JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا، بروتوكولا للحث على التسامح في زرع الأعضاء، وتقييم في المختبر و في فيفو القدرة القمعية لمجموعات فرعية خلية متميزة من المتلقي وحالة المتلقي تجاه الجهات المانحة أو المستضدات خارجية المنشأ المناعي.

Abstract

مصدر القلق الرئيسي في زرع لتحقيق التسامح محددة من خلال تنظيم دورات تعريفية للخلايا التنظيمية. فهم آليات التسامح يتطلب نماذج موثوقة. وهنا يصف لنا نماذج التسامح إلى allograft القلب في الفئران، التي يسببها حصار إشارات كوستيموليشن أو upregulation من جزيئات إيمونوريجولاتوري من خلال نقل الجينات. كل من هذه النماذج يسمح في فيفو جيل من الخلايا التنظيمية مثل خلايا تي التنظيمية (تريجس)، والتنظيمية ب خلايا (برجس) أو خلايا النقوي التنظيمية (ريجمكس). في هذه المخطوطة، يمكننا وصف هذين البروتوكولين التكميلية التي استخدمت لتحديد وتعريف نشاط الخلية التنظيمية في المختبر و في فيفو لتحديد مسؤوليتهم في الحث على التسامح وصيانة. أولاً، في المختبر قمعية مقايسة يسمح التعرف السريع على الخلايا مع القدرات القمعية في الاستجابات المناعية المستجيب بطريقة تعتمد جرعة، ويمكن استخدامها لمزيد من التحليل مثل قياس سيتوكين أو سيتوتوكسيسيتي. ثانيا، التبني نقل الخلايا من مستلم تعامل متسامح إلى مستلم المطعمة حديثا المشع، أبرز خصائص هذه الخلايا في السيطرة على الاستجابات المناعية الاختلاس الموجهة و/أو تحويل (خلايا تنظيمية جديدة توليروجينيك وصف التسامح المعدية). هذه الأساليب لا تقتصر على الخلايا التي تحتوي على علامات المظهرية المعروفة، ويمكن تمديدها لأي سكان الخلية. وعلاوة على ذلك، توجه المانحين اللوسبيسيفيسيتي الخلايا التنظيمية (هدفا هاما في الميدان) يمكن تقييمها باستخدام خلايا المانحين طرف ثالث أو graft سواء في المختبر أو في الجسم الحي. وأخيراً، لتحديد قدرة توليروجينيك محددة من هذه الخلايا التنظيمية، نقدم بروتوكولات لتقييم استجابات خلطيه المانحة المضادة الأجسام المضادة وقدرة المتلقي على تطوير استجابات خلطيه ضد المستضدات المعروفة الجديدة أو السابقة. نماذج التسامح ووصف يمكن استخدامها لزيادة تميز الخلايا التنظيمية، وتحديد المؤشرات الحيوية الجديدة، وجزيئات إيمونوريجولاتوري، وهي قابلة للتكيف لزرع نماذج أخرى أو أمراض المناعة الذاتية في مكافحة القوارض أو البشرية.

Introduction

Allograft القلب في الفئران هو نموذج زرع جهاز يمكن الاعتماد عليها لتقييم العلاجات التعريفي التسامح، فك آليات التسامح التعريفي، والصيانة، ولديه القدرة على حمل الخلايا التنظيمية المختصة وظيفيا والمهيمنة. البروتوكولات التالية تصف تماما عدم تطابق هيتيروتوبيك القلب طعم من الفئران مانحة 1 وات لويس (LEW.1W، RT1u) في الفئران المستفيدة 1A لويس (LEW.1A، RT1). في هذا الجمع الاختلاس، الرفض الحاد يحدث سريعاً (في حوالي 7 أيام) ويمكن تقييمها بسهولة بالاختلاس الضرب القياس من خلال جس البطن. ونقترح هنا ثلاثة بروتوكولات للحث على التسامح إلى allograft القلب في الفئران. في هذه النماذج، التسامح هو فعل و/أو تحتفظ بها أنواع مختلفة من الخلايا التنظيمية. أولاً، بحظر CD40-CD40L التفاعلات مع إتش ترميز CD40Ig (AdCD40Ig) الناجمة عن توليد CD8+ تريجس قادرة على استحثاث التسامح عند أدوبتيفيلي ونقل إلى المستلمين المطعمة الثانوي1. وعلاوة على ذلك، نضوب CD8 الخلايا+ (مع الأجسام المضادة-CD8α) في AdCD40Ig تعامل المستلمين التي تم إنشاؤها برجس وريجمكس2. تحليل عميق ل CD8+ تريجس خصائص الضوء على الدور الرئيسي للعديد من الجزيئات immunoregulatory يعرف انترلوكين-34 (إيل-34) وفيبروليوكين-2 (فجل-2)3،،من45،6 . بينما overexpression إيل-34 (مع ناقل إف) الناجم عن تريجس من خلال جيل ريجمكس، overexpression فجل-2 التي يسببها برجس، التي تقوم عليها الشبكة المعقدة من الخلايا التنظيمية.

سبب الرفض المزمن يتطور ببطء وطويلة الأجل، مطلوب تحليلاً متعمقا للتمييز بين التسامح مقابل الرفض المزمن. عادة ما يتم تقييم الفساد لتسلل خلية، التليف، وسماكة الأوعية ترسب C4d الجدار وتكملة إيمونوهيستولوجي7. بينما تتطلب التضحية الحيوانية أساليب علم الأنسجة أو graft خزعة، هنا نحن تصف طريقة بسيطة لتقييم ميزات مختلفة من allograft التحمل: ظهور ووظيفة الخلايا التنظيمية واستجابات المانحين لمكافحة جسم معين من الدم عينة من التدفق الخلوي (هنا، استخدمنا خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)).

الحفاظ على التسامح allograft بعد إلقاء القبض على المعاملة يرتبط عموما بتحريض الخلايا التنظيمية8. في العقود الماضية، ركزت الدراسات على CD4+تريجس تتميز الإجماع عليها بعلامات رئيسية Foxp3+CD25عاليةو CD127–9،،من1011. وبالمثل، وعلامات عدة نسبت إلى CD8+ تريجس، مثل CD122+، CD28-، CD45RCمنخفضة، PD1+، و Helios+ 1،12،،من1314 , 15 , 16 , 17-على مدى سنوات، تعبيراً عن جيتر و CTLA4 والسيتوكينات (إيل-10، 34 TGFβ، إيل، إيل-35، فجل-2) ارتبطت بالإضافة إلى ذلك أن تريغ الشخصية3،،من46،13، 18،19،،من2021. بيد أن السكان الخلية التنظيمية الناشئة، مثل برجس، أو ريجمكس، أو نكتريجس، تفتقر إلى علامات محددة ذات الصلة. والواقع أن معظمها سجلت بريجس ك CD24 غير ناضجة+ الخلايا، مع التعبير CD27 غامضة وأحيانا إنتاج إيل-10، TGFβ، أو جرانزيمي ب22،،من2324. تعقد سلالة خلية النقوي يتطلب مزيجاً من عدة علامات لتحديد التشكيل الجانبي التنظيمية أو proinflammatory مثل CD14، CD16، CD80، CD86، CD40، CD209a، أو CD163،من2526. وأخيراً، أبلغ بعض علامات التعرف على نكتريجس مثل CD11b+، CD27+, TGFβ+، ولكن المزيد من الدراسات ضرورية لزيادة وصف لهم فينوتيبيكالي27،28،29 ،30،،من3132. وهكذا، أدلة على نشاط القمعية مطلوبة لإضفاء الشرعية على مزيد من الوصف المظهرية لتحديد المؤشرات الحيوية الجديدة، جديدة immunoregulatory الوسطاء، وتوسيع النطاق إلى علاجات جديدة في الخلية.

