الصغيرة RNA ترنسفكأيشن في الخلايا الأولية Th17 الإنسان من قبل الجيل القادم Electroporation لل

Summary

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

Abstract

CD4⁺ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from naïve CD4⁺ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1β, IL-6, IL-23, and TGFβ. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, RORγt, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Introduction

خلايا CD4 ⁺ T هي منسقين حاسم للاستجابة المناعية التكيفية. السذاجة خلايا CD4 ⁺ T قادرة على التطور إلى عدة خلايا التائية المستجيب مختلفة (على سبيل المثال TH1، TH2، Th17، وما إلى ذلك)، ولكل منها مجموعة خاصة بهم من السيتوكينات المميزة وعوامل النسخ، وهذا يتوقف على المكروية المحلية ^1. القرارات النسب التي تجعل خلايا T حاسمة لكلا مناعة وقائية والتسامح في تقرير المصير. خلايا Th17 هي مجموعة فرعية واحدة من خلايا T المعروف لمكافحة البكتيريا خارج الخلية والفطريات، ولكن وتورط ردودهم غير لائقة أيضا في التسبب في أمراض المناعة الذاتية والتهابات متعددة مثل التصلب المتعدد والصدفية ^{2 و 3.} خلايا Th17 الإنسان يمكن أن تتولد من خلايا CD4 ⁺ T ساذجة في المختبر عن طريق تزويدهم بيئة الاستقطاب المناسبة ^4. فاريو لنا مزيج من السيتوكينات IL-1β، IL-23، وقد استخدمت TGFβ، وIL-6 لتطوير خلايا Th17 الإنسان. خلايا Th17 الإنسان تعبر عن CCR6، مستقبلات chemokine التي يشيع استخدامها لتحديد هذه الفئة من السكان الخلية ويتم تحديدها من خلال التعبير عن عامل من النسخ الرئيسي، RORγt (المشفرة بواسطة RORC) ^{5، 6.} خلايا Th17 لديها القدرة على التعبير عن السيتوكينات متعددة، ولكن IL-17A هو المستجيب خلوى-تحديد النسب التي تنتجها هذه الخلايا. درسنا التعبير عن كل علامات المصاحب Th17 الثلاثة (CCR6، RORγt، IL-17A) لتقييم متانة لدينا البشري Th17 في المختبر التمايز الفحص. بالإضافة إلى ذلك، نحن مثقف خلايا CD4 ⁺ T البشر في ظل ظروف غير الاستقطاب، حيث تم إضافة أي السيتوكينات أو الأجسام المضادة ومنع وسائل الإعلام ثقافة لاستخدامه كقاعدة سيطرة سلبية منذ تعبير عن هذه العلامات Th17 يجب أن تكون منخفضة جدا أو غير موجودة.

ve_content "> طريقة واحدة لدراسة طبيعية تطوير خلية T الإنسان وعلم الأحياء هو التلاعب التعبير الجيني خلال تنميتها. قصيرة التدخل RNA (سيرنا) هي الاصطناعية جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة التي تستهدف من mRNAs تشفير البروتين ويمكن استخدامها للحد من التعبير الجيني المحدد . MicroRNAs (miRNAs) هي الذاتية غير الترميز الرنا الصغيرة المعروفة لتعديل التعبير الجيني آخر ما بعد transcriptionally. وقد ثبت miRNAs للعب دورا هاما في كل من الفئران وبيولوجيا الخلايا T الإنسان، بما في ذلك خلايا Th17 ^{7، 8، 9،} و أمر حاسم لدينا وسائل موثوق بها من التلاعب النشاط RNA الصغيرة في خلايا T الإنسان لدراسة آثارها على التعبير الجيني وفي نهاية المطاف على بيولوجيا الخلايا T البشري. هنا، نحن تصف بروتوكول سهل الاستخدام، بما يتفق وموثوق بها التي قمنا بتطويرها لإدخال الرنا صغيرة الاصطناعية والأحماض النووية مقفل (LNAs، تعديل كيميائيا الأحماض النووية مع زيادة الاستقرار)في الخلايا المناعية، وعلى وجه التحديد إلى خلايا Th17 الإنسان.

