كابريسي: الجمعية الكيميرا بواسطة الانتعاش البلازميد والقيود إنزيم إدراج الموقع

Summary

هنا، نقدم التجمع الكيميرا عن طريق الانتعاش البلازميد وتقييد انزيم موقع الإدراج (كابريسي)، وهو بروتوكول على أساس إدراج مواقع انزيم تقييد في تسلسل الحمض النووي مرادف والانتعاش البلازميد وظيفية. هذا البروتوكول هو طريقة سريعة ومنخفضة التكلفة لدمج جينات الترميز البروتين.

Abstract

هنا، نقدم التجمع الكيميرا عن طريق الانتعاش البلازميد وتقييد انزيم موقع الإدراج (كابريسي). كابريسي يستفيد من العديد من نقاط القوة في طريقة الانتعاش البلازميد الأصلي ويدخل الهضم انزيم تقييد لتخفيف ردود الفعل ربط الحمض النووي (مطلوب لجمع الكيميرا). لهذا البروتوكول، المستخدمين استنساخ الجينات ويلديب في نفس البلازميد (pUC18 أو pUC19). بعد اختيار السيليكو لمناطق تسلسل الأحماض الأمينية حيث يجب تجميع الشمرات، يحصل المستخدمون على جميع تسلسل الحمض النووي المترادف الذي يشفر لهم. النصوص البرمجية بيرل مخصصة تمكن المستخدمين من تحديد جميع تسلسل الحمض النووي مرادف. بعد هذه الخطوة، يبحث النصي بيرل آخر لمواقع انزيم تقييد على جميع تسلسل الحمض النووي مرادف. يتم إجراء هذا التحليل السيليكو أيضا باستخدام الجينات المقاومة الأمبيسلين ( أمبر ) وجدت على البلازميدات pUC18 / 19. المستخدمين تصميم أوليغونوكلأوتيدس داخل المناطق المرادف لتعطيل ويلديب و أمبر الجينات عن طريق ير. بعد أوبتإينينغ وتنقية شظايا الحمض النووي التكميلية، ويتم إنجاز انزيم تقييد الهضم. يتم تحقيق تجمع الكيميرا من خلال ليغاتينغ شظايا الحمض النووي التكميلية المناسبة. يتم اختيار ناقلات pUC18 / 19 من أجل كابريسي لأنها توفر مزايا تقنية، مثل الحجم الصغير (2،686 زوجا أساسيا)، ورقم نسخة عالية، وميزات تفاعل تسلسل مفيدة، وتوافر تجاري. إن استخدام إنزيمات التقييد لتجمع الكيميرا يلغي الحاجة إلى بوليمرات الحمض النووي التي تنتج منتجات غير حادة. كابريسي هو طريقة سريعة ومنخفضة التكلفة لدمج جينات الترميز البروتين.

Introduction

وقد تم استخدام تجميع الجينات الخيميري على نطاق واسع في البيولوجيا الجزيئية لتوضيح وظيفة البروتين و / أو لأغراض التكنولوجيا الحيوية. هناك أساليب مختلفة لتفجير الجينات، مثل تداخل ير التضخيم المنتج ¹ ، الانتعاش البلازميد ² ، إعادة التركيب مثلي ³ ، أنظمة كريسبر-Cas9 ⁴ ، إعادة توجيه الموقع الموجهة ⁵ ، وتجميع جيبسون ⁶ . كل من هذه المزايا التقنية المختلفة؛ على سبيل المثال، ومرونة تداخل تصميم ير، واختيار الجسم الحي من الإنشاءات خلال الانتعاش البلازميد، أو كفاءة عالية من كريسبر-Cas9 ونظم جيبسون. من ناحية أخرى، يمكن أن تنشأ بعض الصعوبات أثناء أداء بعض هذه الأساليب. على سبيل المثال، يعتمد النهجان الأولان على شظايا الحمض النووي غير الحادة، وقد يكون ربط هذه الأنواع من المنتجات تحديا تقنيا مقارنة بالأشكال الساكنةكي-إندد ربط. يمكن إعادة التركيب الموجه للموقع ترك آثار تسلسل الحمض النووي اضافية (ندوب) على الأصل، كما هو الحال في نظام كريلكسب ⁵ . يمكن كريسبر-Cas9 تعديل المناطق الجينوم أخرى في بعض الأحيان بالإضافة إلى الموقع المستهدف ⁴ .

