حل 2٪ من 1H، 1H، 2H، 2H-perfluorooctyltriethoxysilane في التولوين والتحريك لمدة حوالي 24 ساعة. شطف مع ايزوبروبيل وجففها عن طريق وضعها في الفرن على 140 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. إضافة 30.64 غرام من المقطر ε-caprolactone، 0.5 غرام من α-كلورو-ε-caprolactone، و 0.25 مل من الجلسرين إلى أمبولة. باستخدام مزيج دوامة لمدة 1 دقيقة.
3. إضافة 4.90 غرام من D، L -lactide إلى أمبولة وتخليصها مع النيتروجين. ضع أمبولة في الفرن على 120 درجة مئوية لإذابة D، L -lactide. هذه العملية تستغرق عادة حوالي 2 ساعة. مزيج مرة أخرى باستخدام دوامة للتأكد من أن جميع محتويات مختلطة جيدا وإضافة 66 ميكرولتر من القصدير (II) 2-ethylhexanoate (القصدير (أكتوبر) ₂₎ إلى أمبولة.
   ملاحظة: D، L سوف -lactide يبرد أثناء هذه العملية، وسوف تحتاج إلى إعادة تسخينه في الفرن لتذوب.
4. بقوة مزيج واحد آخر مرة باستخدام دوامة والاحمرار مع النيتروجين.
5. إغلاق أمبولة مع سدادة مطاطية. وضع إبرة متصلة فراغ أنبوب (الفراغ المنزل عادة ما يكون بما فيه الكفاية) من خلال سدادة مطاطية. بدوره على فراغ، وباستخدام لهب، تذوب الرقبة طويلة من الزجاج، والتواء ببطء حتى زمعشوقة ينهار على نفسه. كن حذرا حتى لا تذوب سدادة مطاطية. مرة واحدة في أمبولة هو اللهب مختومة، وضعه في حمام الرمل، فرن، أو عنصر التسخين المناسب في 140 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
6. إخراج أمبولة واتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة.
7. كسر أمبولة في علامة مغلقة وحل سائل لزج للغاية وذلك بإضافة 10 مل من ثنائي كلورو ميثان. نقل حل لقمع فصل.
8. إعداد قارورة تحتوي على 100 مل من الميثانول الباردة (المبردة باستخدام الجاف حمام الثلج / الأسيتون عند درجة حرارة حوالي -78 ° C). إصلاح قمع فصل (الخطوة 2.7) على رأس القارورة. ضبط افتتاح قمع فصل بحيث عن اثنين من قطرات تسقط كل الآخرين الثاني (قطرة قطرة).
9. جمع راسب أبيض عن طريق الترشيح (باستخدام ورقة فلتر) وجففها في فرن فراغ ما بين 50 و 60 درجة مئوية.
10. مراقبة نجاح عملية التوليف باستخدام التالية ¹ H NMR وFT-IR القمم. ¹ H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl ₃، δ [المليون]): 5،29-5،03 (م، COC H C H _3)، 4،43-4،25 (م، C H الكلور)، 4،24-4،12 (م، C H ₂ O)، 4،11-4،03 (ر، J = 4.6 هرتز، C H ₂ O)، 3،80-3،68 (م، C H C H _2)، 3،09-2،64 (اسعة، S، O H)، 2.39 (ر، J = 4.5 هرتز، H ألفا)، 2.33 (ر، J = 5.1 هرتز، H ألفا)، و1،77-1،25 (م، C H _2، C H _3)؛ FT-IR (1 / λ [سم ^-1]): 2932 (ق)، 2869 (م)، 1741 (ق)، 961 (ق)، 866، و 735 (م) ^{6، 27.}
    ملاحظة: لإعداد 3D LCE أكثر ماء، وإعداد كتلة كوبوليمر الخطية (LBC) بدلا من SBC، وبعد إجراء عصابة فتح البلمرة (شرطة عمان السلطانية) المذكورة أعلاه.
    1. إضافة 0.3 غرام من البولي ايثيلين جلايكول (PEG)، 3.15 ز ε-caprolactone، 1.0 غرام من α-كلورو-ε-caprolactone، و 5.0 غرام من D، L-lactide إلى مزيج قارورة silanized.