ونحن نقترح طريقتين مكملة لتقييم نشاط الخلايا القمعية. أولاً، الأسلوب في المختبر يتكون من استزراع الخلايا القمعية مع خلايا المستجيب المسمى تي تحفزها مستضد متمكنة من المانحين تقديم الخلايا (Apc) في نسب مختلفة على مدى 6 أيام، وتحليل المستجيب T الخلية الانتشار التي ويعكس قمع المناعة الموجه من الجهات المانحة. ويمكن مقارنة الخلايا من الفئران المعالجة مباشرة إلى الخلايا من السذاجة الجرذان والفئران المطعمة غير المعالجة لنشاط القمعية (أو لأي سكان الخلية التنظيمية الأخرى)، في طائفة من نسب القامع: المستجيب. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب لا يتطلب أي الزرع، ويتم الحصول على النتائج خلال 6 أيام. ثانيا، الأسلوب في فيفو يتكون من نقل الخلايا التنظيمية المقصود من الفئران معالجة إلى مستلم المطعمة حديثا المشع. بينما الخلايا أو الخلايا النقوي تي ب الخلايا من الفئران غير المعالجة من السذاجة عادة غير قادر على تمنع الرفض الحاد وإطالة أمد بقاء الفساد عند نقل التبني، والخلايا ذات النشاط القمعية potentiated من متلقي العلاج هذه السمات 1،،من23،،من433. ينصح ليمفوبينيا الناجمة عن الإشعاع المتلقي للسماح للخلايا المنقولة أدوبتيفيلي لتظل غير متأثرة بالتوازن الدم وإتقان أكثر سهولة من الاستجابات المناعية المضادة الجهات المانحة. لكلتا الطريقتين، الاستخدام في المختبر لأنه طرف ثالث ناقلات الجنود المدرعة أو في فيفو المتبنيين نقل القمعية الخلايا إلى المستلمين المطعمة بقلب الطرف الثالث يسمح بتحليل لخصوصية المانحين المضادة. بينما الأسلوب في فيفو يتطلب عدد كبير من الخلايا، وسوء تمثيل يمكن تقييم الفئات السكانية الفرعية الخلية بسهولة أكبر لنشاط القمعية في المختبر33.

ويمكن أيضا قياس استجابات خلطيه لتقييم حالة التسامح والسيطرة على استجابات الأجسام المضادة الموجهة إلى الجهات المانحة المستضدات. وفي الواقع، يمكن وصف التسامح بعدم استجابة خلطيه تجاه المانحين ولكن المحافظة على قدرة للمستلمين لتطوير استجابة خلطيه لمولدات جديدة والحفاظ على الذاكرة الردود. أولاً، مبدأ الكشف اللوانتيبودي يستند على الاعتراف بالخلايا المانحة المستفيدة الأجسام المضادة بعد الحضانة لنوع الخلية المانحة مع المصل من مستلم المطعمة. الثاني، خلطيه والاستجابات الموجهة إلى المستضدات خارجية المنشأ يمكن تحفيز التالية المقررة المستلمين متسامح طويلة الأجل مع ثقب المفتاح مفج هيموسيانين (كله) مستحلب مع adjuvant الشعبية فروند كاملة. وجود الأجسام المضادة IgM و IgG محددة ضد المستضدات يمكن الكشف عن 4 و 13 يوما، على التوالي، عقب التمنيع، بمقايسة الممتز الإنزيم المرتبط (أليسا)34. ثالثا، يمكن تقييم الحفاظ على الذاكرة المناعية الردود عن طريق الحقن إكسينوجينيك خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) في أيام-7 و + 3 للزرع وكرات الدم الحمراء تلطيخ مع المصل المتلقية التي تم جمعها في أيام + 8 و + 17 بعد زرع الأعضاء. كل هذه الأساليب تسمح للتعرف على أنواع فرعية الغلوبولين المناعي باستخدام أجسام مضادة ثانوية محددة، وسرعة الحصول على النتائج في أقل من 1.5 ح بنظام مراقبة الأصول الميدانية تلطيخ أو بضع ساعات قبل أليسا.

وأخيراً، هذه البروتوكولات المصممة من أجل توصيف لزرع نماذج، ويمكن أن تكون، إلى حد ما، تنطبق على نماذج أمراض المناعة الذاتية. يمكن أن تنقل مبادئ الأسلوب لجميع الأنواع.

Protocol

ملاحظة: جميع البروتوكولات هنا أقرتها لجنة أخلاقية دولية، وينبغي أن يجري بطريقة عقيمة.

1. جيل التسامح في نموذج Allograft القلب في الفئران

  1. LEW.1W إلى LEW.1A allograft الداخلي
    1. تخدير الذكور مانحة LEW.1W الفئران استخدام استنشاق isoflurane-س2 ، وتستكمل مع % 1 ن2س بعد دقيقة 5 مكان الحيوان في استلقاء الظهرية، وتطهير البطن مع تدين لأداء ثوراكوتومي (أي، شق في مساحة الجنبي للصدر).
      1. المشبك أجوفان وريدان السفلي والعليا وإبطاله لهم، وقطع منها. ثم قطع الشريان الاورطي والشريان الرئوي وحفظها الاختلاس في البرد 0.9% كلوريد الصوديوم.
    2. تخدير 250 غرام ذكور LEW.1A مستلم فأر (من 8-12 أسبوعا) استخدام استنشاق isoflurane-س2 ، وتستكمل مع % 1 ن2س بعد دقيقة 5 مكان الحيوان في استلقاء الظهرية، وتطهير البطن مع تدين للقيام فتح البطن إكسيفوبوبيك (أي، شق كبير من عملية الرهابه إلى الارتفاق العانة).
      1. تخريج الأمعاء، المشبك في الأوعية الدموية في البطن، وتؤدي ملامسة تيرمينو الجانبية (أي اتصال بين نهاية قناة واحدة والجدار الآخر) بين الاختلاس الشريان الاورطي والشريان الاورطي البطني وفي الرئة الشريان والبطن الوريد الأجوف، وإزالة المشابك.
    3. خياطة الطائرة العضلات والجلد، وتطهير مع تدين.
    4. حقن نالبوفيني (مسكن) 6 مغ/كغ تحت الجلد (الليبي) ومادة أوكسي تتراسايكلين (المضادات الحيوية) عضليا (الدردشة)، ووضع الحيوان تحت مصباح حرارة حتى يوقظ الحيوان. حقن البوبرينورفين (شبائه الأفيون) الدردشة (50 ميكروغرام/كغ) وميلوكسيكام (العقاقير المضادة للالتهابات المسكنة) (0.3 مغ/كغ) الليبي اليوم من زرع وبعد يوم واحد.
  2. التعريفي للتسامح بحصار تفاعلات كوستيمولاتوري
    1. اتبع الخطوات 1.1.1. إلى 1.1.2.
    2. في منطقة مصنفة A2 مرفق الحيوانية، تمييع الجسيمات المعدية 2 × 1010 من AdCD40Ig (إتش ترميز CD40Ig، جزيء تشيميريك الذي يمنع التفاعلات CD40-CD40L) في محلول لاكتات في المسابقة للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 150 ميليلتر وحقن في 3 نقاط (3 × 50 ميليلتر) في جدار البطين ذروة الفساد.
    3. اتبع الخطوات من 1.1.3 إلى 1.1.4.
      ملاحظة: يمكن علاج AdCD40Ig المرتبطة بمكافحة CD8α أو نظام ايكوس مكافحة مكافحة CD28 جسم حقن2،،من3536.
  3. التعريفي للتسامح من جانب overexpression بروتين المؤتلف
    1. تمييع 1 × 1012 الجينوم الفيروسي من الفئران إف IL34-المؤتلف في محلول لاكتات في المسابقة للوصول إلى وحدة تخزين نهائي من 100 ميليلتر. تخدير الفئران LEW.1A ز 150 مع استنشاق isoflurane-س2 وحقن الوريد (رابعا) في هذا السياق القضيب.
    2. شهر واحد بعد حقن إف-IL34، إجراء طعم LEW.1W على المستلم LEW.1A وفقا للبروتوكول 1.1.