هنا، نحن نقدم تجميع الكيميرا عن طريق الانتعاش البلازميد وتقييد الإدراج انزيم الموقع (كابريسي)، وهو بروتوكول لدمج جينات الترميز البروتين الذي يجمع بين طريقة الانتعاش البلازميد (برم) مع إدراج مواقع انزيم تقييد على تسلسل الحمض النووي مرادف، وتعزيز كفاءة ربط . لضمان سلامة تسلسل الأحماض الأمينية، يتم إدراج مواقع انزيم تقييد على امتداد تسلسل الحمض النووي مرادف. من بين فوائد كابريسي أنه يمكن أن يؤديها باستخدام الكواشف المخبرية العادية / أدوات (على سبيل المثال ، الإنزيمات، والخلايا المختصة، والحلول، و ثيرمويكلر) وأنه يمكن أن تعطي نتائج سريعة (عندما يتم استخدام الإنزيمات المناسبة). الاعتماد على التقييدإنزيم المواقع التي تخرج من تسلسل الحمض النووي مرادف يمكن أن تحد من اختيار نقاط الاندماج الدقيق داخل البروتينات ذات الاهتمام. في مثل هذه الحالات، يجب أن تنصهر الجينات المستهدفة باستخدام أوليغونوكليوتيدس متداخلة، وينبغي إدراج مواقع انزيم تقييد على الجينات المقاومة للناقل.

كابريسي يتكون من سبع خطوات بسيطة ( الشكل 1 ): 1) اختيار ناقلات الاستنساخ، pUC18 أو pUC19 ⁶ ؛ 2) في تحليل سيليكو من تسلسل ويلديب أن تنصهر. 3) اختيار المناطق كسر لتجمع الكيميرا وانزعاج البلازميد. 4) في توليد السيليكو من تسلسل الحمض النووي مرادف التي تحتوي على مواقع انزيم تقييد؛ 5) استنساخ مستقل للجينات ويلديب في البلازميد المحدد. 6) اضطراب البلازميد عن طريق ير، تليها تقييد انزيم الهضم. و 7) الانتعاش البلازميد باستخدام ربط الحمض النووي والتحول البكتيري. وينبغي التحقق من الجينات الخيميائية التي تنتجها هذه التقنية ثإيث التسلسل.

وتوفر ناقلات pUC18 / 19 مزايا تقنية للاستنساخ وجمع الكيميرا، مثل الحجم الصغير ( أي 2،686 زوجا أساسيا)، ورقم نسخة عالية، وميزات تفاعل تسلسل مفيدة، وتوافر تجاري ⁷ . هنا، تم استخدام مضيف إشيريشيا كولي لتجميع ومعالجة الكيميرا لأن الثقافات البكتيرية رخيصة وتنمو بسرعة. وبالنظر إلى هذا، سوف تكون هناك حاجة لاستنساخ لاحق من شظايا الانصهار في البلازميدات الهدف النهائي (على سبيل المثال، ناقلات التعبير كما PRK415 في البكتيريا أو بمف في خلايا الثدييات).

تم اختبار كابريسي لدمج اثنين من الجينات عامل سيغما الأولية: E. كوليربود و ريزوبيوم إتليسيغا . عوامل سيغما الأولية هي وحدات بوليميراز الحمض النووي الريبي المسؤولة عن بدء النسخ، وتتكون من أربعة مجالات ( أي σ1، σ2، σ3، σ4) ⁸ . تسلسل الأحماض الأمينية لينغتساعة من البروتينات المشفرة بواسطة ربود و سيغا هي 613 و 685، على التوالي. ربد و سيغا حصة 48٪ الهوية (98٪ التغطية). تم تقسيم هذه العوامل سيجما الأولية إلى شظيتين تكميلية بين المناطق σ2 و σ3. تم تجميع اثنين من الجينات الخيميائية وفقا لهذا التصميم: الكيميرا 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) و تشيميرا 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). تم التحقق من منتجات الحمض النووي الانصهار عن طريق التسلسل.