3. تعديل الاصطناعية من α-CL-ثلاثة الذراع SBC إلى αN ₃ ثلاثة والذراع SBC (SBC-αN ₃₎ (وفقا لشارما وآخرون. ⁶⁾

1. في قارورة ذهابا وأسفل وتحت النيتروجين، ويحل 5 غرام من SBC-αCl في 30 مل من N الجاف، N '-dimethylformamide.
2. إضافة 0.22 غرام من أزيد الصوديوم والسماح للرد بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
   تحذير: أزيد الصوديوم السامة. ارتداء الملابس الواقية الشخصية المناسبة (PPE).
3. إزالة N، -dimethylformamide N 'تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 11 مللي بار و 40 درجة مئوية. حل الخليط في 30 مل من التولوين. أجهزة الطرد المركزي في حل ثلاث مرات في 2800 x ج لمدة 15 دقيقة لإزالة الملح تشكيلها. تتبخر التولوين تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 77 مللي بار و 40 درجة مئوية.
4. مراقبة نجاح استبدال أزيد باستخدام ¹ H NMR وFT-IR القمم.
   ملحوظة: 1 H NMR الطيف مماثل إلى الأصل SBC-αCl، باستثناء ظهور الذروة في 3.90 جزء في المليون ذات الصلة إلى مجموعة أزيد. FT-IR (1 / λ [سم ^-1]): 2928، 2108 (ق، أزيد)، 1754 (ق)، 1450 (ق)، 960 (م)، 865 (ق)، 733 (ق)، و 696 (م).

4. توليف الكوليسترول 5 Hexynoate (LC شاردة) (وفقا لشارما وآخرون. ⁽⁶⁾ ودونالدسون وآخرون. ³⁰⁾

1. في قارورة ذهابا والقاع، ومزيج 3 غرام من حمض 5-hexynoic و 130 مل من ثنائي كلورو ميثان. بارد 0 درجة مئوية باستخدام حمام جليدي.
2. في قارورة ذهابا وأسفل أخرى، مزيج 8.28 غرام من N، N '-dicyclohexylcarbodiimide، 10.3 غرام من الكولسترول، و 0.2 غرام من 4 dimethylaminopyridine.
3. نقل 5-hexynoic حامض حل قطرة قطرة إلى قارورة تحتوي على خليط الكوليسترول في الدم والحفاظ على الخليط النهائي في 0 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
4. يسمح هذا المزيج على الاحماء لدرجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
5. إزالة الناتجة يعجل dicyclohexylurea عن طريق الترشيح باستخدام ورق الترشيح الدرجة 415 وتخلص منه.
6. التركيز الترشيح تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 850 مليبار و 40 درجة مئوية. حل هذه البقايا التي تم جمعها في 150 مل من الهكسان.
7. تتبخر المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 335 مليبار و 40 درجة مئوية. إضافة 350 مل من الايثانول إلى بقايا زيتية لجمع المنتج النهائي. غسل من البيض الصلبة شكلت مع الإيثانول وتجفيف المنتجات الصلبة في ظل فراغ عند 50 درجة مئوية.
8. مراقبة التوليف باستخدام التالية ¹ H NMR وFT-IR القمم. ¹ H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl _3، δ [المليون]): 5.39 (د، J = 4.7 هرتز، 1H، C H = C)، 4،70-4،58 (م، 1H، C H OCO)، 2.44 (ر، J = 2.5 هرتز، 2H، C H ₂ CO)، 2.34 (م، 2H، C H _2-C H =)، 2.31 (م، 2H، C H ₂ C H ₂ -COO)، 2.28 (ق، 1H، HC≡C)، 2.27 (د، J = 2.3 هرتز، 2H، ≡CC H _2)، 2،07-1،06 (م، 2H، C H _2، C H)، 0.94 (ق، 3H، C H _3)، 0.89 (د، J = 1.8 هرتز، 3H، C H ₃ C H)، و0.88 (د، J = 1.8 هرتز، 6H، C H ₃ -C H)، 0.67 (ق، 3H، C H _3). FT-IR (1 / λ [سم ^-1]): 2،830-2،990 (واسعة وقوية الذروة)، 2104 (م)، 1695 (ق)، 1428 (م)، 1135 (م)، 999 (ق)، 798 (ق)، و 667 (ق).