هناك عدة طرق بديلة لإدخال الرنا صغيرة في خلايا الثدييات، التي تقع عادة في فئات الكيميائية والبيولوجية، أو الفيزيائية ^(10). الطرق الكيميائية التي يشيع استخدامها، بما في ذلك تعداء القائم على الدهون وتعداء الكالسيوم فوسفات، تعتمد على خلق المجمعات الكيميائية DNA التي تؤخذ بشكل أكثر كفاءة من قبل الخلايا. بشكل عام، الطرق الكيميائية ليست كما فعالة لترنسفكأيشن من خلايا T الابتدائية. طريقة البيولوجي الأكثر شيوعا هو استخدام ناقلات فيروسية (مثل الفيروس الارتجاعي أو الفيروسة البطيئة)، الذي يدرج مباشرة RNA الأجانب إلى مجموعة كجزء من دورة تكرار الطبيعية. تنبيغ الفيروسية عادة ما يستغرق وقتا أطول لاستكمال، وخصوصا عندما العوامل واحد في الوقت المناسب لاستنساخ الجزيئي للالبلازميدات proviral. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للناقلات تنبيغ الفيروسية يحتمل أن تكون ضارة للباحثين البشري. Electroporation للهو م البدنيethod على إحداث غشاء permeabilization بإخضاع الخلايا لنبضات الجهد العالي، مما يسمح الأحماض النووية لدخول عابر في الخلية حيث يمكن أن تعمل على هدفهم. وكانت الأدوات Electroporation للالتقليدية غير فعالة لtransfecting الخلايا الليمفاوية الأولية. ومع ذلك، فقد ثبت الأمثل Electroporation للجيل القادم لتكون قادرة على transfecting خلايا T في كفاءة عالية جدا، وخصوصا عندما المواد التي سيتم transfected هو RNA الصغيرة. يستخدم الجيل القادم مصطلح فضفاض إلى التفريق بين أحدث منصات (على سبيل المثال، النيون، Amaxa) من آلات Electroporation للالتقليدية. بالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة قابلة بسهولة للشاشات الإنتاجية المعتدلة مع ما يصل إلى ما يقرب من 120 الرنا صغيرة في تجربة واحدة، وغالبا ما تستخدم المواد الكيميائية الاصطناعية التحقق من صحتها. الأهم من ذلك، تعداء الناجح لا يمكن أن يتحقق في اقل من 16 ساعة بعد تفعيل الخلايا التائية. وعيب هذه الطريقة، ومع ذلك، هو أنه لا يؤدي إلى incorporati الجينومية مستقرةعلى، وبالتالي فهو عابر. وبالتالي، فإن الأمر يستحق مزيدا من الجهد لخلق بناء التعبير مستقرة والتي يمكن تعبئتها في ناقلات فيروسية وأعرب بنجاح في خلايا T في الحالات التي تتطلب التعبير على المدى الطويل من الحمض النووي الريبي الصغيرة.