Protocol

1 - بروتوكول كابريسي

ملاحظة: الشكل 1 يمثل بروتوكول كابريسي العام. وتستند هذه التقنية على تصميم في السيليكو والبناء اللاحق من الشيمرات المطلوب.

1. اختيار البلازميد الاستنساخ، pUC18 أو pUC19.
   1. حدد ناقل بك الذي يناسب المطالب الفنية.
      ملاحظة: كلا ناقلات لها نفس تسلسل، باستثناء اتجاه موقع الاستنساخ متعددة. هذا مهم لتصميم أوليغونوكلأوتيدس وتعطيل البلازميد ير.
2. في تحليل السيليكو للجينات ويلديب و متواليات pUC18 / 19.
   1. الحصول على تسلسل الحمض النووي من الجينات ويلديب وحفظها في ملف تنسيق فاستا (على سبيل المثال، genes.fas).
      ملاحظة: وترد متواليات ناقلات pUC18 / 19 في ملف pUC.fas ( الشكل 1 ، الخطوة 1).
   2. تحديد أي تقييد إنزيميس لا قطع الجينات ويلديب و متواليات pUC18 / 19 عن طريق تشغيل البرنامج النصي Research.pl. بدلا من ذلك، إجراء تقييد البحث موقع انزيم مع أداة على الانترنت ( الشكل 1 ، الخطوة 2).
      1. اكتب ما يلي في محطة:
         بيرل Research.pl genes.fas
         بيرل Research.pl pUC.fas
         ملاحظة: ستقوم هذه الأوامر بإنشاء ملفات الإخراج التالية: genes_lin.fas و genes_re.fas و pUC_lin.fas و pUC_re.fas.
      2. حدد إنزيمات التقييد المناسبة لاستنساخ جينات ويلديب في موقع الاستنساخ المتعدد للناقل pUC18 / 19 المختار من خلال مقارنة ملف genes_re.fas و pUC.fas. اختيار اتجاه إدراج نسبة إلى الجينات المقاومة أمبيسلين ( أمبر ) من ناقلات pUC18 / 19.
   3. تصميم أوليغونوكلأوتيدس إلى الأمام وعكس لتضخيم منطقة الترميز من الجينات ويلديب (أوليغونوكلأوتيدس الخارجية). تضمين موقع الإنزيم تقييد السليم في كل نهاية 5 'من قليل النوكليوتيدات. وهذا سوف يحدد التوجه إدراج.
      1. وتشمل وظيفية ريبوسوم ملزم موقع في أوليغونوكلأوتيدس إلى الأمام.
      2. إدراج كل من الجينات ويلديب في نفس التوجه داخل المتجه.
3. اختيار المناطق المتكسرة لتجمع الكيميرا وانقطاع البلازميد.
   1. الحصول على تسلسل الأحماض الأمينية من ويلديب والجينات أمبر عن طريق تشغيل البرنامج النصي translate.pl ( الشكل 1 ، الخطوة 3).
      1. اكتب ما يلي في محطة:
         بيرل translate.pl genes.fas
         بيرل translate.pl ampR.fas
         ملاحظة: سيؤدي هذا البرنامج النصي إلى إنشاء ملفات الإخراج التالية: genes_aa.fas و ampR_aa.fas.
   2. على الصعيد العالمي محاذاة متواليات الحمض الأميني ويلديب اثنين مع البرامج المناسبة (على سبيل المثال، موسكل) ⁹ .
   3. حدد مناطق كسر المطلوب (3-6 الأحماض الأمينية) لالمحاكاةمبلي على أساس محاذاة التسلسل. حفظها في ملف في تنسيق فاستا (على سبيل المثال ، region.fas).
   4. تحديد موقع تسلسل الحمض النووي أن رمز للحمض الأميني المحدد تمتد على كل من الجينات ويلديب.