2. في المختبر تقييم نشاط الخلايا القمعية بردود فعل مختلطة من الخلايا الليمفاوية (نظام قاذفة صواريخ متعددة)

ملاحظة: ينبغي مقارنة النشاط القمعية من الخلايا في الفئران المعالجة تسامحا مع السكان ما يعادل من المستلمين المطعمة سينجينيك أو السذاجة الفئران.

  1. عزل من ناقلات الجنود المدرعة متمكنة: الخلايا الجذعية بلاسماسيتويد (pDCs)
    1. تخدير ذكور LEW.1W السذاجة مانحة الفئران استخدام استنشاق isoflurane-س2 ، وتستكمل مع % 1 ن2س بعد دقيقة 5 مكان الحيوان في استلقاء الظهرية، وتطهير البطن مع تدين القيام استئصال. إزالة الطحال بواسطة ترانسيكتينج السفن وحفظ الطحال في البرد 1 × مخزنة الفوسفات المالحة (PBS) وخياطة الحيوان.
    2. نقل الطحال في طبق وإزالة 1 X PBS ونتخلل مع 5 مل من 0.2% D. كولاجيناز تحسين هضم إنزيم، قطع الطحال إلى قطع صغيرة واحتضان 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. إضافة 500 ميليلتر من 0.1 م الإيثيلين حمض (يدتا)، ونقل القطع الطحال في غربال وسحق الطحال مع مكبس لحقنه فصل الخلايا. نقل في أنبوب وغسل الخلايا مع 15 مل من 1 X PBS. أجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة في 430 x زاي تجاهل المادة طافية.
    4. للقضاء على كرات الدم الحمراء والصفائح الدموية، ريسوسبيند بيليه سبلينوسيتي في 10 مل من محلول ناقص التوتر واحتضان 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). يغسل مع 1 X PBS والطرد المركزي 10 دقيقة في 190 x زاي تجاهل المادة طافية.
    5. إزالة ألياف الكولاجين بالتصفية على مرشح أنسجة 100 ميكرومتر. عد الخلايا لضبط تركيز الخلية إلى 5 × 107 خلايا/مل في مصل العجل الجنين PBS/2% س 1 (FCS)/0.5 مم يدتا.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون عدد سبلينوسيتيس بين 4 × 108 و 7 × 108 خلايا.
    6. إثراء للخلايا ذات الاهتمام بالانتقاء السلبي قبل فرز الخلايا. احتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية مع 2 ميكروغرام/مل تنقية أجسام مضادة محددة لخلايا تي (مكافحة TCRαβ، واستنساخ R7/3، ومكافحة--TCRγδ، استنساخ V65) وخلايا ب (مكافحة CD45RA، واستنساخ OX33) والخلايا ناغورني كاراباخ (المضادة CD161، 3.2.3 استنساخ)، يغسل مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا والطرد المركزي 10 دقيقة في 430 x ز . تجاهل المادة طافية.
    7. يغسل مع الخرز المغناطيسي 3 مرات مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا. استخدم الخرز/10 ميليلتر 3.56 سبلينوسيتيس وتغسل بإضافة 30 مل 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا، مكان لمدة 1 دقيقة على المغناطيس، وتجاهل المادة طافية. كرر مرتين. ريسوسبيند الخرز في 10 مجلدات 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا (على سبيل المثال، 35 ميليلتر الخرز المخفف في 350 ميليلتر 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا).
    8. إزالة الخلايا غير المرغوب فيها بواسطة خلط في سبلينوسيتيس مع الخرز المغناطيسية لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية تحت التحريض ووضع الأنبوب في المغناطيس لمدة 1 دقيقة ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. كرر مرتين. عد الخلايا وضبط تركيز الخلية إلى 5 × 107 خلايا/مل في 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
      ملاحظة: يجب أن تتراوح عدد سبلينوسيتيس المخصب بين 5 × 107 و 9 × 107.
    9. وصمة عار في الخلايا باستخدام أجسام مضادة مسماة لفرز المزيد من pDCs: استبعاد الخلايا تي المتبقية (مكافحة TCRαβ، واستنساخ R7/3) أو خلايا ب (مكافحة--CD45RA، OX33 استنساخ)، ونوع CD4+ (مكافحة CD4، استنساخ OX35) CD45R+ الخلايا (مكافحة--CD45R، His24 استنساخ). قم بتسمية الخرز مع كل آب بإنشاء مصفوفة تعويض على نظام مراقبة الأصول الميدانية. احتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وتغسل مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
    10. ريسوسبيند الخلايا بتركيز 5 × 107 خلايا/مل، مرشح على مرشح أنسجة 60 ميكرومتر، وقم بتسمية الخلايا الميتة بإضافة DAPI بتركيز 0.1 ميكروغرام/مل نهائي. فرز الخلايا التي تحتوي أرز خلية فوهة 70 ميكرومتر، حسب النابضة في CD45RA تكر–DAPI––CD4+CD45R+ كما هو مبين في الشكل 1.
  2. عزل خلايا المستجيب تي المستجيب (CD4 + CD25 الخلايا T – )
    1. حصاد الطحال من الفئران غير المعالجة ساذجة غير المطعمة LEW.1A وحفظه في البرد 1 X برنامج تلفزيوني.
    2. نقل الطحال في غربال توضع في صحن وأضف 10 مل من 1 X PBS. سحق الطحال مع مكبس لحقنه فصل الخلايا. نقل الخلايا في أنبوب 50 مل وتغسل مع 1 X PBS والطرد المركزي 10 دقيقة في 430 x زاي تجاهل المادة طافية.
    3. للقضاء على كرات الدم الحمراء والصفائح الدموية، ريسوسبيند بيليه سبلينوسيتي في 10 مل محلول ناقص التوتر لمدة 5 دقائق في الرايت، تجاهل ثم يغسل في 1 X برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 10 دقيقة 190 x غ. المادة طافية.
    4. إزالة ألياف الكولاجين بالتصفية على مرشح أنسجة 100 ميكرومتر. عد الخلايا لضبط تركيز الخلية إلى 5 × 107 خلايا/مل في 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون عدد سبلينوسيتيس بين 3 × 108 و 5 × 108 خلايا.
    5. إثراء خلايا الفائدة قبل الفرز. احتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية مع 2 ميكروغرام/مل تنقية الأجسام المضادة المحددة للخلايا CD8 (مكافحة--CD8α، OX8 استنساخ)، خلايا ب (مكافحة--CD45RA، OX33 استنساخ)، ناغورني كاراباخ الخلايا (المضادة CD161، 3.2.3 استنساخ)، خلايا النقوي (مكافحة--CD11b/c، OX42 استنساخ)، وغاما دلتا تي الخلايا (TCRγδ المضادة، استنساخ V65). ثم يغسل مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا وأجهزة الطرد المركزي 10 دقيقة في 430 x زاي تجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: لفرز CD8 الطبيعية الجرذان+ تريجس من السذاجة في الوقت نفسه كخلايا CD4+ خلايا المستجيب T، لا تقم بإضافة CD8α المضادة Ab خلال استنزاف.
    6. أغسل حبات مغناطيسية 3 مرات مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا كما هو موضح في الخطوة 2.1.7.
    7. إزالة الخلايا غير المرغوب فيها بواسطة خلط سبلينوسيتيس مع الخرز المغناطيسية لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية تحت الانفعال، ثم ضع الأنبوبة في المغناطيس لمدة 1 دقيقة ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. كرر مرتين. عد الخلايا وضبط تركيز الخلية إلى 5 × 107 خلايا/مل في 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
      ملاحظة: يجب أن تتراوح عدد سبلينوسيتيس بين 5 × 107 و 8 × 107 الخلايا.
    8. إضافة أجسام مضادة مسماة لنوع CD4+CD25 الخلايا T– : مكافحة--TCRαβ (استنساخ R7/3)، المضادة لخلايا CD4 (OX35 استنساخ)، مكافحة-CD25 (استنساخ OX39) واحتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. للفرز في وقت واحد CD8+CD45RCمنخفض تريجس، إضافة CD45RC المضادة Ab (استنساخ OX22). قم بتسمية الخرز مع كل آب إعداد مصفوفة تعويض لمزيد من المعالجة في التدفق الخلوي. تغسل الخلايا مع X PBS/2% 1 السفح/0.5 مم يدتا وتجاهل المادة طافية.
    9. ريسوسبيند الخلايا إلى 5 × 107 خلايا/مل، مرشح على مرشح أنسجة 60 ميكرومتر، وقم بتسمية الخلايا الميتة بإضافة DAPI بتركيز 0.1 ميكروغرام/مل نهائي. فرز الخلايا مع أرز خلية فوهة 70 ميكرومتر حسب النابضة في تكر DAPI –+CD4+CD25– الخلايا كخلايا المستجيب (وإذا لزم الأمر تكر DAPI –+CD4–CD45RCمنخفضة ك CD8+ الخلايا القمعية تريجس) كما هو مبين في الشكل 2.
  3. عزل الخلايا القمعية
    ملاحظة: تقسم الطحال في مختبرين اثنين: فرز واحد في الخلايا ب، النقوي الخلايا والخلايا ناغورني كاراباخ، وأخرى في خلايا CD4+ و CD8+ CD45RCمنخفضة تي الخلايا، لتقييم وظيفتها القمعية.
    ملاحظة: لنقل خلية التبني، وحفظ 1 × 108 سبلينوسيتيس لتكون بمثابة عنصر التحكم إيجابية من التسامح بنقل التبني، إذا لزم الأمر.
    1. فرز ب الخلايا والخلايا النقوي، وخلايا ناغورني كاراباخ
      1. اتبع البروتوكول 2.1.1 إلى 2.1.5.
      2. احتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية مع 2 ميكروغرام/مل تي خلية محددة غير مسمى الأجسام المضادة (مكافحة TCRαβ، واستنساخ R7/3، ومكافحة--TCRγδ،، V65 استنساخ)، يغسل مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا والطرد المركزي 10 دقيقة في 430 x زاي تجاهل المادة طافية.