لقد استخدمت ترنسفكأيشن الجيل القادم (على سبيل المثال، النيون) لتسليم متنوعة RNA أو قليل النوكليوتيد LNA أدوات احدة أو المزدوج تقطعت بهم السبل الاصطناعية لأغراض مختلفة ^{11 و 12 و 13.} تدخل RNA كفاءة يمكن أن يتسبب في الماوس الأساسي وخلايا T الإنسان باستخدام RNA المزدوج تقطعت بهم السبل التدخل القصير (سيرنا). يصف هذا البروتوكول الظروف الأمثل لاستخدام هذه التقنية في خلايا Th17 الإنسان. بالإضافة إلى الرناوات siRNAs، وهي متاحة تجاريا يحاكي ميرنا الاصطناعية ومثبطات يمكن استخدامها لدراسة مكاسب ميرنا وفقدان الوظيفة. يحاكي ميرنا هي المزدوج تقطعت بهم السبل جزيئات الحمض النووي الريبي مشابهة جدا لالرناوات siRNAs، ولكن المصممد مع تسلسل miRNAs ناضجة الذاتية. مثبطات ميرنا وكيميائيا تعديل-RNA و / أو LNA أساس أليغنوكليوتيد واحدة الذين تقطعت بهم السبل التي تربط لmiRNAs الأم واستعداء وظيفتها. لقد وجدنا أن جميع هذه الأدوات يمكن استخدامها بشكل فعال في الخلايا الليمفاوية T الأساسي مثقف، بما في ذلك ولكن لا تقتصر على خلايا Th17 الإنسان.

Protocol

يلتزم هذا البروتوكول إلى المبادئ التوجيهية UCSF لأخلاقيات البحث الإنسان.

1. إعداد T الثقافة الخليوي، عزل خلايا CD4 ⁺ T، وTh17 الاستقطاب

1. في اليوم 0، معطف 6-جيدا لوحات زراعة الأنسجة مع 1.5 مل لكل بئر من مكافحة الإنسان CD3 (2 ميكروغرام / مل) وCD28 مكافحة الإنسان (4 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة 2 ساعة على الأقل في 37 ° C.
   1. بدلا من ذلك، معطف لوحات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. التفاف لوحات في بارافيلم.
2. إعداد الخلايا وحيدة النواة دم الحبل السري (CBMCs) من خلال التدرج الكثافة الطرد المركزي في تعليمات الشركة الصانعة.
   تنبيه: العمل بعناية وضمان معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE) يتم ارتداؤها عند التعامل مع الدم البشري لتجنب أي خطر من التعرض لمسببات الأمراض التي تنتقل عن طريق الدم.
3. مرة واحدة وقد تم عزل الخلايا وحيدة النواة وغسلها، نفذ الإنسان CD4 ⁺ T العزلة الخلية سيلي السلبيةction استخدام عدة خلايا CD4 ⁺ T الإنسان التجارية.
   ملاحظة: إذا كان هناك أحمر تلوث خلايا الدم بعد عزل الخلايا وحيدة النواة، يمكن إجراء اختياري الأحمر تحلل خلايا الدم قبل الخطوات عزل خلايا CD4 ⁺ T. Resuspend الخلايا وحيدة النواة في 1 مل من العازلة العزلة (2٪ FBS في PBS). إضافة 5 مل من 1X حل الناشر. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم يضاف 5 مل من العازلة العزل والطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لخلايا بيليه.
   1. Resuspend الخلايا وحيدة النواة في مناطق ذات كثافة من 50 × 10 ⁶ في 500 ميكرولتر في المخزن المؤقت العزلة في جديد 5 مل أنبوب.