4. في جيل سيليكو من تسلسل الحمض النووي مرادف التي تحتوي على مواقع انزيم تقييد.
   1. الحصول على جميع تسلسل الحمض النووي مرادف أن رمز لكل تسلسل الأحماض الأمينية تمتد اختيار المناطق كسر ( الشكل 1 ، الخطوة 4). تم تخزين هذه المتتاليات في الملف region.fas.
      1. اكتب ما يلي في محطة:
         بيرل synonym.pl region.fas
         ملاحظة: سيقوم هذا البرنامج النصي بإنشاء ملف الإخراج region_syn.fas.
   2. البحث عن مواقع انزيم تقييد وجدت على تسلسل الحمض النووي مرادف.
      1. اكتب ما يلي في محطة: بيرل REsynonym.pl region_syn.fas
         ملاحظة: سيقوم هذا البرنامج النصي بإنشاء ملف الإخراج region_syn-re.fas.
   3. اختيار انزيم تقييد واحد التي يتم تقاسمها بين مترادفات متسلسلة من كل من الجينات ويلديب؛ سيتم استخدام هذا الموقع لتجميع الشمرات عن طريق تقييد انزيم الهضم. تحقق من أن انزيم تقييد اختيار قطع لا الجينات ويلديب ولا تسلسل ناقلات pUC18 / 19.
      1. قارن إنزيمات التقييد الموجودة على ملفات genes_re.fas و pUC_re.fas و region_syn-re.fas.
   4. في السيليكو استبدال النسخ الأصلية لتسلسل الحمض النووي مرادف في مكان المقابلة على كل من الجينات ويلديب. إلحاق تسلسل الحمض النووي مرادف في ملف تسلسل ويلديب (genes.fas).
   5. الحصول على تسلسل الأحماض الأمينية من الجينات الواردة في ملف genes.fas ( بيرل translate.pl genes.fas ).
   6. محاذاة تسلسل الأحماض الأمينية المترجمة من ويلديب وتسلسل الحمض النووي مرادف. تحقق من أن كلا التسلسلين هو نفسه.
   7. كرر جميع خطوات هذا القسم مع الجين أمبر موجودة على بوC18 / 19 ناقلات.
      ملاحظة: الهدف هو تعطيل جينات أمبر (ملف ampR.fas) إلى جزأين تكميليين. وينبغي أن يكون انزيم تقييد اختيار لتعطيل الجين أمبر مختلفة عن تلك المستخدمة لتجميع الكيميرا.
5. استنساخ مستقل للجينات اثنين ويلديب في ناقلات pUC18 / 19 المحدد (الشكل 1، الخطوة 3).
   1. تنقية PUC18 / 19 البلازميد الحمض النووي باستخدام مجموعة تنقية دنا البلازميد.
      1. على سبيل المثال، تحويل E. القولونية DH5α مع البلازميد pUC18 وتنمو المحولات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية على الصلبة لب-0.3 ملغ / مل أمبيسيلين (أمبير). اختيار مستعمرة ترانسفورمانت، تطعيم جديد لب-0.3 ملغ / مل أمبير لوحة، وتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
      2. تأخذ جزءا من الثقافة السابقة وتنمو في السائل لب-0.3 ملغ / مل أمبير لمدة 6-8 ح عند 37 درجة مئوية. استخراج الحمض النووي البلازميد باستخدام عدة.
   2. ير تضخيم الجينات ويلديب من الحمض النووي الجيني الكلي باستخدام أبروبريج أوليغونوكلأوتيدس الخارجية. استخدام البلمرة الحمض النووي عالية الدقة إذا كان ذلك ممكنا. حدد البلمرة الحمض النووي الذي يزيد من العائد. أداء ير وفقا للمبادئ التوجيهية الشركة المصنعة ودرجة حرارة انصهار أوليغونوكلأوتيدس.
