حبة المزدوجة والصفيف المغناطيس لصب ميكروويلس مع الهندسات مقعرة متغير

Summary

ويدخل هذا المخطوط وسيلة قوية لاختلاق مقعرة ميكروويلس دون الحاجة إلى المرافق ذات التكلفة العالية المعقدة. استخدام القوة المغناطيسية وخرز الصلب ومجموعة من خلال ثقب، شكلت ميكروويلس عدة مئات في ركيزة بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) 3 × 3 سم.

Abstract

ثقافة كروي أداة مفيدة لفهم سلوك الخلوية حيث أنه يوفر في فيفو--مثل البيئة ثلاثية الأبعاد. مختلف أساليب الإنتاج كروي مثل الأسطح غير لاصقة وقوارير غزل وقطرات معلقة وميكروويلس قد استخدمت في دراسات التفاعل خلية إلى خلية، وتنشيط جهاز المناعة، المخدرات الفرز، تنبع تمايز الخلية، وجيل أورجانويد. من بين هذه الأساليب، اكتسبت ميكروويلس مع هندسة مقعرة ثلاثي الأبعاد اهتمام العلماء والمهندسين، ونظرا لمزاياها من جيل كروي موحدة الحجم والسهولة التي يمكن أن تكون ردود الماغنيسيوم الفردية رصد. على الرغم من أن قد اقترحت طرق فعالة من حيث التكلفة مثل استخدام الأغشية المرنة والطباعة الحجرية الجليد، هذه التقنيات تحمل العيوب الخطيرة مثل صعوبة في السيطرة على أحجام نمط، تحقيق نسب عالية، وإنتاج مساحات أكبر من ميكروويلس. للتغلب على هذه المشاكل، فإننا نقترح وسيلة قوية لاختلاق مقعرة ميكروويلس دون الحاجة إلى المرافق ذات التكلفة العالية المعقدة. هذا الأسلوب يستخدم صفيف من خلال ثقب 30 × 30، عدة مئات ميكرومتر-أمر الصلب الخرز، والقوة المغناطيسية اختﻻق ميكروويلس 900 في ركيزة بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS) 3 × 3 سم. لإثبات انطباق لدينا طريقة للتطبيقات البيولوجية الخلية، استزراع الخلايا الجذعية الدهنية لمدة 3 أيام، وأنتجت بنجاح الماغنيسيوم استخدام برنامجنا ميكروويل. وبالإضافة إلى ذلك، نحن إجراء محاكاة ماجنيتوستاتيك للتحقيق في هذه الآلية، حيث استخدمت القوة المغناطيسية لفخ الخرز الصلب من خلال الثقوب. ونحن نعتقد أنه يمكن تطبيق طريقة تصنيع ميكروويل المقترحة للعديد من الدراسات الخلوية على أساس كروي مثل فحص المخدرات وتجديد الأنسجة، وتمايز الخلايا الجذعية وسرطان خبيث.

Introduction

الخلايا التي نمت في شكل كروي أكثر مشابهة للنسيج الحقيقي في الجسم من ثقافة المستوية ثنائية الأبعاد¹. ونظرا لهذه الميزة، قد اعتمدت استخدام الماغنيسيوم لتحسين دراسة تفاعل الخلية للخلية^2،3، التنشيط المناعي⁴، المخدرات الفحص⁵و⁶من التمايز. وبالإضافة إلى ذلك، طبقت مؤخرا إلى أورجانويدس (قرب الفسيولوجية ثلاثي الأبعاد (3D) الأنسجة)، والتي مفيدة جداً لدراسة التنمية والأمراض البشرية⁷الماغنيسيوم دمج أنواع متعددة من الخلايا. وقد استخدمت عدة أساليب لإنتاج الماغنيسيوم. أبسط طريقة ينطوي على استخدام سطح غير لاصق، بتجميع الخلايا مع بعضها البعض والماغنيسيوم النموذج. ويمكن علاج طبق بيتري مع ألبومين المصل البقري أو بلورونيك F-127 أو بوليمر مسعور (مثل بولي 2-هيدروكسييثل ميثاكريلات) لجعل سطح غير لاصق^{8، 9}. الأسلوب قارورة زر الزيادة والنقصان وسيلة أخرى معروفة لإنتاج كميات كبيرة من الماغنيسيوم^10،11. في هذا الأسلوب، تشغل الخلايا في تعليق إثارة للحيلولة دون أن تصبح يعلق على الركازة. بدلاً من ذلك، العائمة الخلايا المجمعة الماغنيسيوم النموذج. كل أسلوب سطحي غير لاصقة وغزل قارورة أسلوب يمكن أن تنتج كميات كبيرة من الماغنيسيوم. ومع ذلك، فتخضع لقيود بما في ذلك صعوبات في التحكم في حجم كروي، فضلا عن التتبع ورصد كل كروي. كعلاج لهذه المشاكل، وأسلوب الإنتاج كروي آخر، إلا وهي إسقاط معلقة أسلوب يمكن العاملين¹². وهذا ينطوي على إيداع قطرات تعليق خلية على الجزء السفلي غطاء صحن الثقافة. وعادة ما تكون من 15 إلى 30 ميليلتر في حجم هذه القطرات وتحتوي على ما يقرب من 300 إلى 3000 الخلايا¹³. عندما هو مقلوب الغطاء، القطرات تجري في مكان التوتر السطحي. ويركز بيئة الجاذبية الصغرى في كل قطره الخلايا، ثم تشكل الماغنيسيوم واحد في واجهة الهواء السائل حرة. فوائد معلقة أسلوب الإسقاط أن يوفر توزيع المساحة التي تسيطر عليها جيدا، في حين أنه من السهل تتبع ورصد كل كروي، مقارنة بالأساليب قارورة المياه السطحية وغزل غير لاصقة. ومع ذلك، هذا الأسلوب يتكبد عيب واحد في هذا الإنتاج الضخمة من الماغنيسيوم وعملية الإنتاج ذاتها مفرطة من حزب العمل المكثف.