5. تعديل الاصطناعية من α-N ₃ ثلاثة والذراع SBC إلى ألفا-الكوليسترول-ثلاثة الذراع SBC (SBC-αCLC) عن طريق رد الفعل أزيد-آلكاين Huisgen سيكلو إضافة ( "اضغط على" رد الفعل) للحصول على SBC-تشول (وفقا ل شارما وآخرون. ⁶⁾

1. في قارورة ذهابا والقاع، ويحل 1 المولي يعادل SBC-αN ₃ (1.5 غرام) في 100 مل من رباعي هيدرو الفوران المقطر الطازجة (THF). إضافة 1.2 يعادلها الموليطن من الكوليسترول 5 hexynoate (1.94 ز)، أي ما يعادل 0.1 المولي من النحاس (I) يوديد (0.06 ز)، و 0.1 يعادل المولي من ثلاثي الإيثيلامين (0.03 ز). يحرك الخليط بين عشية وضحاها في 35 درجة مئوية تحت النيتروجين.
2. تتبخر المذيب تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 357 مليبار و 40 درجة مئوية.
3. حل الخليط المتبقي في 80 مل من ثنائي كلورو ميثان وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 2800 x ج في درجة حرارة الغرفة لإزالة المواد المتفاعلة والمنتجات الجانبية.
4. مراقبة التوليف باستخدام التالية ¹ H NMR وFT-IR القمم. ¹ H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl _3، δ [المليون]): 7.54 (ق، CH = C-التريازول)، 5،43-5،34 (م، C = CH الكوليسترول)، 5،10-5،06 (م، COCHCH _3)، 4.68 -4.55 (م، O-CH الكوليسترول)، 4،24-4،19 (م، CH ₂ O)، 4،18-4،13 (ر، J = 5.0 هرتز، CH ₂ O)، 4،11-4،05 (ر، J = 4.4 هرتز، CH ₂ O)، 2،47-2،41 (ر، J = 4.9 هرتز، كوتش _2)، 2،31-2،25 (م، كوتش _2)، 2،07-1،02 (م، CH ₂ ، CH _3)، 1،05-1،03 (ق، CH _2، CH _3)، 0،96-0،92 (د، J = 3.3 هرتز، CH _2، CH _3)، 0،91-0،87 (اليوم، J = 1.9 هرتز، J = 1.8 هرتز، CH _3)، و0،71-0،68 (ق، CH _3). FT-IR (1 / λ [سم ^-1]): 3260 (ق)، 2920 (ق)، 1710 (ق)، 1460 (ق)، 1370 (ق)، 1240 (م)، 1190 (ق)، 733 (ق)، و 668 (ق).

6. تجميع 2،2-مكرر (1-caprolactone-4-YL) البروبان (Crosslinker، BCP) (وفقا لقاو وآخرون. ²⁷ وAlbertsson وآخرون. ³¹⁾