      1. تشغيل دورات ير، اعتمادا على البوليميراز الحمض النووي، وحجم أمبليكون، والقالب، و أوليغونوكلأوتيدس المستخدمة. على سبيل المثال، لتضخيم الحمض النووي ربد ، وإعداد 50 ميكرولتر رد فعل: 5 ميكرولتر من العازلة 10X، 2 ميكرولتر من 50 ملي مغسو ₄ ، 1 ميكرولتر من 10 ملي مزيج دنتب، 2 ميكرولتر من كل قليل النوكليوتيد 10 ميكرومتر (الجدول 2)، 2 ميكرولتر من الحمض النووي القالب ( E. القولونية DH5α الحمض النووي الكلي)، 35.8 ميكرولتر من الماء النقي جدا، و 0.2 ميكرولتر من البلمرة الحمض النووي عالية الدقة. تشغيل دورات ير التالية: 1 دقيقة في 94 درجة مئوية لتمسخ الأولي تليها 30 دورات من التضخيم (30 ثانية في 94 درجة مئوية إلى ديناتور، 30 ثانية عند 60 درجة مئوية لتخفيف أوليغونوكلأوتيدس، و 2 دقيقة عند 68 درجة مئوية لتوسيع).
      2. حل 1.2 غرام منأغاروس في 100 مل من الماء المقطر المزدوج عن طريق تسخينها في الميكروويف. تجميع علبة هلام ومشط ووضعها في عجلة هلام الأفقي. ملء علبة هلام مع حل الاغاروز ذاب والسماح لها ترسيخ. إزالة المشط.
      3. وضع هلام في غرفة الكهربائي. ملء الغرفة مع 1X تريس-أسيتات-إدتا العازلة. تحميل 50 ميكرولتر من المنتجات ير في آبار هلام. إليكتروفوريز العينات (على سبيل المثال ، في 110 فولت لمدة 1 ساعة).
      4. بعد الكهربائي، وصمة عار هلام في 100 مل من الماء المقطر المزدوج تحتوي على 100 ميكرولتر من 1 ملغ / مل حل بروميد إثيديوم لمدة 10 دقيقة مع هز بطيئة. غسل الجل في الماء المقطر المزدوج لمدة 10 دقيقة أخرى في هز بطيئة. استخدام شاكر الأفقي.
         تنبيه: إيثيديوم بروميد هو مركب سام؛ ارتداء قفازات واقية ومعطف القطن معطف.
      5. تنقية الحمض النووي الجين ويلديب من العصابات المقابلة من هلام باستخدام عدة. تصور العصابات عن طريق وضع هلام ملون في غرفة الأشعة فوق البنفسجية (أوصى الطول الموجي: 300 نانومتر). الحفاظ على التعرض للهلام إلى الحد الأدنى. استخدام مجموعة تنقية الحمض النووي واتبع تعليمات الشركة الصانعة.
         تنبيه: الأشعة فوق البنفسجية أمر خطير؛ وارتداء درع واقية، والنظارات، ومعطف القطن معطف.
   3. هضم الجينات ويلديب المنقى و pUC18 / 19 دنا البلازميد مع الإنزيمات تقييد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام سريع الانزيمات الهضم عندما يكون ذلك ممكنا. على سبيل المثال، هضم 6 ميكرولتر من الحمض النووي pUC18 (300 نانوغرام / ميكرولتر) في 10 ميكرولتر من الماء عالى النقاء، 2 ميكرولتر من العازلة 10X، 1 ميكرولتر من كن I انزيم التقييد، و 1 ميكرولتر من إنزيم تقييد شبا I. ترك رد فعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