مجموعة ميكروويل من شقة لوحة مع العديد من الآبار الصغيرة الحجم، وكل منها يبلغ قطرها يتراوح من 100 إلى 1000 ميكرومتر. مبدأ الإنتاج كروي عند استخدام ميكروويلس شبيه بطريقة سطحية غير لاصقة. وتشمل فوائد حقيقة أن توفر ميكروويلس المسافات بين ميكروويلس لفصل الخلايا أو الماغنيسيوم، مثل أن يكون من السهل التحكم في حجم كروي، حين أيضا يجعل من السهل لرصد كل واحد كروي. مع عدد كبير من ميكروويلس، من الممكن أيضا إنتاج كروي الفائق. ميزة أخرى من ميكروويلس هو الخيار لآبار شكل من أشكال مختلفة (مسدس الأضلاع، أسطواني، البزموت المنشورية) تبعاً لأغراض تجريبية فريدة من نوعها المستخدمين. عموما، إلا أن شكل ثلاثي الأبعاد (3D) مقعرة (أو نصف كروية) تعتبر الأكثر مناسبة لإنتاج الماغنيسيوم واحدة موحدة الحجم. ولذلك، فائدة ميكروويلس مقعرة أبلغ العديد من دراسات البيولوجيا الخلية مثل تلك دراسة كارديوميوسيتي التفريق بين¹⁴من الخلايا الجذعية الجنينية، إفراز الأنسولين من خلية جزيرة مجموعات¹⁵، النشاط الأنزيمي من خلايا الكبد¹⁶، ومقاومة المخدرات الورم الماغنيسيوم¹⁷.

ولسوء الحظ، تلفيق ميكروويلس غالباً ما يتطلب وجود مرافق ميكروباتيرنينج المتخصصة؛ الأساليب التقليدية المستندة إلى الطباعة التصويرية تتطلب التعرض، وإنشاء مرافق بينما رد الفعل الأساليب المستندة إلى النقش بايون بحاجة إلى معدات البلازما وأيون-شعاع. هذه المعدات مكلفة، جنبا إلى جنب مع عملية تصنيع معقدة، يعرض حاجز عال لدخول لعلماء الأحياء الذين ليس لديهم إمكانية الوصول إلى ميكروتيتشنولوجي. للتغلب على هذه المشاكل، طرق أخرى فعالة من حيث التكلفة مثل الجليد الطباعة الحجرية¹⁸ (باستخدام قطرات الماء المجمدة) وقد اقترحت طريقة غشاء مرن¹⁴ (باستخدام غشاء والركيزة من خلال ثقب وفراغ). ومع ذلك، تحمل هذه الأساليب أيضا عيوب خطيرة مثل كونها صعبة التحكم في أحجام نمط وتحقيق نسب عالية وإنتاج ميكروويلس مساحة أكبر.