1. في قارورة ذهابا والقاع، وإعداد محلول يحتوي على 10.8 غراما من 2 مكرر (4-هيدروكسي-cyclohexyl) البروبان و 52 مل من حمض الخليك.
2. تحضير محلول يحتوي على 11 غرام من أكسيد الكروم في 50 مل من حمض الخليك و 8 مل من الماء المقطر. إضافة هذا الحل قطرة قطرة إلى حل أعدت في الخطوة 6.1 مع الحفاظ على درجة حرارة خليط بين 17 و 20 درجة مئوية (على سبيل المثال، فيحمام الماء)؛ هذه العملية تستغرق قطرة قطرة 2 ساعة. وبمجرد اكتمال العملية، والسماح للحل ليقلب لمدة 30 دقيقة.
3. إضافة 50 مل من 2-بروبانول. تحريك الحل بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
4. التركيز على حل البنفسجي الغامق تحت ضغط منخفض باستخدام المبخر الدوار في 137 مليبار و 40 درجة مئوية. إضافة 300 مل من الماء المقطر لترسيب. يجب أن يكون راسب ضوء الأرجواني.
5. الترشيح الناتج الخام باستخدام ورق الترشيح الصف 415. غسل المواد الصلبة مع ~ 250 مل من الماء المقطر أو حتى الصلبة يصبح أبيض.
6. حل مادة صلبة في 15 مل من البنزين في 40 ° C والسماح لها أعد بلورة عند 25 درجة مئوية.
7. إضافة 8.34 غرام من كيتون ثنائي الجاف حله في ثنائي كلورو ميثان الجاف ومحلول يحتوي على 6.0 غرام من حامض 3-chloroperbenzoic في 75 مل من ثنائي كلورو ميثان إلى قارورة.
8. ارتداد الحل عند 40 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
9. تبريد خليط التفاعل إلى -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة لترسيب م -chlorobenzoic ثانوية حامض.
10. إزالة م حامض -chlorobenzoic عن طريق الترشيح (باستخدام ورقة فلتر) والتركيز على حل تحت ضغط منخفض.
11. يغسل المنتج الخام فسكوزي مع 200 مل من 2 heptanone وتجفيف راسب في ظل فراغ عند 50 درجة مئوية خلال الليل.
12. مراقبة التوليف باستخدام التالية ¹ H NMR وFT-IR القمم. ¹ H NMR (400 ميغاهيرتز، CDCl _3، δ [المليون]): 4،42-4،37 (اليوم، J = 14.2، 7.4 هرتز، 2H، C H ₂ OC = O)، 4،21-4،15 (ر، 2H، J = 11.3 هرتز، C H ₂ OC = O)، 2،80-2،75 (دي دي تي، J = 14.3، 6.5، 1.6 هرتز، 2H، C H ₂ COO)، 2،63-2،57 (ترينيداد وتوباغو، J = 13.3، 2.1 هرتز، 2H، C H ₂ COO)، 2،04-1،93 (M، 4H، -C H ₂ CH ₂ OC = O)، 1،70-1،56 (م، 4H، -C H ₂ C H ₂ COO)، 1،48-1،38 (م، 2H، - C H C (CH _{3) 2)،} و0.84 (ق، 6H، C H ₃ C-).

7. إنشاء المسامية 3D المرنة سقالة عن طريق إما Hexamethylene الدي إيزوسيانات (HDI) أو 2،2 مكرر (1-caprolactone-4-YL) البروبان (BCP) ²⁷ كما Crosslinkers (وفقا لقاو وآخرون. ²⁷⁾