      1. قم بتعطيل إنزيمات التقييد وفقا لإرشادات الشركة الصانعة. على سبيل المثال، تعطيل تفاعل ثنائي الهضم كين I- شبا I في 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   4. مزيج إدراج: الحمض النووي ناقلات في راتي الحجميo من 3: 1. اتبع تعليمات الشركة المصنعة لرد فعل ربط. استخدام الانزيمات ربط سريع عندما يكون ذلك ممكنا (ترك رد فعل في 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة).
      ملاحظة: عادة، تركيز الحمض النووي بعد تنقية باستخدام مجموعات جيدة بما فيه الكفاية لالهضم وربط ردود الفعل. على سبيل المثال، إضافة 6 ميكرولتر من الحمض النووي ربود ( كين I- شبا I، 150 نانوغرام / ميكرولتر)، 3 ميكرولتر من الحمض النووي pUC18 ( كين I- شبا الأول، 150 نانوغرام / ميكرولتر)، 10 ميكرولتر من العازلة 2X، 1 ميكرولتر من أولترابيور المياه، و 1 ميكرولتر من T4 الحمض النووي ليغاز. ترك رد الفعل ربط في 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   5. تحويل E. القولونية DH5α مع 2-4 ميكرولتر من رد الفعل ربط، كما هو موضح في المواد التكميلية. لوحة الخلايا المحولة إلى الصلبة لب / أمب / X-غال / إيبت لوحات. ترك لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
   6. حدد أبيض اللون المحولات E. القولونية المستعمرات وخطوط لهم على لوحة لب / أمبير جديدة. ترك لوحات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
   7. إجراء ير مستعمرة لاختيار المرشحين لتسلسل رد الفعل، كما هو موضح في المواد التكميلية. استخراج الحمض النووي البلازميد من المرشحين. بدلا من ذلك، هضم مرشح الحمض النووي البلازميد مع نفس الإنزيمات تقييد المستخدمة لاستنساخ إدراج.
   8. تسلسل الإنشاءات المرشحة مع مزود خدمة التسلسل ¹⁰ . تجميع تسلسل في سيليكو باستخدام مجمع دنا ¹¹ ( الشكل 1 ، الخطوة 5).
6. اضطراب البلازميد عن طريق ير تليها تقييد انزيم الهضم.
   1. تصميم في أوليغونوكلأوتيدس السيليكو إلى الأمام وعكس في مناطق كسر للجينات ويلديب و أمبر ، على التوالي. بديل في سيليكو جزء ويلديب لتسلسل دنا مرادف المقابلة لها (التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.4).
      ملاحظة: هذا المترادف تسلسل الحمض النووي يحتوي على موقع انزيم تقييد. تداخل أوليغونوكلأوتيدس إلى الأمام والعكس في tانه موقع انزيم تقييد. وينبغي أن تتراوح أوليغونوكلأوتيدس من 21-27 النيوكليوتيدات، تنتهي مع السيتوزين أو غوانين، وتحتوي على موقع انزيم التقييد. و أوليغونوكلأوتيد إلى الأمام لديه نفس تسلسل المنطقة التي تستهدفها على الحمض النووي القالب. و أوليغونوكلأوتيد عكس هو تسلسل تكميلي العكسي للمنطقة المستهدفة على الحمض النووي القالب.
   2. استخدام اثنين من البناء الجيني ويلديب كقالب الحمض النووي لتفاعلات ير (على سبيل المثال، pUC18 ربود و pUC18 سيغا ). الحصول على اثنين من أجزاء مكملة من كل بناء (pUC18 ربود σ1-σ2، pUC18 ربود σ3-σ4، pUC18 سيغا σ1-σ2، و PUC18 سيغا σ3-σ4) ( الشكل 1 ، الخطوة 6).