      3. يغسل مع الخرز المغناطيسي 3 مرات مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا كما هو موضح في الخطوة 2.1.7.
      4. مزيج سبلينوسيتيس مع الخرز المغناطيسي لإزالة الخلايا غير المرغوب فيها واحتضان لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية تحت الانفعال، ثم ضع الأنبوبة في المغناطيس لمدة 1 دقيقة ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. كرر مرتين. عد الخلايا وضبط تركيز الخلية إلى 5 × 107 خلايا/مل في 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
      5. إضافة أجسام مضادة مسماة إلى سبلينوسيتيس لفرز الخلايا مع المشتبه فيهم نشاط القمعية مثل خلايا النقوي (مكافحة--CD11b/ج، واستنساخ OX42) أو الخلايا ب (مكافحة--CD45RA، OX33 استنساخ) أو الخلايا ناغورني كاراباخ (مكافحة--CD161، 3.2.3 استنساخ). قم بتسمية الخرز مع كل آب بإنشاء مصفوفة تعويض على نظام مراقبة الأصول الميدانية. احتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وتغسل مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
      6. ريسوسبيند الخلايا بتركيز 5 × 107 خلايا/مل، مرشح على مرشح أنسجة 60 ميكرومتر، وقم بتسمية الخلايا الميتة بإضافة DAPI بتركيز 0.1 ميكروغرام/مل نهائي. فرز الخلايا مع أرز خلية فوهة 70 ميكرومتر حسب النابضة في DAPI–CD11b/ج+ للخلايا النقوي، CD45RA+ ب الخلايا و CD161+ للخلايا ناغورني كاراباخ كما هو مبين في الشكل 3.
    2. الفرز من خلايا CD4 + و CD8 + CD45RC الخلايا منخفض T
      1. اتبع البروتوكول 2.2.1 إلى 2.2.4.
      2. للانتقاء السلبي على عمود مغناطيسي، احتضان الخلايا 15 دقيقة في 4 درجات مئوية مع 2 ميكروغرام/مل تنقية الأجسام المضادة المحددة للخلايا ب (مكافحة--CD45RA، OX33 استنساخ)، والخلايا ناغورني كاراباخ (المضادة CD161، 3.2.3 استنساخ)، خلايا النقوي (مكافحة--CD11b/c، OX42 استنساخ)، وغاما دلتا تي الخلايا ( مكافحة--TCRγδ، استنساخ V65)، غسلها مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا والطرد المركزي 10 دقيقة في 430 x زاي تجاهل المادة طافية.
      3. أغسل حبات مغناطيسية 3 مرات مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا كما هو موضح في الخطوة 2.1.7.
      4. إزالة الخلايا غير المرغوب فيها بواسطة خلط في سبلينوسيتيس مع الخرز المغناطيسية لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية تحت الانفعال، ثم ضع الأنبوبة في المغناطيس لمدة 1 دقيقة ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد. كرر مرتين. عد الخلايا وضبط تركيز الخلية إلى 5 × 107 خلايا/مل في 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
      5. إضافة أجسام مضادة مسماة في الخلايا لفرز تريجس: مكافحة--TCRαβ (استنساخ R7/3)، ومكافحة-CD4 (استنساخ OX35)، ومكافحة--CD45RC (النسخة OX22). قم بتسمية الخرز مع كل آب بإنشاء مصفوفة تعويض على نظام مراقبة الأصول الميدانية. احتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية وتغسل مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا.
      6. ريسوسبيند الخلايا بتركيز 5 × 107 خلايا/مل، عامل التصفية على أنسجة 60 ميكرومتر، وقم بتسمية الخلايا الميتة بإضافة DAPI بتركيز 0.1 ميكروغرام/مل نهائي. فرز الخلايا مع أرز خلية فوهة 70 ميكرومتر واسطة النابضة في DAPI–تكر+CD4+CD45RCمنخفضة كخلايا CD4+تريجس و DAPI–+CD4 تكر–CD45RC منخفضة ك CD8+تريجس ( الشكل 4).
        ملاحظة: Ab مكافحة--CD8α (النسخة OX8) يمكن استخدامها بدلاً من Ab CD4 المضادة إذا يتعرضون للتمييز من خلايا CD4 خلايا تي+الخلايا غير-T بوسم تكر المضادة. وجود فائض من خلايا CD4+تريجس ينبغي فرزها تحسبا لموت الخلايا بسبب العلامات صبغ انتشار الخلايا (وثيقة).
  4. كاربوكسيفلوريسسين سوكسينيميديل إستر (CFSE) في وضع العلامات لخلايا المستجيب لقياس الانتشار
    1. بعد فرز الخلايا المستجيب، تغسل مرتين في الخلايا التي تحتوي على برنامج تلفزيوني X 1.
    2. ريسوسبيند الخلايا بتركيز 1 × 107 خلايا/مل في برنامج تلفزيوني X 1 واحتضان مع 0.5 ميكرومتر كفسي لمدة 5 دقائق في RT في الظلام. وتوقف عند رد فعل إضافة FCS 1.5 X الحجم الطرد المركزي 10 دقيقة في ز 430 x في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية.
    3. تغسل مرتين الخلايا مع المتوسطة كاملة، وحساب الخلايا.
      ملاحظة: توقع 30% موت الخلايا في هذه الخطوة.
  5. وصف وثيقة البرنامج القطري لخلايا CD4 + تريجس للمقايسة القمعية في خلايا CD4 + خلايا المستجيب
    ملاحظة: مطلوب هذه الخطوة لتميز CD4 كفسي–+تريجس من المستجيب المتكاثرة كفسي– CD4+خلايا تي في اليوم السادس من كوكولتوري طريق النابضة في وثيقة البرنامج القطري– الخلايا.
    1. بعد CD4+ تريجس الخلية الفرز، تغسل مرتين في الخلايا التي تحتوي على برنامج تلفزيوني X 1.
    2. ريسوسبيند الخلايا بتركيز 1 × 107 خلايا/مل في برنامج تلفزيوني X 1 واحتضان مع 10 ميكرون من V450 وثيقة البرنامج القطري لمدة 20 دقيقة في RT في الظلام.
    3. تغسل مرتين الخلايا مع المتوسطة كاملة، وحساب الخلايا.
      ملاحظة: توقع 30% موت الخلايا في هذه الخطوة.
  6. تقديم المشورة كوكولتوري
    1. استخدام الثقافة في المتوسط تضم: المتوسط RPMI 1640 تستكمل مع البنسلين (5 × 10-5 م)، بيتا-mercaptoethanol (100 U/mL)، ستربتوميسين (0.1 مغ/مل)، بيروفات صوديوم (1 ملم)، الجلوتامين (2 مم)، حبيس المخزن المؤقت (1 ملم)، والأحماض الأمينية غير الأساسية (1 X)، FCS ( 10 في المائة).
    2. خلايا الثقافة في يو 96-جيدا أسفل لوحات.
    3. إضافة خلايا بالترتيب التالي: الخلايا القمعية، وخلايا المستجيب، وخلايا متمكنة.
    4. تبقى ثابتة في عدد خلايا المستجيب T وناقلات الجنود المدرعة متمكنة واختبار عدد مجموعة من تريجس. على سبيل المثال، نسبة 4:4:1، 5 × 104 خلايا القمعية، 5 × 104 خلايا المستجيب، و 1.25 × 104 خلايا متمكنة، ونسبة 2:4:1، 2، 5 × 104 خلايا القمعية، 5 × 104 خلايا المستجيب، و 1.25 × 104 متمكنة الخلايا.
    5. المحافظة على نسبة 5 × 104 خلايا المستجيب ل 200 ميليلتر المتوسطة/جيدا.
    6. لعناصر تحكم، تشمل آبار قليلة مع خلايا المستجيب تي دون متمكنة ناقلات الجنود المدرعة (المراقبة السلبية) وخلايا المستجيب تي مع ناقلات الجنود المدرعة متمكنة دون الخلايا التنظيمية (مراقبة إيجابية) كفسي النابضة في يوم 6 (راجع الخطوة 2.7.6.).
  7. تلوين نظام مراقبة الأصول الميدانية وتحليل بعد 6 أيام كوكولتوري
    ملاحظة: يمكن تقييم انتشار خلايا المستجيب في عدة نقاط زمنية. لاحظ بأن الانتشار المتسارع: كما يزيد من انقسام الخلية، يمكن ملاحظة الاختلافات أكثر بين الظروف القمعية والمراقبة السلبية.
    1. نقل الخلايا من ش 96-جيدا أسفل لوحات إلى 96، حسنا الخامس أسفل لوحات والطرد المركزي 1 دقيقة في 1,200 س ز في 4 درجات مئوية.
    2. حفظ المادة طافية في لوحة جديدة في-20 درجة مئوية لقياس مستويات سيتوكين، إذا لزم الأمر.
    3. تغسل الخلايا مع 200 ميليلتر 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا كل بئر والطرد المركزي 1 دقيقة في س 1,200 ز في 4 درجات مئوية.
    4. إضافة الأجسام المضادة للخلايا للبوابة كذلك على خلايا المستجيب T: مكافحة--تكراب (استنساخ R7/3) ومكافحة-CD4 (استنساخ OX35). احتضان 15 دقيقة في 4 درجات مئوية ويغسل مرتين مع 200 ميليلتر 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا كل بئر. تجاهل المادة طافية.
    5. إضافة 100 ميليلتر من DAPI المخفف في 0.1 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني X 1 وقراءة اللوحة مع محلل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
    6. تحليل الشخصية كفسي طريق النابضة على DAPI سلبي (الخلايا الحية) السلبية وثيقة البرنامج القطري (غير CD4+تريجس) تكر+CD4+ الخلايا. تحتوي الخلايا المستجيب unstimulated القصوى كفسي السطوع كما هو موضح في الشكل 5 أسفل الرسم البياني الأيسر. حضور متمكنة ناقلات الجنود المدرعة، وخلايا المستجيب قد الانتشار القصوى والدنيا كفسي السطوع (أسفل، وسط). حضور متمكنة من ناقلات الجنود المدرعة والخلايا التنظيمية، يكون خلايا المستجيب انتشار متوسطة الحجم والسطوع كفسي (أسفل اليمين).