1. إعداد ثلاث ذراع المطاط الصناعي خليط باستخدام 0.75 غرام من SBC-αCLC بإضافة 0.25 مل من HDI (أو 0.45 مل من BCP) و 0.24 مل من المقطر مونومر ε-caprolactone. إضافة 60 ميكرولتر من القصدير (أكتوبر) _2. في حالة استخدام BCP بدلا من HDI، مزيج SBC-αCLC وBCP باستخدام الدوامة ووضعها في الفرن على 140 درجة مئوية حتى يذوب BCP تماما ويذوب (هذه الخطوة يمكن أن يستغرق فترة تصل الى 2 ساعة). مرة واحدة وقد تم حل BCP، إخراجها من الفرن و، والقصدير (أكتوبر) _2، ودوامة.
2. إعداد "الأضاحي" قالب النيكل رغوة بقطع 1 × 4 سم معدن قطعة. لفة من أحد طرفي قصيرة بحيث لفة الأخيرة هي حوالي 1 × 1 سم معدن قطعة (انظر الشكل 4).
<لى> ضع رغوة النيكل في قارورة زجاجية أو الألومنيوم حزمة احباط ويصب الخليط المعد في الخطوة 7.1 لتغطية كامل الرغوة لمدة 2 دقيقة. إزالة الخليط الزائد مع الماصة باستور. ترك الأمر بين عشية وضحاها في الفرن عند 80 درجة مئوية.
3. تقشر رقائق الألومنيوم أو كسر الزجاج. باستخدام شفرة حلاقة، حلق المطاط الصناعي في جميع أنحاء رغوة المعادن للكشف عن المعادن النيكل.
4. إعداد 1 M الحديد (III) كلوريد (FeCl ₃₎ حل في 100 مل من الماء. ضع رغوة في قارورة وإضافة 70 مل من FeCl ₃ الحل. يحرك المزيج لمدة ثلاثة أيام في درجة حرارة الغرفة، وتغيير FeCl ₃ حل كل يوم. قبل كل تغيير، وإثارة الرغوة مع الماء المؤين عن 0.5 ساعة.
   ملاحظة: عادة ما يتم الانتهاء من عملية الحفر بعد ثلاثة أيام. لضمان أن يتم الانتهاء من عملية الحفر، إجراء اختبارات الضغط عن طريق اللمس حتى يشعر الرغاوي لينة. المقاومة رغوة لاختبارات ضغط اللمس يدل على وجود قالب معدني المتبقية.
5. شطف ELASTعمر رغوة مع الايثانول ومكان في فراغ فرن بين عشية وضحاها في 40 ° C.
6. توصيف المواد باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM)، الكالوري التفاضلية المسح الضوئي (DSC)، اختبارات ضغط الميكانيكية، والتحليل الوزني الحراري (TGA) ^27.
   ملاحظة: للحصول على إعداد 3D LCE أكثر ماء، استبدل SBC مع LBC (التأكد من أن LBC يحتوي أيضا على شاردة LC) باتباع الخطوات الموضحة في الخطوة 7.5.

8. البذر من المطاط الصناعي سقالة مع خلايا SH-SY5Y العصبية والثقافة عن طريق تقنيات معقمة

1. تعقيم المطاط الصناعي قبل غسله مرتين مع 1 مل من الايثانول 70٪. أداء أشعة فوق البنفسجية لمدة 10 دقيقة ويغسل مع 1 مل من الايثانول 70٪. شطفه مرتين مع 1 مل من الماء المعقم و 1 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). ضع اللدائن في لوحات ثقافة 24-جيدا.
2. إعداد المتوسطة نمو الخلايا لSH-SY5Y تحتوي على 90٪ Dulbecco التعديل النسر متوسطة (DMEM) supplemented مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين، الستربتوميسين (القلم بكتيريا).
3. بعد فرز الخلايا باستخدام الكريات، وإعداد 1.5 × 10 ⁵ خلايا SH-SY5Y علقت في 100 ميليلتر من متوسط النمو (حل البذور). إضافة الحل على رأس اللدائن، مع التأكد من تشكيل الهبوط.
4. احتضان اللدائن المصنفة عند 37 درجة مئوية وCO ₂ 5٪ لمدة 2 ساعة لتعزيز التصاق الخلية. إضافة 0.5 مل من متوسط ​​النمو. احتضان مرة أخرى عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2.
5. تغيير المتوسطة كل يوم بعد الغسيل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.

9. التصوير المجهري المرنة تعبيد

1. إصلاح الخلايا المزروعة في اللدائن مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. شطف مع 3 مل من PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق كل ووضع المطاط الصناعي مع الخلايا الثابتة في صحن الثقافة مع ساترة المرفقة.
   تحذير: PFA سامة. ارتداء الملابس الواقية الشخصية المناسبة (PPE).
2. ستافي عينات ثابتة بنسبة 0.1٪ من 4، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة وشطف مرتين مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق.
3. على الفور صورة اللدائن باستخدام متحد البؤر المجهري مع دابي مضان، والحصول على مداخن صورة التي تمتد العينة.
   ملاحظة: هنا، تم الحصول على مداخن صورة باستخدام الهدف 20X 60X وهدف.
4. تحليل مداخن البصرية صورة متحد البؤر باستخدام يماغيج ^32.