   3. تحميل عينات الحمض النووي في هلام الاغاروز 1-1.2٪ [ث / ت]. فصل المنتجات ير من قالب الحمض النووي عن طريق الكهربائي (على سبيل المثال، 110 V لمدة 1 ساعة). بدلا من ذلك، هضم ردود الفعل ير مع دبن الأول لكسر قالب الحمض النووي.
      ملاحظة: دبإنزيم يعترف فقط تسلسل الحمض النووي ميثليته (5'- غاتس-3 ').
      1. تنقية العينات باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي. اتبع إرشادات الشركة الصانعة.
   4. هضم مزدوج جميع شظايا الحمض النووي التكميلية مع الإنزيمات تقييد المناسبة وفقا لاتجاهات الشركة الصانعة. استخدام سريع الهضم إنزيمات تقييد عندما يكون ذلك ممكنا. على سبيل المثال، هضم مزدوج pUC18rpoDσ1-σ2 شظايا الحمض النووي مع أفل الثاني و سب الأول باستخدام بروتوكول الشركة المصنعة. ترك رد فعل الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   5. قم بتعطيل إنزيمات التقييد وفقا لإرشادات الشركة الصانعة. على سبيل المثال، تعطيل أفل II- الكلام I في 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
7. الانتعاش البلازميد باستخدام ربط الحمض النووي والتحول البكتيري.
   1. مزيج شظايا الحمض النووي المناسبة في الحجمي 1: 1 نسبة لتجميع الجين الخيميري المطلوب ( الشكل1، الخطوة 7).
      ملاحظة: بهذه الطريقة، يتم استعادة سلامة الجين أمبر ، إنتاج بروتين وظيفي.
      1. على سبيل المثال، مزيج 4 ميكرولتر من pUC18 ربود σ1-σ2 الحمض النووي (هضمها مع أفل II- الكلام الأول، 150 نانوغرام / ميكرولتر)، 4 ميكرولتر من pUC18 سيغا σ3-σ4 الحمض النووي (أفل II- الكلام الأول، 150 نانوغرام / ميكرولتر) 10 ميكرولتر من العازلة 2X، 2 ميكرولتر من الماء عالى النقاء، و 1 ميكرولتر من T4 الحمض النووي ليغاس. تركيز الحمض النووي بعد عدة تنقية جيدة بما فيه الكفاية لعملية الهضم والربط اللاحق. ترك رد فعل ربط في 25 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   2. تحويل E. القولونية DH5α مع 3-5 ميكرولتر من التجمع رابطة الوهم رد فعل (المواد التكميلية). تنمو الخلايا التحويلية في لوحات لب / أمب / X-غال / إيبت بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
   3. حدد أبيض اللون المحولات E. القولونية المستعمرات وخطوط لهم على لوحة لب / أمبير جديدة. ترك لوحات بين عشية وضحاها في 37° C.
   4. إجراء ير مستعمرة لاختيار المرشحين لتفاعل التسلسل، كما هو موضح في المواد التكميلية. تصور العصابات في 1-1.2٪ (ث / ت) هلام الاغاروز عن طريق أداء الكهربائي (وصفها في الخطوة 2.3.2.1).
   5. تنمو الثقافات من المرشحين الايجابيين. استخراج الحمض النووي البلازميد منها باستخدام مجموعة تنقية الحمض النووي البلازميد.