للتغلب على المسائل المذكورة أعلاه، نقترح أسلوب اختﻻق رواية ميكروويل مقعرة استخدام ركيزة من خلال ثقب وخرز الصلب ومجموعة مغناطيس. باستخدام هذا الأسلوب، يمكن اختﻻق مئات ميكروويلس كروية مقعرة بالاستفادة من إليه الخرز المعدني التأمين الذاتي ساعدت القوة المغناطيسية (الشكل 1). عملية تصنيع ينطوي على استخدام مرافق قليلة جداً معقدة ومكلفة ولا تتطلب الكثير من المهارات المتقدمة. على هذا النحو، يمكن بسهولة إجراء الأشخاص المهرة حتى هذا الأسلوب تلفيق. وللتدليل على الطريقة المقترحة، كانت مثقف الإنسان الدهنية-المستمدة من الخلايا الجذعية في ميكروويلس مقعرة لإنتاج الماغنيسيوم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1-إعداد صفيف من خلال ثقب الألومنيوم لوحة والمغناطيس الصفيف

1. إعداد اثنين 50 x 50 مم (أو أكبر) صفائح الألومنيوم. وكان سمك كل لوحة 300 ميكرون هو نصف قطر حبة.
2. تشكيل مجموعة من خلال ثقب 30 × 30 في واحدة من لوحات الألومنيوم باستخدام حفارة دوارة استخدام الحاسب الآلي مع قليلاً حفر الصغرى ميكرومتر Φ550 مع 30 ملم/s معدل الهبوط و 8000 دورة في الدقيقة لسرعة الدوران. وكان المسافة بين كل ثقب (مركز إلى مركز) 1 ملم (الشكل 1a و 2a الشكل، وأنا).
3. وتشكل مجموعة 30 × 30 ميكرون Φ750 من خلال الثقوب على لوحة الألومنيوم الأخرى، باستخدام نفس الإجراء كالموضحة في 1.2 (الشكل 1a و 2a الشكل، ثانيا).
4. إرفاق لوحات اثنين بعضها البعض باستخدام شريط لزجة وتشكل Φ3 مم محاذاة الثقوب في كل من الزوايا الأربع من صفائح الألومنيوم على حد سواء.
5. نقع ألواح الألومنيوم في حمض الكبريتيك 15% ح 12 لتنظيف هذه الأسطح. نظراً لأن طبقة رقيقة من أكسيد الألومنيوم على سطح الألومنيوم تجعل من مقاومة للتآكل، حفرة قطرها وسمك اللوح لا تتغير بهذه المعالجة الحمضية.
6. وتشكل مجموعة 30 × 30 من 1 × 1 × 1 مم نيوديميوم المغناطيس (مع قوة مغنطيسية 0.363 ن). ضمان أن كل المغناطيس الأقطاب المتقابلة لجارتها. لمنع كسر أو نثر الصفيف المغناطيس، إرفاق لوحة ألومنيوم 30 x 30 ملم إلى الجزء السفلي من الصفيف المغناطيس باستخدام الشريط على الوجهين (الشكل 2a، ثالثا واقحم في الشكل 2).

2-حبة العملية الملائمة

1. محاذاة والمكدس لوحات الألومنيوم اثنين (أعلى اللوحة: لوحة 750 حفرة ميكرومتر، أسفل لوحة: لوحة 550 حفرة ميكرومتر) استخدام الثقوب إعداد المحاذاة في الأركان الأربعة لكل لوحة (الشكل 1b).
2. تأمين لوحات اثنين معا عن طريق إدراج مسامير M3 في محاذاة الثقوب، ومن ثم تأمين البراغي مع المكسرات (الشكل 1b).
3. المكدس الجمعية لوحة الألومنيوم في الصفيف المغناطيس استعداد (الشكل 1bو 2bو 2 (ج)). قم بمحاذاة صفيف المغناطيس ومجموعة من خلال الثقوب في لوحة الألومنيوم أثناء عملية التراص. ثم استخدم شريط مثبت لتحديد موقف الصفيف المغناطيس.
4. لوحة مكان عددا كافياً من الصلب مم SUJ2 Φ600 الخرز على الجمعية لوحة والتلاعب بالخرز استخدام اﻷكريليك (أو غير المعدنية) مثل أن يصبح محاصرين في وقت واحد في كل حفرة (الشكل 1 ج ود 1و 1e) بينما حبة إزالة الخرز الزائدة التي لا تقدموا في الثقوب.
5. بعناية إزالة اللوحة العلوية لتجنب تشتت غير المرغوب فيها والتفكك من الخرز المحاصرين (الشكل 1f).

3-تصنيع ميكروويل مقعرة

1. نقل القالب ميكروويل مقعرة، أنتجت في خطوات 2.1 2.5، أعلاه، إلى طبق بيتري.
2. مزيج مركب بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)، وعامل المعالجة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة¹⁹ مع مونومر PDMS: علاج عامل نسبة 10:1.
3. إزالة الغاز المخلوط PDMS باستخدام مجففة ومضخة فراغ لإزالة أي فقاعات محاصرين في خليط PDMS.
4. صب خليط PDMS العفن ميكروويل مقعرة والغاز دي مرة أخرى باستخدام نفس الإجراء كالموضحة في 3.3 (الشكل 1f).
5. خبز خليط PDMS على هوتبلت عند 80 درجة مئوية ح 2 تشكل جزءا لا يتجزأ من حبة الركازة PDMS (الشكل 1 ز).
6. إزالة الركيزة PDMS شُفي من العفن (الشكل 1 ز). في عملية إزالة، ورذاذ الميثانول باستخدام زجاجة الغسيل لفصل الركيزة PDMS من العفن.
7. باستخدام Φ15 مم × 2 مم المغناطيس، إزالة الخرز الصلب المحاصرين من الركازة PDMS (ح الشكل 1). لهذه العملية، ويمكن استخدام أي مغناطيس قوي بما فيه الكفاية لاستخراج الخرز من الركازة PDMS.

4-ثقافة كروي

1. قص الركيزة PDMS مقعرة منقوشة ميكروويل باستخدام Φ14 مم خزعة لكمه لتركيبها في لوحة 24-جيدا في هذه الدراسة.
2. تعقيم الركيزة PDMS مم Φ14 الناجمة عن ذلك في معقم اﻷوتوكﻻف في 121 درجة مئوية و 15 رطل/بوصة مربعة.
3. ضع الركيزة PDMS معقمة في 24 لوحة جيدا.
4. معطف الركيزة PDMS كامل مع حل pluronic F-127 4% (w/v) بين عشية وضحاها لمنع المرفقات الخلية إلى السطح ميكروويل. أثناء عملية الطلاء، وإزالة أي فقاعات الهواء أكمنة في ميكروويلس مقعرة بيبيتينج أو باستخدام منظف الموجات فوق الصوتية.
5. مسح الحل F-127 ثلاث مرات باستخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
6. البذور 1 مل من محلول الخلية المتوسطة (تعديل النسر المتوسطة دولبيكو) (والذي يحتوي على 2 × 10⁶ خلايا) على الركازة PDMS. لاحظ أنه لا يمكن تغيير كثافة البذر وفقا لحجم كروي الهدف و/أو نوع الخلية الهدف. وهنا استخدمت الخلايا الجذعية المشتقة من الدهنية (ASC).
7. نضح 1 مل المتوسطة باستخدام ماصة 1000 ميليلتر لإزالة أي الخلايا الزائدة التي لا حوصروا في ميكروويلس (الشكل 3).
8. احتضان الخلايا عند 36.5 درجة مئوية، رطوبة > 95%، و 5% CO₂ حالة. وفي حالة الخزفية المستخدمة في هذه الدراسة، تجميع الخلايا إلى كروي في ح 48.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

كانت ملفقة من العفن محدب ونمط ميكروويل بنجاح قبل اتباع الخطوات 2.1 إلى 3.7. (الشكل 4). الخرز الصلب التجاري حوصروا في الصفيف من خلال ثقب 30 × 30. وعقدت الخرز محكم دون أي ثغرات بين الخرز وفي المقابلة عن طريق الثقوب (الشكل 4 أ). هو مقعر شكل ميكروويل مقع?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

وكان التحدي الرئيسي الذي يواجه هذا الأسلوب تلفيق تحديد آمنة من الخرز في الصفيف من خلال ثقب في لوحة الألومنيوم. لحل هذا التحدي، استخدمت القوة المغناطيسية في شكل مصفوفة المغناطيس 30 × 30 لإصلاح الخرز بشكل أمن، كما هو مبين في أرقام 6 و 7. كثافة التدفق المغناطيسي في الصفيف المغن...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CNC rotary engraver	Roland DGA	EGX-350
Micro drill bit	HAM Präzision	30-1301 TA	Φ 0.55 and 0.75 mm
Sulfuric acid 98%	Daejung	7683-4100	For cleaning aluminum plate. Dilute with distilled water with 15% solution
Neodymium magnet	Supermagnete	W-01-N	1 x 1 x 1 mm
Bearing ball	Agami Modeling	SUJ2	Φ 600 μm steel bead
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dowcorning	Sylgard 184
Pluronic F-127	Sigma Aldrich	p2443	Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution
Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS)	ATCC	30-2200
Fetal bovine serum	ATCC	30-2020
Adipose-derived mesenchymal stem cells	ATCC	ATCC PCS-500-011