في طرق المختبر لمقارنة الهدف وتجليد وCDC التعريفي بين الأجسام المضادة العلاجية: تطبيقات في تحليل Biosimilarity

Summary

يصف هذا البروتوكول المقارنة في المختبر من اثنين من الخصائص الوظيفية الرئيسية لريتوكسيماب: الهدف ملزمة والسمية الخلوية (CDC) الحث تعتمد تكمل. وقد استخدمت أساليب مقارنة جنبا إلى جنب بين ريتوكسيماب مرجعية وبدائل حيوية ريتوكسيماب. هذه المقايسات يمكن استخدامها خلال تطوير بدائل حيوية أو لمراقبة الجودة في إنتاجها.

Abstract

الاجسام المضادة العلاجية (MABS) هي ذات الصلة لعلاج الأمراض المختلفة، بما في ذلك السرطان. تطوير MABS بدائل حيوية من قبل شركات الأدوية هي فرصة السوق، ولكنها أيضا استراتيجية لزيادة إمكانية الوصول المخدرات والحد من التكاليف المرتبطة العلاج. البروتوكولات بالتفصيل هنا تصف تقييم هدف ملزم وCDC تحريض من قبل ريتوكسيماب في الخلايا داودي. تتطلب هذه الوظائف منطقتين هيكلية مختلفة من الأجسام المضادة وهي ذات الصلة الاثر السريري الناجم عن ريتوكسيماب. البروتوكولات تسمح للمقارنة جنبا إلى جنب من ريتوكسيماب مرجعية وبدائل حيوية ريتوكسيماب تسويقها. وأظهرت المنتجات تقييم الاختلافات في كل من هدف ملزم وCDC تحريض، مما يوحي بأن هناك اختلافات الفيزيائية الأساسية وتسليط الضوء على الحاجة إلى تحليل أثر هذه الاختلافات في إعداد سريرية. الأساليب ذكرت هنا تمثل بسيطة وغير مكلفة في المختبر </ em> نماذج لتقييم نشاط البدائل الحيوية ريتوكسيماب. وبالتالي، فإنها يمكن أن تكون مفيدة خلال تطوير بدائل حيوية، فضلا عن مراقبة الجودة في إنتاج بدائل حيوية. وعلاوة على ذلك، وأساليب عرض يمكن استقراء لMABS العلاجية الأخرى.

Introduction

الأجسام المضادة العلاجية هي الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المؤتلف (مابس) وضعت لعلاج أمراض مختلفة، بما في ذلك السرطان، المناعة الذاتية والأمراض المزمنة، واضطرابات عصبية، وغيرها ¹ . حاليا، وافقت ادارة الاغذية والعقاقير الموافقة على أكثر من 40 مابس العلاجية، وأكثر من المتوقع أن تصل إلى السوق في السنوات التالية.

ريتوكسيماب هو عالية تقارب خيالية أحادي النسيلة IgG1 الأجسام المضادة المعتمدة لعلاج CD20 ⁺ B خلية سرطان الغدد الليمفاوية غير هودجكين (نهل)، CD20 ⁺ نهل الجريبي، سرطان الدم الليمفاوي المزمن، والتهاب المفاصل الروماتويدي ^{2 ، 3} . الاعتراف CD20، أوفيركسرسد في الخلايا ب، من قبل ريتوكسيماب يدفع موت الخلايا المبرمج. تكملة التنشيط؛ والخلايا التي تعتمد على الأجسام المضادة السمية الخلوية (أدسك) ³ . براءات الاختراع من هذا الدواء انتهت في أوروبا والولايات المتحدة في 2013 و 2016على التوالي. وهكذا، شركات الأدوية في جميع أنحاء العالم على تطوير البدائل الحيوية ريتوكسيماب. كما هو الحال في أي عقار آخر للاستهلاك البشري، البدائل الحيوية تتطلب موافقة من الهيئات التنظيمية. وتشير المبادئ التوجيهية الدولية التي لMABS، يجب أن يظهر biosimilarity بمقارنة خصائص الفيزيائية، الدوائية، فعالية، وسلامة المنتجات الجديدة والمرجعية ^4.