3. في فيفو التقييم لنشاط الخلايا القمعية بنقل الخلية التبني في قلب المطعمة المستلم

ملاحظة: مطلوب تشعيع للقضاء على الخلايا المضيفة وصالح engraftment الخلية المانحة وانتشارها.

  1. تشعيع المستلمين الاختلاس مبكرا في اليوم السابق على الفساد مسبق المستلم. تخدير الفئران بحقن إيم. من إكسيلازيني (8 ملغ/كغ)-الكيتامين (80 ملغ/كغ) ويتهددها لهم بجرعة قدرها 4.5 غراي بالأشعة السينية.
  2. اتبع البروتوكول 2.3 عزل خلايا فائدة.
    ملاحظة: حفظ 1 × 108 سبلينوسيتيس لتكون بمثابة عنصر تحكم إيجابية من التسامح بنقل التبني، إذا لزم الأمر.
  3. تخدير الفئران باستنشاق 4% إيسوفلوراني-س2 ح 12 بعد التشعيع (في اليوم السابق الاختلاس، وفي المساء،) وغرس الخلايا (5.0 × 107 ر الخلايا أو 3.0 × 107 ب الخلايا، 3.0 × 107 النقوي الخلايا أو 1.50 × 108 رابعا سبلينوسيتيس كعنصر تحكم إيجابية من التسامح بنقل التبني) في هذا السياق القضيب.
    ملاحظة: يعتمد عدد الخلايا المطلوبة للتسامح بنقل التبني على نشاط الخلايا القمعية.
  4. في اليوم التالي، اتبع البروتوكول 1.1 لأداء في allograft. متابعة تطور الاختلاس بالجس عن طريق البطن.

4-الجهات المانحة كشف الأجسام المضادة المحددة

ملاحظة: مفتش يتم قياس الاستجابات الموجهة نحو الجهة المانحة الاختلاس التي تفرخ الخلايا من الجهة المانحة بالمصل للمستلم. قم بطرح الخلفية الناجم عن تلطيخ مباشرة ب LEW.1W الخلايا التي تفرخ الخلايا مع سينجينيك LEW.1W المصل.