   2. إضافة 100 ميكرولتر من FBS و 100 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة في أنبوب ثم احتضان كل أنبوب في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على شاكر المداري لتخلط جيدا.
   3. بعد الحضانة، إضافة 3-4 مل من العازلة العزلة لغسل الخلايا. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 8 دقائق في 4 درجات مئوية لخلايا بيليه. نضح بعناية سوبrnatant.
   4. أثناء هذا الدوران، قبل غسل حبات مغناطيسية. تحويل المبلغ المطلوب من حبات مغناطيسية في أنبوب جديد (المستخدمة في 1: 1 مع الخلايا) وإضافة حجم مساو من العازلة العزلة لتغسل حبات. تخلط جيدا باستخدام micropipette 1 مل ثم وضع أنبوب في المغناطيس لا يقل عن 1 دقيقة. نضح بعناية طاف. إعادة تعليق الخرز المغناطيسي في نفس حجم نقل في البداية قبل الغسيل.
   5. إعادة تعليق الخلايا في كل أنبوب مع 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت العزلة وإضافة 500 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي قبل غسلها.
   6. احتضان الخلايا مع حبات مغناطيسية لمدة 15 دقيقة على شاكر المداري في درجة حرارة الغرفة (18 ° C إلى 25 ° C) إلى المزيج جيدا.
   7. بعد الحضانة، الماصة بدقة الخلايا باستخدام micropipette 1 مل 10 مرات على الأقل. ثم إضافة 3-4 مل من العازلة العزل ووضع كل أنبوب في المغناطيس لمدة 2 دقيقة.
   8. بعناية نقل الخلايا CD4 ⁺ T مختارة سلبا التي هي فيطاف لأنبوب جديد.
4. بمجرد الانتهاء من CD4 ⁺ T العزلة الخلية، عد الخلايا مع عدادة الكريات والحفاظ على الخلايا على الجليد.
5. تغسل الصحون المغلفة الأجسام المضادة مرتين مع برنامج تلفزيوني. ثم يضاف 1.5 مل من 2X مزيج من Th17-استقطاب وسائل الإعلام إلى كل بئر: IFNγ مكافحة الإنسان (20 ميكروغرام / مل)، ومكافحة البشري IL-4 (20 ميكروغرام / مل)، والإنسان TGFβ (10 نانوغرام / مل) والبشرية IL-1β (40 نانوغرام / مل)، والإنسان IL-23 (40 نانوغرام / مل)، والإنسان IL-6 (50 نانوغرام / مل) كل تضعف في وسائل الإعلام قاعدة خالية من المصل (تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 10 ملي HEPES، 1 ملم الصوديوم البيروفات و 100 ميكرومتر 2-المركابتويثانول).
   ملاحظة: ترنسفكأيشن والتدخل RNA يفعل العمل في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل. الغرض من استخدام وسائل الإعلام الحرة المصل مع هذا البروتوكول هو تحقيق أفضل إنتاج IL-17A.
6. الطرد المركزي الخلايا CD4 ⁺ T الإنسان في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لتكوير الخلايا. نضح بعناية supernatالنمل. ثم resuspend الخلايا في وسائل الإعلام قاعدة خالية من المصل ولوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 3 × 10 ⁶ في 1.5 مل لكل بئر بحيث الحجم النهائي هو 3 مل لكل بئر والسيتوكينات استقطاب الآن بتركيز نهائي 1X.
   1. وضع لوحات في 5٪ CO _2، 37 ° C الحاضنة لمدة يومين.

2. خلايا Electroporation للفي المختبر الاستقطاب Th17 الإنسان

1. في يوم 2، ومعطف 48-جيدا لوحات زراعة الأنسجة مع 250 ميكرولتر لكل بئر من مكافحة الإنسان CD3 (2 ميكروغرام / مل) وCD28 مكافحة الإنسان (4 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم والمغنيسيوم لمدة 2 ساعة على الأقل في 37 ° C.
   1. بدلا من ذلك، معطف لوحات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. التفاف لوحات في بارافيلم.
2. إعداد الرنا صغيرة لترنسفكأيشن. لكل ترنسفكأيشن، قسامة 1 ميكرولتر من 5 ميكرومتر حل سهم سيرنا في أنبوب مل microcentrifuge 1.5. تشمل المناسب المطابقة الكيمياء صغير مقاولات RNAرأ. منع جميع أنابيب على الجليد.
3. تغسل الصحون المغلفة الأجسام المضادة مرتين مع برنامج تلفزيوني. ثم إضافة 500 ميكرولتر من 1X Th17-استقطاب وسائل الإعلام إلى كل بئر: IFNγ مكافحة الإنسان (10 ميكروغرام / مل)، ومكافحة البشري IL-4 (10 ميكروغرام / مل)، TGFβ البشري (5 نانوغرام / مل)، ايل الإنسان 1β (20 نانوغرام / مل)، والإنسان IL-23 (20 نانوغرام / مل)، والإنسان IL-6 (25 نانوغرام / مل) كل تضعف في وسائل الإعلام قاعدة خالية من المصل (تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 10 ملي HEPES، 1 ملم البيروفات الصوديوم و 100 ميكرومتر 2-المركابتويثانول).
4. بعد إعداد لوحات ثقافة والكواشف ترنسفكأيشن، resuspend الخلايا مع 1 مل micropipette، pipetting بلطف ولكن التأكد من أن جميع الخلايا وفصل من الجزء السفلي من الآبار. تجميع خلايا في أنبوب مخروطي الشكل والطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: للحصول على فترات أطول من ثقافة البروتوكول لمدة أربعة أيام المقدمة هنا، ينبغي transfected الخلايا تقريبا كل 3 أيام باستخدام هذا البروتوكول نفسه. الخطوة 20.4 يجب أن يتم تعديل ذلك منذ الخلايا تعامل مع الرنا صغيرة مختلفة لا ينبغي المجمعة. جميع الشروط التي يجري اختبارها يجب جمعها وعدها، وtransfected بشكل منفصل.
5. نضح بعناية طاف، ومن ثم إعادة تعليق الخلايا في لا يقل عن 1 مل من برنامج تلفزيوني لغسل. عد الخلايا الحية Th17 (على سبيل المثال مع عدادة الكريات باستخدام استبعاد التريبان الأزرق لتقييم جدوى) ثم نقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge.
6. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لخلايا بيليه.
7. نضح بعناية طاف، ومن ثم إعادة تعليق الخلايا باستخدام المخزن المؤقت إعادة تعليق المقدمة من عدة ميكرولتر نظام ترنسفكأيشن 10 في مناطق ذات كثافة من 2،5-4 × 10 ⁷ خلايا لكل مليلتر. حفاظ على الخلايا في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: كما توجيهي، في محاولة لإعداد فقط العديد من الخلايا كما يمكن transfected في غضون 30 دقيقة. ويمكن مقارنة دفعات متعددة.
8. إضافة 9 ميكرولتر من الخلايا إلى 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الصغيرة في كل microcأنبوب entrifuge. الماصة مرة واحدة لمزج الخلايا والرنا صغيرة لترنسفكأيشن ثم تحميل في المقدمة طرف ماصة الكهربائي.
   ملاحظة: عادة، إضافة 9.5 ميكرولتر من تعليق خلية لضمان وجود ما يكفي من الخليط لمنع خلق فقاعات في الماصة القطب غيض قبل ترنسفكأيشن.
9. ملء كفيت المقدمة مع 3 مل من درجة حرارة الغرفة العازلة كهربائيا E. مكان كفيت داخل محطة ماصة ثم ضع ماصة في الموقف داخل كفيت.
10. على الفور electroporate كل مزيج 10 ميكرولتر من الخلايا والحمض النووي الريبي الصغيرة باستخدام المعلمات التالية: نبض الجهد 1،500-1،550 V، عرض النبض 10 مللي، ومجموع 3 البقول على الجهاز ترنسفكأيشن.
11. بعد Electroporation للاكتمال، إضافة مباشر على خليط الخلية إلى 500 ميكرولتر من 1X Th17-استقطاب وسائل الإعلام في الآبار المعدة لوحة الثقافة. لوحات مكان في 5٪ CO _2، 37 ° C الحاضنة لمدة يومين آخرين.
    ملاحظة: غسل طرف ماصة الكهربائي من قبل pipettingصعودا وهبوطا في برنامج تلفزيوني بين كل ترنسفكأيشن.

3. خلايا حصاد Th17 الإنسان

1. Resuspend الخلايا في وسائل الإعلام والثقافة مع micropipette، pipetting بلطف ولكن التأكد من أن جميع الخلايا وفصل من الجزء السفلي من الآبار. إعداد الخلايا لفحوصات التعبير وظيفية و / أو الجينات.
   ملاحظة: بشكل روتيني، وحقق ما يكفي من الخلايا من بئر واحدة من خلايا Th17 transfected لاستخدامها لتحليل تدفق cytometric من علامة السطحية والخلايا خلوى وعامل النسخ تلطيخ أو لإعداد RNA لتحليل التعبير الجيني.

النتائج

وكانت الخطوة الأولى لوضع نظام فعال للelectroporating خلايا Th17 الإنسان بنجاح لتوليد قوة في المختبر متباينة الثقافات خلية Th17 الإنسان. أعربت T الخلايا المستزرعة تحت ظروف Th17-استقطاب مستقبلات chemokine CCR6 وعامل النسخ RORγt (الشكل 1A، يسار). لم التعبير عن ?...

Discussion

يوفر هذا البروتوكول وسيلة إيجابية للتسليم الرنا صغيرة إلى خلايا Th17 الإنسان. رغم استخدام خلايا Th17 الإنسان هنا، وهذه الطريقة من Electroporation للمع الرنا صغيرة يمكن استخدامها مع غيرها من مجموعات فرعية المساعد الإنسان الأساسي T، مثل TH1، TH2، وTregs. لم يعمل جيدا لخلايا CD4 ⁺ T ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-human IL-17A PE	ebioscience	12-7179-42	Clone: eBio64DEC17
anti-human IFNg FITC	ebioscience	11-7319-82	Clone: 4S.B3
anti-human CD4 eVolve605	ebioscience	83-0047-42	Clone: SK3
mouse anti-human CD196 (CCR6) BV421	BD biosciences	562515	Clone: 11A9
anti-human RORgt AF647	BD biosciences	563620	Clone: Q21-559
anti-human CD45 eFluor450	ebioscience	48-9459-42	Clone: 2D1
Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set	ebioscience	00-5523-00	For intracellular transcription factor flow cytometry staining
Hu FcR Binding Inhibitor Purified	ebioscience	14-9161-71
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium	Stemcell Technologies	10981	"Serum-Free Base Media"
MACS CD28 pure functional grade, human	Miltenyi Biotec	130-093-375	Clone: 15E8
anti-human CD3 Purified	UCSF monoclonal antibody core	N/A	Clone: OKT-3
LEAF purified anti-human IL-4	Biolegend	500815	Clone: MP4-25D2
anti-human IFNg, functional grade purified	ebioscience	16-7318-85	Clone: NIB42
Recombinant human IL-23	Peprotech	200-23
Recombinant human IL-1β	Peprotech	200-01B
Recombinant human TGF-β1	Peprotech	100-21C
Recombinant human IL-6	Peprotech	200-06
siGENOME Control Pool, Non-targeting #2	Dharmacon	D-001206-14-05
siGENOME SMARTpool Human RORC	Dharmacon	M-003442-00
siGENOME SMARTpool Human PTPRC	Dharmacon	M-008067-01
Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit	ThermoFisher Scientific	11346D	Human CD4+ T cell Isolation Kit
Neon Tranfection System	ThermoFisher Scientific	MPK5000	Next generation electroporation instrument
Neon Tranfection System 10 μL Kit	ThermoFisher Scientific	MPK1096
Resuspension Buffer T	ThermoFisher Scientific	Provided in kit (MPK1096)	"Transfection Resuspension Buffer"
Lymphoprep	Stemcell Technologies	#07801	Density Gradient Medium
costar 6-well tissue culture treated plates	Corning	3516	flat bottom plates
costar 48-well tissue culture treated plates	Corning	3548	flat bottom plates
BD Pharm Lyse lysing buffer, 10x	BD biosciences	555899	Must make 1x solution with distilled water prior to use