وفقا لذلك، يجب على المنهجيات المستخدمة في مثل هذه المقارنات تقييم الخصائص الهيكلية والوظيفية للMABS، وخاصة تلك التي لها صلة السريرية. تحقيقا لهذه الغاية، فحوصات في المختبر تظهر العديد من المزايا في التجارب المجراة (إعادة النظر في تشابمان وآخرون.) ^5: أ) في الدراسات المختبرية هي أكثر حساسية للاختلافات بين المنتج بدائل حيوية والإشارة المقترحة؛ ب) الدراسات المجراة يجب أن يؤديها في الأنواع ذات الصلة، والتي لكثير من MABS لالرئيسيات غير البشرية. والثالث) منذ آلية العمل، وعلم السموم قبل السريرية، والآثار السريرية من الناتج إشارة معروفة، الدراسات المجراة مع البدائل الحيوية قد لا توفر معلومات إضافية مفيدة. وفقا لذلك، توجيه الاتحاد الأوروبي لالبدائل الحيوية يسمح المرشحين لدخول التجارب السريرية على أساس قوي في بيانات المختبر وحده ^6.

هنا، نقدم اثنين من فحوصات سريعة واقتصادية وبسيطة أن تقييم النشاط البيولوجي للريتوكسيماب باستخدام CD20 ⁺ الخلايا المستزرعة. يمكن تضمين هذه المقايسات كجزء من ممارسة المقارنة للمرشحين بدائل حيوية ريتوكسيماب.

Protocol

1. تقييم الهدف ربط بواسطة التدفق الخلوي

1. إعداد المواد البيولوجية والكواشف
   1. جعل 500 مل من وسط ثقافة رمي تستكمل مع 10٪ مصل الدم البقري الجنين المعطل (H-إفبس).
   2. ثقافة داودي بوركيت خلايا الغدد الليمفاوية (داودي) وخلايا دودي غفب ⁺ باستخدام رمي و 75 سم ² قوارير الثقافة. الحفاظ على الثقافات في 37 درجة مئوية في 5٪ كو ₂ جو مرطب حتى تصل إلى 6 - 9 × 10 ⁵ خلايا / مل.
   3. جعل 50 مل من تلطيخ العازلة عن طريق تمييع 1/100 H- إيفس في برنامج تلفزيوني. هذا العازلة مستقرة في 2-8 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
   4. إعداد حلول الاختبار للمرجعية و مبس مشابهة. جعل عشرة 1: 2 التخفيفات المسلسل (500 ميكرولتر لكل منهما) في العازلة تلطيخ، بدءا من 5 ميكروغرام / مل.
   5. استخدام العازلة تلطيخ لتخفيف إيغ الإنسان (السيطرة إيزوتيب) إلى 5 ميكروغرام / مل و بي-Cy5 الماوس إيغ لمكافحة الإنسان (الأجسام المضادة الثانوية) إلى يخدعوحدانية التركيز المقترح من قبل المصنع.
   6. إعداد بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني (عازلة التثبيت).
2. هدف ملزم
   1. جمع داودي وتعليق خلية داودي GFP ⁺ من قوارير ثقافة 75 سم ² ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
   2. غسل الخلايا بإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي تعليق خلية في 400 x ج لمدة 5 دقائق.
   3. Resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني وإجراء تعداد خلايا وتحليل الجدوى مع الأزرق التريبان. استخدام الثقافات مع مستويات بقاء الخلية ≥ 95٪ للتحليل.
   4. تمييع تعليق خلية إلى 4 × 10 ⁶ خلية / مل مع العازلة تلطيخ الباردة.
   5. في أنابيب microcentrifuge 1.5 مل، إضافة 50 ميكرولتر من تعليق خلية إلى 100 ميكرولتر من تركيزات مختلفة من اختبار الإشارة أو MABS بدائل حيوية. تشمل مكررات لكل حالة تجريبية.
   6. إعداد أنابيب إضافية ل(IGG1 الإنسان بدلا من ريتوكسيماب) والسيطرة السلبية (الأجسام المضادة الثانوية دون الأجسام المضادة الأولية).
   7. احتضان في 4 درجات مئوية لمدة 20 - 30 دقيقة.
   8. غسل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي تعليق الخلية في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 10 درجة مئوية. تجاهل طاف.
   9. تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية واحتضان لمدة 20 - 30 دقيقة في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء.
   10. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني وتعليقها في 200 ميكرولتر من العازلة التثبيت.
   11. تحليل الخلايا على مقياس التدفق الخلوي.
       ملاحظة: تظل إشارة مستقرة لعدة أيام إذا تم تخزين العينات في 4 درجات مئوية ومحمية من الضوء.
3. الحصول على البيانات
   1. فتح اثنين من النقاط المؤامرة على ورقة عمل من برنامج تشغيل التدفق الخلوي. تعيين فسك-A مقابل فسك-H في الأولى و فسك-A مقابل سا-A في الثانية. افتح مخطط بياني لقناة بي-Cy5.
   2. في FSC-A مقابل FSC-H مؤامرة، وجعل باب (R1) اختيار الأحداث القميص (الشكل 1A).
   3. تعيين السكان R1 في FSC-A مقابل SSA-A دوت مؤامرة ثم جعل بوابة جديدة (R2) تحديد الخلايا المستهدفة (الشكل 1B). تعيين السكان R2 في الرسم البياني PE-Cy5 كثافة لعرض توزيع تردد من الخلايا.
   4. ضبط حد أدنى كثافة مضان (FI) للقناة PE-Cy5 باستخدام السيطرة السلبية ونمط إسوي (الشكل 1C).
   5. الحصول على 10000 الأحداث داخل R2 من العينة مع تركيز أعلى من الناتج إشارة. وينبغي أن يكون FI من هذه العينة أعلى من المتوقع (الشكل 1C).
   6. الحصول على بقية العينات.
   7. لكل عينة، احصل على كثافة مضان متوسط ​​(MFI) في قناة PE-Cy5.
   8. للعينات مع الإشارة أو بدائل حيوية ماب، حساب الفرق بين عينة مؤسسات التمويل الأصغر وذلك من isotype السيطرة (ΔMFI).

2. تقييم CDC

1. إعداد المواد البيولوجية والكواشف
   1. إعداد الخلايا خلية ثقافة متوسطة والثقافة داودي وداودي GFP ⁺ كما هو موضح أعلاه (الخطوات 1.1.1 - 1.1.2).
      ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، فحص CDC يتطلب RPMI المصل خالية.
   2. تمييع العادي تكملة المصل البشري (NHSC) 1: 2 مع خالية من المصل RPMI. إعداد 2.5 مل.
   3. إعداد 1 مل من الحرارة المعطل (30 دقيقة / 56 ° C) NHSC المخفف 1: 2 مع RPMI.
   4. إعداد مجموعة من الاختبارات حلول للمرجعية وMABS بدائل حيوية في RPMI المصل خالية. إجراء عشر التخفيفات (200 ميكرولتر لكل منهما) 1-،025 ميكروغرام / مل.
2. CDC فحص
   1. جمع الخلايا داودي وداودي GFP ⁺ من الثقافات وتحديد بقاء الخلية (انظر الخطوات 1.2.1 - 1.2.3).
   2. إعداد تعليق الخلية مع 4 × 10 ⁵ خلية / مل في RPMI المصل خالية.
   3. إضافة50 ميكرولتر من تعليق خلية إلى 50 ميكرولتر من كل مرجع أو بيوسيميلار تركيز تركيز ماب في 96-جيدا مخروطي (V) -الفلتر الصغير. تضمين النسخ المتماثلة لكل حالة تجريبية.
   4. إعداد آبار إضافية للسيطرة السلبية ( أي بدون ماب)، والسيطرة على الموت القاعدية ( أي الحرارة معطل نهسك في وجود ماب)، وتلطيخ السيطرة الإيجابية ( أي الخلايا المعرضة ل 50 ميكرولتر من إتوه 70٪).
   5. احتضان الخلايا لمدة 20 - 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في 5٪ كو ₂ جو مرطب.
   6. إضافة 50 ميكرولتر من نسك (المخفف 1: 2) إلى كل بئر واحتضان الخلايا أوبوسونيزد لمدة 2.5 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو 2٪ ترطيب كو ₂ ٪. استخدام الحرارة المعطلة نهسك في الآبار القاعدية لمراقبة الموت.
   7. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 5 دقائق في 10 درجة مئوية. تجاهل طاف.
   8. غسل الخلايا عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني والطرد المركزي تعليق الخلية لمدة 5 دقائق في 400 x ج و 10 درجة مئوية. ديscard طاف.
   9. وصمة عار على عينات مع 7-aminoactinomycin (7-AAD)، كما هو موضح سابقا ^{7 و 8.}
   10. تحليل الخلايا على عداد الكريات تدفق في نفس اليوم.
3. الحصول على البيانات
   1. فتح اثنين الدوت المؤامرات على ورقة عمل لقياس التدفق الخلوي برنامج التشغيل. وضع هذه المؤامرات كما في الخطوات 1.3.1 - 1.3.3 (الشكل 2A-B). إنشاء مؤامرة الثالثة التي هي مؤامرة نقطة لGFP مقابل 7-AAD على السكان R2.
   2. تعريف حدود FI كافية باستخدام خلايا داودي، داودي GFP ⁺ الخلايا، ومراقبة إيجابية الموت (الشكل 2C).
   3. لكل عينة، وقياس النسبة المئوية للخلايا 7-AAD ⁺ الهدف. الحصول على ما لا يقل عن 5000 من الأحداث R2.
   4. حساب سمية الخلايا المحددة الناجمة عن ماب-بطرح نسبة 7-AAD ⁺ في السيطرة الموت القاعدية من نسبة جدت في عينات مع تختلفوتركيزات إنت من مابس ( الشكل 2D ).

3. تحليل بيوسيماليتي

1. أدخل قيم التركيز والاستجابة في برنامج رسوم بيانية.
2. توليد الرسوم البيانية وحساب الانحدارات غير الخطية مع الاعتبارات التالية: 1) استخدام سجل التحول من تركيز ماب كما "X". 2) استخدام النموذج الرياضي المنحدر المتغير (Y = الحد الأدنى من الاستجابة + (الاستجابة القصوى - الحد الأدنى من الاستجابة) / 1 + 10 ^ ((لوجيك ₅₀ -X) * منحدر هيل))؛ و 3) تقييد القيم السفلية إلى الصفر، حيث تم طرح الاستجابة القاعدية.
   ملاحظة: ومن المتوقع المنحنيات مع شكل سيني متناظرة.
3. قارن كل من غير الخطية يناسب مع تناسب عالمي باستخدام اختبار F (العديد من برامج الرسوم البيانية وتشمل هذه الميزة).
   ملاحظة: هذه الاختبارات تنص على فرضية نول أن الاستجابة القصوى، لوجيك ₅₀ ، ومنحدر هيل هي نفسها لمجموعتي البيانات، والذي يطابقمسألة بيولوجية يعتزم معالجتها.

النتائج

باستخدام البروتوكولات المذكورة أعلاه، تستهدف ملزمة وتمت مقارنة تحريض CDC ريتوكسيماب إشارة بالتوازي مع تلك ريتوكسيماب بدائل حيوية تنتج ومتاحة تجاريا في آسيا.

في الخلايا داودي، سواء MABS ملزمة CD20 ...

Discussion

إن انتهاء صلاحية براءة اختراع ماب العلاجي هو تشجيع تطوير بيوسيميالز. وبالتالي، هناك حاجة إلى أساليب بسيطة يمكن أن تحدد الاختلافات في الأنشطة ذات الصلة سريريا من هذه المنتجات. تم استخدام CD20 ⁺ الخلايا المستزرعة لتقييم اثنين من الخصائص الوظيفية الرئيسية لل ريتوك?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Modify the culture depending on the cell line
Trypan Blue solution	Sigma	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	You can modify the cell line depending on the antibody of interest
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	16000-044	You can modify the source of serum depending of requirements of the cell line
Normal Human Serum Complement	Quidel	A113	It is therefore appropriate for use in biocompatibility experiments including drug development, biomaterials testing and other applications
7AA-D	BDPharmigen	559925	You can use broad range of color options, compatible with most instrument configurations for to analyze viability.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Change fluorochrome depending on the filter and laser of your flow cytometer
Human IgG Isotype Control	ThermoFisher Scientific	07-7102	Change depending to mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Flow Cytometry Fixation Buffer (1 - 4% formaldehyde or paraformaldehyde )
PBS pH 7.4 10x (Phosphate buffer saline)	GIBCO	70011-044	Phosphatebuffer without Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1.46 mM KH2PO4] and endotoxin free.
Cell culture plates 96 well, V-bottom	Corning	29442-068	12 x 75 mm round bottom test tubes or 96-well V- or U-bottom microtiter plates
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Reference product
Rituximab	Indian	—	Biosimilar product
15- or 50-mL conical centrifuge tubes	Corning	430290 or 430052	—
Pipette Tips	Eppendorf	—	Multiple volume configurations are necessary
Pipettes	Eppendorf	—	Adjustable-volume pipettes are necessary
Centrifuge 5430/ 5430R model	Eppendorf	—	Refrigerated variable-speed centrifuge (4 to 25 °C) with speeds ranging from 10 to 30,130 × g
Flow cytometer	BD Dickinson	—	BD FACSAria III or other flow cytometer
Olympus optical and light microscope	Olympus	—	To quantify and evaluate cell growth
Incubator	SANYO	—	Incubatorfor temperature and CO2 control to culture cells
Biological Safety Cabinet	CHC BIOLUS	—	Biological safety cabinet that is used to protect the researcher, product and environment.