  1. حصاد الدم من الفئران والطرد المركزي 15 دقيقة في س 1,200 ز في 4 درجات مئوية. حفظ المصل. يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية المصل أو استخدامها على الفور. إلغاء تنشيط مكمل في الأمصال التي تفرخ لمدة 30 دقيقة في 56 درجة مئوية.
  2. حصاد الطحال من الفئران LEW.1W مانحة وحفظه في البرد 1 X برنامج تلفزيوني. اتبع الخطوات 2.2.1. ل 2.2.4. إضافة 2 × 105 خلايا/بئر في صفيحة أسفل الخامس 96-جيدا. الطرد المركزي 1 دقيقة في 1,200 س ز في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية.
  3. تمييع الأمصال تسلسلياً من 1/10 لبرنامج تلفزيوني في 1/270 1 X (4 تخفيف في عينة). احتضان الخلايا ح 1 في 4 درجات مئوية مع 25 ميليلتر من المصل المخفف/جيدا. توقع عدد الاستجابات المناعية الأنواع الفرعية (مفتش، IgG1، IgG2a، IgG2b) مفتش الخاصة بالجهات المانحة لتحليل كل عينة (1 مصل x 4 تخفيف x 4 مفتش الأنواع الفرعية). تغسل الخلايا مع X PBS/2% 1 السفح/0.5 مم يدتا وتجاهل المادة طافية.
  4. احتضان الخلايا مع فرعي كل مفتش مكافحة الفئران الماوس Ab المسمى فلوروتشرومي لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، نوع فرعي/بئر واحدة.
    ملاحظة: إذا كانت غير متوفرة المسمى فلوروتشرومي لمكافحة الفئران Ig Ab، من الممكن استخدام الماوس غير مسمى المنقي لمكافحة الفئران مفتش فرعي Ab وماوس المضادة ثانوية اعتماداً ab. المسمى فلوروتشرومي على فلوروتشروميس المتاحة وتكوين سيتوميتير، ويمكن اختبار عدة أنواع فرعية مفتش مكافحة الفئران في بئر واحدة مع الإعدادات المناسبة.
  5. تغسل الخلايا مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا مرتين وتجاهل المادة طافية.
  6. إضافة 100 ميليلتر من DAPI المخفف في 0.1 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني وقراءة اللوحة مع محلل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
  7. قراءة الأسفار متوسط الكثافة (MFI) لمكافحة الفئران مفتش فرعي المسمى Ab مع فلوروتشرومي على كافة الخلايا DAPI– . طرح مؤسسة مونتانيار الحصول عليها مع السذاجة LEW.1A المصل على الخلايا LEW.1W (تلوين الخلفية، أسفل اليسار) من مؤسسة مونتانيار الحصول عليها مع الأمصال من كل مستلم على الخلايا LEW.1W في تمييع المقابلة (السفلي الأوسط للمستلمين رفض غير المعالجة التي عرض مؤسسة مونتانيار القصوى والدنيا الحق للمستلمين متسامح المعالجة التي تعرض مؤسسة مونتانيار المتوسطة) (الشكل 6).

5-تقييم استجابات خلطيه إلى المستضدات خارجية المنشأ (ساذج والذاكرة)

ملاحظة: يجب استخدام مصل من الفئران قبل زرع الأعضاء، والعلاج، والتحصين كعناصر سلبية لاستجابات خلطيه. وبخلاف ذلك، يمكن استخدام الفئران ساذجة غير المحصنين. المصل من الأشخاص المتلقين، أي، زرع تحصين اكسوانتيجين ورفض المستفيدين، تستخدم كعناصر إيجابية من استجابات خلطيه.

  1. القدرة على تطوير استجابة خلطيه مستضد جديدة (الشكل 7)
    ملاحظة: هذا الأسلوب التحديد كمي نسبي لاستجابات خلطيه كما أنها لا تتضمن معياراً. القياس الكمي Ig مطلق سيكون من الممكن عن طريق إضافة مجموعة من تخفيف للفئران IgG أو IgM كله المضادة Ab مع تركيز معلوم في خطوة 5.1.6.
    1. استحلاب 50 ميكروغرام من كله في 200 ميليلتر من adjuvant الشعبية فروند كاملة وحقن في ذيل المتلقين طويلة الباقين على قيد الحياة/متسامح، التحكم المستلمين رفض غير المعالجة، أو الفئران ساذجة كالتحكم الإيجابي لاستجابات خلطيه.
    2. حصاد عينات الدم في 4 و 13 يوما بعد التحصين، والطرد المركزي 15 دقيقة في 1,200 س ز في 4 درجات مئوية. حفظ المرحلة العليا من المصل. حصاد المصل من الفئران غير المحصنين لعنصر تحكم سلبية. يمكن أن تجمد المصل في-20 درجة مئوية حتى الإنزيم ELISA.
    3. معطف لوحات إليزا (القاع المسطح) مع 50 ميليلتر/البئر كله تضعف في 10 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني س 1 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. تأكد من أن الحل الطلاء يغطي جميع الآبار.
    4. إزالة كله غير المصقول الزائدة بالغسيل. ليغسل، إضافة 150 ميليلتر/جيدا من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي (PBS X 1 يحتوي على 0.1% توين) ونفض الغبار.
    5. كتلة غير محدد ملزم للمفتش العام الخاص بالمستلم بحضانة ح 1 في 37 درجة مئوية من غسل مخزن يحتوي على السفح 10% 100 ميليلتر/جيدا. أغسل مرة واحدة.
    6. متسلسل تمييع الأمصال المتلقية في المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي بدءاً من 1/40 إلى 1/512، إضافة 50 ميليلتر/بئر في التكرارات لتمييع التسلسلي للوحة المغلفة، واحتضانها ح 2 في 37 درجة مئوية. الاحتفاظ ببعض الآبار خالية من المصل لعنصر تحكم سلبية. تغسل مرتين.
    7. إضافة 50 ميليلتر 1 ميكروغرام/مل من البيوتين مترافق مكافحة الفئران IgM Ab في الآبار التي تحتوي على المصل تحصد في يوم 4 في المستلمين، أو 50 ميليلتر من البيوتين مترافق مكافحة الفئران مفتش في الآبار التي تحتوي على المصل تحصد في يوم 13، واحتضان ح 1 في 37 درجة مئوية. تغسل مرتين.
    8. إضافة 50 ميليلتر/بئر streptavidin مترافق HRP في 1 ميكروغرام/مل لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أغسل 3 مرات.
    9. إضافة 50 ميليلتر من 3، 3، 5، 5 '--تيتراميثيلبينزيديني (TMB) الركيزة < 30 دقيقة في الرايت والتوقف عن رد فعل مع 25 ميليلتر من حامض الكبريتيك 2 متر عند المشبعة عناصر إيجابية.
    10. قراءة امتصاص في 405 نانومتر. مقارنة الكثافة البصرية الحصول على مصل للمستلم الذي حصل مع المصل مكافحة الفئران ساذجة.
  2. تقييم قدرة استجابة خلطيه الذاكرة (رقم 8)
    1. 7 أيام قبل الزرع، حقن رابعا 109 من كرات الدم الحمراء إكسينوجينيك المخفف في 800 ميليلتر من 1 X برنامج تلفزيوني في الفئران ساذجة. يمكن أن تكون كرات الدم الحمراء من الأغنام أو الحصان أو أي أنواع أخرى.
    2. القيام بزرع الأعضاء وإدارة العلاج توليروجينيك.
    3. 3 أيام بعد الاختلاس، حقن مرة أخرى i.v.109 ربك المخفف في 800 ميليلتر من برنامج تلفزيوني X 1 في المستلمين الاختلاس والفئران غير المطعمة.
    4. حصاد الدم عينات 5 و 14 يوما بعد التحصين الثاني والطرد المركزي 15 دقيقة في س 1,200 ز عند 4 درجة مئوية لاسترداد في المرحلة العليا المصل. يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية المصل أو استخدامها على الفور. إلغاء تنشيط المتممة في الأمصال الفئران التي تفرخ 30 دقيقة في 56 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    5. إضافة 2 × 105 ربك/جيدا صفيحة أسفل الخامس 96-جيدا. الطرد المركزي 1 دقيقة في س 1,200 ز في 4 درجات مئوية وتجاهل المادة طافية بعناية بالطموح.
    6. متسلسل تمييع سيرا 2-fold من 1/10 إلى 1/1280 في 1 X برنامج تلفزيوني (8 تخفيف في عينة). احتضان الخلايا ح 1 في 4 درجات مئوية مع 25 ميليلتر من المصل المخفف/جيدا. تغسل الخلايا مع X PBS/2% 1 السفح/0.5 مم يدتا وتجاهل المادة طافية.
    7. احتضان الخلايا مع ربك تمتز الأنواع المضادة الفئران IgG أو IgM الأنواع الفرعية المسماة مع فلوروتشرومي لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، نوع فرعي/بئر واحدة. تقييم الفئران ربك المضادة IgM و IgG في مصل الدم تحصد بعد التحصين، أيام 5 و 14 على التوالي. تغسل الخلايا مع 1 X PBS/2% FCS/0.5 مم يدتا مرتين وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: إذا كانت غير متوفرة المسمى فلوروتشرومي لمكافحة الفئران Ig Ab، من الممكن استخدام الماوس غير مسمى المنقي لمكافحة الفئران مفتش فرعي Ab وماوس المضادة ثانوية Ab المسمى فلوروتشرومي.
    8. إضافة 100 ميليلتر من DAPI المخفف في 0.1 ميكروغرام/مل في برنامج تلفزيوني X 1 وتحليل الخلايا مع محلل نظام مراقبة الأصول الميدانية.
    9. وتمثل مؤسسة مونتانيار كدالة لتمييع لكل مجموعة.