2. تسلسل المرشح البناء الخيميري

1. تأكد من جودة الحمض النووي البلازميد جيدة بما يكفي لتفاعل التسلسل من خلال اتباع المبادئ التوجيهية من مزود خدمة تسلسل. استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعات تنقية. على سبيل المثال، على صفحة الإنترنت من مزود خدمة تسلسل، وإيلاء اهتمام خاص لتركيز الحمض النووي الموصى بها للعينات. الحصول على تركيز العينات باستخدام أداة الكمي الحمض النووي.
2. تسلسل الانشاءات خيالية مرشح مع مزود خدمة التسلسل ¹⁰ .
3. تجميع سي كونسينغ يقرأ مع في سيليكو الحمض النووي المجمع ¹¹ .
4. محاذاة تجميعها مقابل في تسلسل خيالية سيليكو مصممة باستخدام أدوات محاذاة تسلسل ^{9 ، 12} . تحقق من أن تنصهر الجين الخيميري بنجاح.

3. صنع الاستعدادات

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات التي تنطوي على الخلايا الحية في غطاء تدفق الصفحي نظيفة مع الموقد بنسن جرا.

1. إنتاج E. القولونية خلايا DH5α المختصة.
   1. لإنتاج E. القولونية خلايا -competent، اتبع البروتوكولات المنشورة ¹³ أو رؤية المواد التكميلية . بدلا من ذلك، استخدم الخلايا المختصة المتاحة تجاريا.
2. تحويل E. القولونية خلايا DH5α المختصة.
   1. للتحول الكيميائي للثقافات E. القولونية ، اتبع البروتوكولات المنشورةكلاس = "كريف"> 13 أو راجع المواد التكميلية . بدلا من ذلك، استخدام إليكتروبوراتيون للتحول البكتيري. إذا تم استخدام الخلايا المختصة المتاحة تجاريا، اتبع إرشادات الشركة الصانعة.
3. تنقية الجينوم والبلازميد الحمض النووي من E. القولونية DH5α.
   1. إجراء استخراج الحمض النووي، كما هو مبين في المواد التكميلية ، باستخدام مجموعات متوفرة تجاريا أو بعد البروتوكولات المنشورة ¹³ .
4. أداء ير مستعمرة.
   1. استخدام هذه التقنية لتحديد المستعمرات ترانسفورانت مرشح لتفاعل التسلسل لاحق.
      ملاحظة: هذه الطريقة لا تمثل التحقق النهائي من سلامة تسلسل. ويرد وصف تفصيلي لهذه التقنية في المواد التكميلية .
5. إعداد الحلول.
   1. نرى الجدول 1 لمزيد من المعلومات حول إعداد الحل.
6. تحميل البرامج النصية وتسلسل الملفات المطلوبة لبروتوكول كابريسي.
   1. تحميل ملفات بنك الجينات التي تحتوي على تسلسل الجينوم الكامل من الأنواع المطلوبة، واستخراج تسلسل الحمض النووي للجين المختار باستخدام متصفح الجينوم، وحفظه في شكل ملف فاستا. تحميل البرامج النصية بيرل المطلوبة لبروتوكول كابريسي. قم بتخزين البرامج النصية وملفات التسلسل في نفس الدليل.

النتائج

الشكل 1 يصور كابريسي. باستخدام هذه الطريقة، تم تجميع اثنين من الجينات خيالية عن طريق تبادل مجالات اثنين من العوامل سيغما الأولية البكتيرية ( أي E. القولونية ربود و R. إتلي سيغا). تم الحصول على تسلسل الحمض النووي للجينات ربود و ...

Discussion

تم تصميم كابريسي كبديل ل برم ² . و برم الأصلي هو تقنية قوية. فإنه يسمح لانصهار تسلسل الحمض النووي على طول أي جزء من الجينات المختارة. ل برم، الجينات ويلديب يجب استنساخ في نفس البلازميد. بعد ذلك، تم تصميم أوليغونوكلأوتيدس داخل ويلديب والجينات المقاومة للمض?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity	Thermo Fisher	11304011	Produces a mix of blunt/3’-A overhang ended PCR products
High pure plasmid isolation kit	Roche	11754785001	Used for all plasmid purification reactions
High pure PCR product purification kit	Roche	11732676001	Used for all PCR purification reactions from agarose gels
AflII restriction enzyme	New England Biolabs	R0520L	Recognizes sequence 5’-CTTAAG-3’ and cuts at 37 °C
KpnI-HF restriction enzyme	New England Biolabs	R3142L	Recognizes sequence 5’-GGTACC-3’ and cuts at 37 °C
SpeI-HF restriction enzyme	New England Biolabs	R3133L	Recognizes sequence 5’-ACTAGT-3’ and cuts at 37 °C
XbaI restriction enzyme	New England Biolabs	R0145L	Recognizes sequence 5’-TCTAGA-3’ and cuts at 37 °C
Ampicillin sodium salt	Sigma Aldrich	A0166-5G	Antibiotics
Nalidixic acid	Sigma Aldrich	N8878-5G	Antibiotics
Yeast Extract	Sigma Aldrich	Y1625-1KG	Bacterial cell culture
Casein peptone	Sigma Aldrich	70171-500G	Bacterial cell culture
NaCl	Sigma Aldrich	S9888-1KG	Sodium chloride
Agar	Sigma Aldrich	05040-1KG	Bacterial cell culture
XbaI restriction enzyme	Thermo Fisher	FD0684	Fast digest XbaI enzyme
KpnI restriction enzyme	Thermo Fisher	FD0524	Fast digest KpnI enzyme
Quick Ligation Kit	New England Biolabs	M2200S	Fast DNA ligation kit
AflII restriction enzyme	Thermo Fisher	FD0834	Fast digest AflII enzyme
SpeI restriction enzyme	Thermo Fisher	FD1253	Fast digest SpeI enzyme