النتائج

ويبين هذا التقرير طريقة إعداد LCE 3D التي يسهل اختراقها كما سقالة للثقافة الخلية باستخدام قالب معدن النيكل. يدل على 3D LCE حصلت شبكة معقدة متداخلة القناة التي تسمح للتسلل خلية سهلة، وكذلك النقل الجماعي أكثر ملاءمة ^27. وجد أن الخلايا قادرة ...

Discussion

وقد تم مؤخرا دراسة اللدائن البلورية السائلة كما السقالات خلية حيويا بسبب استجابتها المحفزات. وقد ثبت أنها تكون منصات مثالية كما السقالات الخلية. ومع ذلك، عامل مهم أن نأخذ في الاعتبار عند إعداد وتصميم سقالة LCE جديدة غير المسامية. إدراج المواد الصلبة القابلة للترشح

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane	Alfa Aesar	L16606	Silanizing agent
2-bis(4-hydroxy-cyclohexyl)propane	TCI	B0928	Reagent
2-chlorohexanone	Alfa Aesar	A18613	Reagent
2-heptanone	Sigma Aldrich	W254401	Solvent
2-propanol	Sigma Aldrich	278475	Solvent
3-chloroperbenzoic acid, m-CPBA	Sigma Aldrich	273031	Reagent
4-dimethylaminopyridine	Alfa Aesar	A13016	Reagent
4',6-diamidino-2-phenylindole, DAPI	Invitrogen	D1306	Nuclear Stain
5-hexynoic acid	Alfa Aesar	B25132-06	Reagent
Acetic acid	VWR	36289	Solvent
Acetone	Sigma Aldrich	34850	Solvent
Alcohol 200 proof ACS Grade	VWR	71001-866	Reagent
Benzene	Alfa Aesar	AA33290	Solvent
ε-caprolactone	Alfa Aesar	A10299-0E	Reagent
Chloroform	VWR	BDH1109	Solvent
Cholesterol	Sigma Aldrich	C8503	Reagent
Chromium(VI) oxide	Sigma Aldrich	232653	Reagent
Copper(I) iodide	Strem Chemicals	100211-060	Reagent
D,L-Lactide	Alfa Aesar	L09026	Reagent
Dichloromethane	Sigma Aldrich	320269	Solvent
Diethyl ether	Emd Millipore	EX0190	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Dulbecco’s modified Eagle medium, DEME	CORNING Cellgo	10-013	Cell Media
Ethanol	Alfa Aesar	33361	Solvent
Formaldehyde	SIGMA Life Science	F8775	Fixative
Fetal bovine serum, FBS	HyClone	SH30071.01	Media Component
Filter paper, Grade 415, qualitative, crepe	VWR	28320	Filtration
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Central node (3-arm)
Hexamethylene diisocyanate, HDI	Sigma Aldrich	52649	Crosslinker
Iron(III) chloride	Alfa Aesar	12357	Etching agent
Isopropyl alcohol	VWR	BDH1133	Solvent
Methanol	Alfa Aesar	L13255	Solvent
N,N'-dicyclohexylcarbodiimide	Aldrich	D80002	Solvent
N,N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	270547	Solvent
Nickel metal template	American Elements	Ni-860	Foam template
Neuroblastomas cells (SH-SY5Y)	ATCC	CRL-2266	Cell line
Penicillin streptomycin	Thermo SCIENTIFIC	15140122	Antibiotics
Polyethylene glycol 2000, PEG	Alfa Aesar	B22181	Reagent
Sodium azide	VWR	97064-646	Reagent
Sodium bicarbonate	AMRESCO	865	Drying salt
Sodium chloride	BDH	BDH9286	Drying salt
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Fisher Scientific	S-374	Drying salt
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma Aldrich	S9638	Drying salt
Sodium sulfate	Sigma Aldrich	239313	Drying salt
Tetrahydrofuran	Alfa Aesar	41819	Solvent
Thiosulfate de sodium	AMRESCO	393	Drying salt
Tin(II) 2-ethylhexanoate	Aldrich	S3252	Reagent
Toluene	Alfa Aesar	22903	Solvent
Triethylamine	Sigma Aldrich	471283	Reagent
Trypsin	HyClone	SH30042.01	Cell Detachment
Olympus FV1000