النتائج

تقييم نشاط القمعية بعد فرز ناقلات الجنود المدرعة (الشكل 1)، وخلايا المستجيب وتريجس في أن واحد (الشكل 2)، أو بشكل فردي (الشكل 4)، ويمكن أن يكون أي المفترضة التنظيمية الخلايا الأخرى (الشكل 3)، القيام به في فيفو<...

Discussion

نقل التبني من مجموع سبلينوسيتيس إلى مستلم المطعمة حديثا طريقة فعالة للكشف عن وجود خلايا تنظيمية المستحث أو بوتينتياتيد بعلاج. المضيف التي يسببها الإشعاع ليمفوبينيا عابرة يعزز بقاء الخلية بعد نقل وإقامة للتسامح. وعلاوة على ذلك، يترك تشعيع الفتاكة دون وقت للخلايا مع خصائص توليروجينيك لتح?...

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

وقد أدركت هذا العمل في سياق المشروع مكتب المفتش العام لابيكس (جوان ANR-11-لابكس-0016-01) الذي يعد جزءا من برنامج الحكومة الفرنسية "يشرف دعفينير" الذي يديره ANR (ANR-11-لابكس-0016-01) ومشروع رامي سيستي تمول أيضا من خلال " يشرف دعفينير "برنامج" الحكومة الفرنسية "، تتم إدارته من قبل الفرنسية الوطنية أبحاث الوكالة (ANR-10-إيبهو-005). رامي-سيستي المشروع تدعمه أيضا نانت متروبول وضمور يدفع de la Loire.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
animals
LEW.1W and LEW.1A ratsJanvier Labs, France8 weeks old, 
BN third party donor ratsJanvier Labs, France8 weeks old, 
namecompanycatalogue numbercomments
reagents
AdCD40IgViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
IL34-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
FGL2-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francehome made plasmids
anti-TCRabHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KR7/3 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD25Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX39 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD8Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX8 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RAHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX33 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD161Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.K3.2.3 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD11b/cHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX42 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-TCRgdHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KV65 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RCHybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX22 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD4Hybridoma from European Collection of Cell Culture, Salisbury, U.KOX35 cloneHome made culture, purification and fluororophore coupling
anti-CD45RBD Biosciences, Mountain View, CA#554881, His24 clone
anti-rat IgG-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#112-096-071
anti-rat IgG1Serotec#MCA 194
anti-rat IgG2aSerotec#MCA 278
anti-rat IgG2bSerotec#MCA 195
anti-rat IgM-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, USA#115-095-164
streptavidin HRPBD Biosciences, Mountain View, CA#554066
KLHSigma Aldrich, St. Louis, USA#9013-72-3
PBS 1XThermo Fisher Scientific Inc, USAPhosphate Buffer Solution without calcium and magnesium, 
Tween 20Sigma, Saint-Louis, USA#9005-64-5
TMB substrate reagent kitBD Biosciences, Mountain View, CA#555214
CellTraceTM CFSE cell proliferation kitThermo Fisher Scientific Inc, USA#C34554
RPMI 1640 medium 1XThermo Fisher Scientific Inc, USA#31870-025
penicilline streptomycineThermo Fisher Scientific Inc, USA#15140-122
Hepes BufferThermo Fisher Scientific Inc, USA#15630-056
non essential amino acidsThermo Fisher Scientific Inc, USA#11140-035
Sodium pyruvateThermo Fisher Scientific Inc, USA#11360-039
2 beta mercaptoethanolSigma, Saint-Louis, USA#M3148
Cell Proliferation Dye eFluor® 450 CellThermo Fisher Scientific Inc, USA#65-0842-85
GlutamineSigma, Saint-Louis, USA#G3126
DAPIThermo Fisher Scientific Inc, USA#D1306
Collagenase DRoche Diagnostics, Germany#11088882001
EDTASigma, Saint-Louis, USA#E5134
NaCl 0.9%Fresenius Kabi#B230561
Magnetic dynabeadsDynal, Invitrogen#11033Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeadsEbiosciences, San Diego, USA#01-1111-42
BetadineRefer to the institutional guidelines
IsofluraneRefer to the institutional guidelines
NaplbuphineRefer to the institutional guidelines
TerramycineRefer to the institutional guidelines
BuprenorphineRefer to the institutional guidelines
MeloxicamRefer to the institutional guidelines
Complete Freund's adjuvant
RompunRefer to the institutional guidelines
Ringer lactateRefer to the institutional guidelines
KetamineRefer to the institutional guidelines
Red blood cell lysis solutionDilute 8,29g NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, USA A-9434), 1g KHCO3 (Prolabo 26 733.292) and 37.2mg EDTA (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) in 800ml H2O. Adjust pH to 7.2-7.4 and complete to 1L with H2O.
Collagenase DDilute 1g collagenase in 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-EDTA (0.5%)Add 5 mL EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) and 20ml FCS to 1ml PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)Dilute 50µg (=1 vial) of CFDA SE (component A) in 90μl DMSO (component B) solution to obtain a 10mM stock solution. Then, dilute stock solution at 1/20 000 in PBS 1X to obtain a 0.5μM solution
complete medium for coculture500ml complete RPMI-1640 medium with 5 ml Penicillin (80 unit/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml L-Glutamine, 5 ml Non Essential Amino Acids (100X), 5ml Pyruvate Sodium (100mM), 5 ml HEPES buffer (1M), 2.5 ml b mercaptomethanol (7 ml of 2-bmercaptoethanol stock diluted in 10 ml RPMI), 10% FCS
namecompanycatalog numbercomments
equipments
falcon 50mlBD Biosciences, Mountain View, CA#227261
falcon 15mlBD Biosciences, Mountain View, CA#188271
sieve
Corning plastic culture dishesVWR, Pessac#391-0439
100µm and 60µm tissue filtersSefar NITEX, Heiden, Switzerland#03-100/44 and #03-60/35
96 wells U bottom plates for coculture Falcon U-bottom Tissue Culture plate, sterile, Corning#353077
96 wells V bottom plates for FACS stainingThermoScientifique, Danemark#249570
96 wells flat bottom ELISA platesNunc Maxisorb
seringue for spleen crushBD Biosciences, Mountain View, CA#309649
ELISA readerSPARK 10M, Tecan, SwitzerlandSPARK 10M, Tecan, Switzerland
centrifuge
bain marie 
X rays irradiatorLincolshire, EnglandFaxitron CP160
solar agitator
FACS Canto IIBD Biosciences, Mountain View, CA
FACS Aria IIBD Biosciences, Mountain View, CA
magnetThermo Fisher Scientific Inc, USA12302D

References

  1. Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117 (4), 1096-1106 (2007).
  2. Bézie, S., et al. Compensatory Regulatory Networks between CD8 T, B, and Myeloid Cells in Organ Transplantation Tolerance. J Immunol. 195 (12), 5805-5815 (2015).
  3. Bézie, S., et al. Fibrinogen-Like Protein 2/Fibroleukin Induces Long-Term Allograft Survival in a Rat Model through Regulatory B Cells. PloS One. 10 (3), e0119686 (2015).
  4. Bézie, S., et al. IL-34 is a Treg-specific cytokine and mediates transplant tolerance. J Clin Invest. 125 (10), 3952-3964 (2015).
  5. Li, X. L., et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance. J Immunol. 185 (2), 823-833 (2010).
  6. Guillonneau, C., Bézie, S., Anegon, I. Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  7. Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol. 13 (1), 242-251 (2002).
  8. Chiffoleau, E., et al. Induction of donor-specific allograft tolerance by short-term treatment with LF15-0195 after transplantation. Evidence for a direct effect on T-cell differentiation. Am J Transplant. 2 (8), 745-757 (2002).
  9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 4 (4), 337-342 (2003).
  10. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  11. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  12. Dai, Z., et al. Natural CD8+CD122+ T cells are more potent in suppression of allograft rejection than CD4+CD25+ regulatory T cells. Am J Transplant. 14 (1), 39-48 (2014).
  13. Guillonneau, C., Picarda, E., Anegon, I. CD8+ regulatory T cells in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (6), 751-756 (2010).
  14. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
  15. Manavalan, J. S., et al. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+ tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity. Int Immunol. 16 (8), 1055-1068 (2004).
  16. Picarda, E., et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells. JCI Insight. 2 (3), e90088 (2017).
  17. Ménoret, S., et al. Phenotypic and functional characterization of CD8(+) T regulatory cells. Methods Mol Biol. 677, 63-83 (2011).
  18. Boor, P. P. C., et al. Human plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ LAG-3+ Foxp3+ CTLA-4+ regulatory T cells that suppress allo-reactive memory T cells. Eur J Immunol. 41 (6), 1663-1674 (2011).
  19. Olson, B. M., Sullivan, J. A., Burlingham, W. J. Interleukin 35: a key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance. Front Immunol. 4, 315 (2013).
  20. Shimizu, J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S. Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3 (2), 135-142 (2002).
  21. Myers, L., Croft, M., Kwon, B. S., Mittler, R. S., Vella, A. T. Peptide-specific CD8 T regulatory cells use IFN-gamma to elaborate TGF-beta-based suppression. J Immunol. 174 (12), 7625-7632 (2005).
  22. Bouaziz, J. D., Le Buanec, H., Saussine, A., Bensussan, A., Bagot, M. IL-10 producing regulatory B cells in mice and humans: state of the art. Curr Mol Med. 12 (5), 519-527 (2012).
  23. Durand, J., Chiffoleau, E. B cells with regulatory properties in transplantation tolerance. World J Transplant. 5 (4), 196-208 (2015).
  24. Pallier, A., et al. Patients with drug-free long-term graft function display increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitory phenotype. Kidney Int. 78 (5), 503-513 (2010).
  25. Guillonneau, C. Efficacy of Myeloid Derived Suppressor Cells on Transplant Survival. Transplantation. 99 (10), 2017-2019 (2015).
  26. Wood, K. J., Bushell, A., Hester, J. Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 417-430 (2012).
  27. Han, Y., et al. Pathogen-expanded CD11b+ invariant NKT cells feedback inhibit T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1. J Autoimmun. 58, 21-35 (2015).
  28. Mesnard, L., et al. Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBM glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 20 (6), 1282-1292 (2009).
  29. Mi, Q. S., Ly, D., Zucker, P., McGarry, M., Delovitch, T. L. Interleukin-4 but not interleukin-10 protects against spontaneous and recurrent type 1 diabetes by activated CD1d-restricted invariant natural killer T-cells. Diabetes. 53 (5), 1303-1310 (2004).
  30. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nat Med. 7 (9), 1057-1062 (2001).
  31. Wermeling, F., Lind, S. M., Jordö, E. D., Cardell, S. L., Karlsson, M. C. I. Invariant NKT cells limit activation of autoreactive CD1d-positive B cells. J Exp Med. 207 (5), 943-952 (2010).
  32. Yang, S. H., et al. Sulfatide-reactive natural killer T cells abrogate ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 22 (7), 1305-1314 (2011).
  33. Picarda, E., et al. MHC-derived allopeptide activates TCR-biased CD8+ Tregs and suppresses organ rejection. J Clin Invest. 124 (6), 2497-2512 (2014).
  34. Guillot, C., et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection. J Immunol. 168 (4), 1600-1609 (2002).
  35. Guillonneau, C., et al. Inhibition of chronic rejection and development of tolerogenic T cells after ICOS-ICOSL and CD40-CD40L co-stimulation blockade. Transplantation. 80 (4), 546-554 (2005).
  36. Guillonneau, C., et al. Anti-CD28 antibodies modify regulatory mechanisms and reinforce tolerance in CD40Ig-treated heart allograft recipients. J Immunol. 179 (12), 8164-8171 (2007).
  37. Qin, S., et al. "Infectious" transplantation tolerance. Science. 259 (5097), 974-977 (1993).
  38. Picarda, &. #. 2. 0. 1. ;., Ossart, J., Bézie, S., Guillonneau, C. Key role of allopeptide-specific CD8(+) Tregs in transplantation. Médecine Sci (Paris). 31 (1), 22-24 (2015).
  39. Chevalier, S., Lacroix, H., Moreau, J. F., Soulillou, J. P. Blood transfusion plus allograft--but not blood transfusion alone--induce IL 2-producing suppressor cells in Lew-1A recipients of LEW-1W heart allograft. Transplant Proc. 19 (1 Pt 1), 544-546 (1987).
  40. Fang, C., et al. Autoimmune responses against renal tissue proteins in long-term surviving allograft recipients. Transpl Int. 22 (11), 1091-1099 (2009).
  41. Yang, C. P., Bell, E. B. Persisting alloantigen prevents primed CD45RC- CD4 T cells from inducing allograft rejection: implications for immunological memory. Eur J Immunol. 29 (7), 2177-2186 (1999).
  42. Durand, J., et al. Regulatory B Cells with a Partial Defect in CD40 Signaling and Overexpressing Granzyme B Transfer Allograft Tolerance in Rodents. J Immunol. 195 (10), 5035-5044 (2015).
  43. Iwata, Y., et al. Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood. 117 (2), 530-541 (2011).
  44. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  45. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  46. Guillonneau, C., David, L., Anegon, I. Improved Analyses of CD8+ T Cell Specificities Using Multimers of Peptide MHC Complexes Coupled to DNA Barcodes. Transplantation. 101 (2), 219-221 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

126 allograft

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved