إنشاء مستودع حيوي قائم على العيادة

Summary

وغالبا ما يتم التخلص من الأورام الجلدية بعد جراحة ميكروغرافيك موس. يتم وصف بروتوكول هنا أن تمكن موظفي الدعم السريري لمعالجة وتخزين الورم الجلدي على نحو فعال (على سبيل المثال، سرطان الخلايا الحرشفية ، سرطان الخلايا القاعدية، وسرطان الجلد) عينات لتطبيقات المختبر المصب دون التدخل في العمليات السريرية.

Abstract

وازدادت حالات الإصابة بسرطان الجلد ( مثل سرطان الخلايا الحرشفية وسرطان الخلايا القاعدية وسرطان الجلد) خلال السنوات القليلة الماضية. ومن المتوقع أن يكون هناك طلب مواز لعينات الورم الجلدية للدراسات البحثية الطبية الحيوية. غير أن توافر الأنسجة محدود نظرا لتكلفة إنشاء مستودع حيوي وعدم وجود بروتوكولات متاحة للحصول على عينات سريرية لا تتداخل مع العمليات السريرية. تم إنشاء بروتوكول لجمع ومعالجة الورم الجلدي وعينات الدم واللعاب المرتبطة به والتي لها تأثير ضئيل على الإجراءات السريرية الروتينية في تاريخ جراحة موس. يتم جمع عينات الورم ومعالجتها من المرضى الذين يخضعون لطبقتهم الأولى من جراحة موس للأمراض الخبيثة الجلدية ثبت خزعة من قبل مهندس الهستولوجيا موس. يتم جمع الأنسجة العادية المجاورة في وقت إغلاق الجراحية. العينات الإضافية التي يمكن جمعها هي مسحات كاملة الدم والشدق. من خلال استخدام عينات الأنسجة التي يتم التخلص منها عادة، تم إنشاء مستودع حيوي يقدم العديد من المزايا الرئيسية من خلال أن يكون مقرها في العيادة مقابل إعداد المختبر. وتشمل هذه مجموعة واسعة من العينات التي تم جمعها. الوصول إلى سجلات المرضى التي تم تحديدها، بما في ذلك تقارير علم الأمراض؛ والجهات المانحة النموذجية، الحصول على عينات إضافية خلال زيارات المتابعة.

Introduction

يعتمد السرطان وعلامات العلامات البيولوجية على العرض من عينات الأنسجة البشرية ذات الجودة العالية، وقد أعاق العرض المحدود البحث ^{1 ، 2} . العديد من الدراسات الجلدية محدودة بسبب عدم كفاية العرض، ونوعية متغيرة، والتكاليف المرتبطة باستخدام الأنسجة البشرية. وقدرت تكلفة إنشاء بنك بيوبانك كبير ومكرس بما يقرب من مليوني دولار ³ ، وهذه التكاليف تضع استخدام الأنسجة البشرية بعيدا عن متناول العديد من الباحثين. وعلاوة على ذلك، فإن عملية توليد وتخزين عينات البحوث تشكل خطرا على التأثير على العمليات السريرية وتأخير رعاية المرضى إذا لم يتم تنفيذها بعناية. وقد تم إنشاء مستودع حيوي فعال من حيث التكلفة ومستند إلى العيادة يركز على عينات سرطان الجلد بعد اتباع أفضل الممارسات الموصى بها والتحقق من صحة العينة ^{4 و 5 و 6} .

وقد تم تطوير هذا البروتوكول في عيادة الأمراض الجلدية التي تؤدي حجم كبير من العمليات الجراحية ميكروغرافيك موس لإزالة سرطان الخلايا الحرشفية (شك)، وسرطان الخلايا القاعدية (بسك)، وسرطان الجلد سرطان الجلد. ويمكن تجنيد المانحين المتطوعين من هذا العدد من المرضى. من المهم إنشاء مستودع حيوي في موقع جمع لالتقاط بسرعة الأنسجة والدم من المرضى موافق عليها دون تأخير العلاج. جمع عينات من نفس العيادة يقلل من الاختلافات في تقنيات الجمع ويقلل من الاختلافات في نوعية العينات، والتي يمكن أن تكون مشكلة للتطبيقات المصب ^{7 ، 8} .

والهدف من تقنية الجراحة المجهرية موس هو التأكد من إزالة جميع الأنسجة السرطانية مع الحفاظ على أكبر قدر ممكن من الأنسجة السليمة. الإجراء ينطوي على الإزالة التدريجية للطبقات الرقيقة من أنسجة الورم. كل طبقة متعاقبة لهفحص (بعد كريوسكتيونينغ الأنسجة الورم وأداء H & E تلطيخ) من قبل طبيب الأمراض الجلدية لتحديد ما إذا كان قد تم إزالة جميع الأنسجة السرطانية. يتم تنفيذ استئصال وفحص الطبقات اللاحقة من الأنسجة في حين يبقى المريض في المكتب. وتعتبر هذه التقنية الخيار الأفضل لعلاج شك ⁹ . عند هذه النقطة، يتم إغلاق الجرح، لتحسين الشفاء والمظهر التجميلي، والأنسجة العادية المجاورة (أنت) في كثير من الأحيان استئصال. وبالتالي، فإن هذا الإجراء الجراحي لإزالة الورم هو مثالي مثالي لجمع الأنسجة نسيجيا للدراسات المستقبلية.

وقد تم تصميم إجراءات الشراء للحصول على أنسجة الورم، الأنسجة الطبيعية المجاورة، اللعاب، وعينات الدم ليكون لها تأثير ضئيل على واجبات الموظفين العادية ( الشكل 1 ). ويقوم المساعدين الطبيين بإجراء عمليات سحب الدم أثناء تحضير المريض للإجراء. بعد الانتهاء من إجراء موس، و M أوهس هيستوتيشنولوجيست إعداد شرائح نسيجية إضافية من العينة ونقل الأنسجة إلى مستودع حيوي. وتشمل التكاليف المرتبطة بإنشاء مستودع حيوي شراء مجمدات للحفظ بالتبريد، وإنشاء حيز مختبر طبي متواضع، ووضع برنامج لتتبع المخزون.

الشكل 1: تسلسل جمع العينات والموظفين المسؤولين. عند تسجيل المريض والحصول على موافقة المريض، يقوم المساعد الطبي بجمع مسحة الشدق وإجراء عملية سحب الدم. طبيب الأمراض الجلدية والمساعد الطبي ثم استئصال الورم وإغلاق الجرح، وخلال ذلك الوقت يتم جمع شك و أنت العينات، على التوالي. يقوم فني مختبرات متخصص بمعالجة الدم والأقسام عينات شك و أنت لثقافة الأنسجة، وحفظها، والدخول في مستودع حيوي.ftp_upload / 55583 / 55583fig1large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تنوع العينات التي تم جمعها تمكن مجموعة متنوعة من النهج التجريبية ( الشكل 2 ). العينات التي تم جمعها من المريض هي مسحات الشدق (اللعاب ويمكن أيضا أن تجمع إذا لزم الأمر)، والدم الكامل، والأنسجة استئصال. يتم حفظ مسحات الشدق وعينة من الدم كله، من دون معالجة، من أجل التنميط الجيني والأنسجة مطابقة. يتم فصل الدم الكامل إلى خلايا الدم البيضاء (وك) وكسور البلازما للتحليلات المستقبلية. بعد تجهيز موهس، يتم وضع الورم المجمد مباشرة في النيتروجين السائل ونقلها إلى الفريزر -80 درجة مئوية. يتم استزراع جديدة، الأنسجة الورم قابلة للحياة وعينات أنت باستخدام تعديلات التقنيات السابقة ^{10 ، 11} ثم كريوبريزرفيد. أثناء التجميع، يتم تسجيل عدد كل نوع من أنواع العينات على جدول بيانات قبل الدخول إلى برنامج تتبع المخزون لتيسير المعالجة الدقيقة ( الجدول 1 ).

الشكل 2: الخطوط العريضة لجمع العينات البيولوجية المستندة إلى العيادة ومعالجتها. يتم جمع مسحة الشدق وعينة الدم من المريض وتخزينها للتوليف الجيني والمطابقة الأنسجة. يتم معالجة الدم الكامل أيضا لعزل خلايا الدم البيضاء (وك) وتحليل كتك، وكذلك لجمع البلازما وتحليل خزعة السائل. الأنسجة استئصال خلال إجراء موس يتم معالجتها نسيجيا لأغراض التشخيص، وبعد ذلك الشرائح نسيجية يمكن استخدامها تجريبيا لمزيد من التحليلات المناعية. شريطة أن عينة الأنسجة استئصال كبيرة بما فيه الكفاية، يتم إزالة جزء من الأنسجة الطازجة ومقطوع للبروتين وعزل الحمض النووي الريبي، وإنشاء خطوط الخلايا المستزرعة.55583 / 55583fig1large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تاريخ المجموعة:
	المريض 1	المريض 2	المريض 3	المريض 4	المريض 5
البدايات وتاريخ الميلاد
لون العين
نوع العينة
موقع العينة
لعاب
Wثقب الدم
بلازما
الورم فيابل
الأنسجة عادي قابل للحياة
الورم موهس النيتروجين السائل
الأنسجة العادية النيتروجين السائل
الشرائح

الجدول 1: قائمة مرجعية لتسجيل مجموعات العينات. البيانات التي تم تتبعها وتسجيلها مع كل عينة تم جمعها تشمل الأحرف الأولى للمريض، وتاريخ الميلاد، ولون العين (للطباعة الجلد)، وكذلك الموقععلى إزالة العينة. كما يتم تسجيل عدد لعينات اللعاب، وأحجام جمع الدم، وعدد من عينات الأنسجة قابلة للحياة والحفاظ عليها التي تم جمعها كمراجع للمخصصات لاستخدامها لاحقا. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

للتحقق من صحة إجراءات جمع العينات، تم اختبار كل نوع من عينات في التطبيقات المصب. باستخدام التعديلات من التقنيات السابقة ¹² ، الورم و أنت قد استخدمت بنجاح في البروتين وعزل الحمض النووي الريبي ويمكن أن تستخدم لعزل الحمض النووي. وقد تم تقييم إإكسبلنتس قابلة للحياة أنشئت من أقسام الأنسجة عن طريق الفحص المجهري، في حين تم استخدام الشرائح النسيجية المخزنة لالمناعية والمناعي.

من خلال اتباع بروتوكول الموصوفة هنا، فمن الممكن لتوسيع هذا النموذج إلى عيادات الأمراض الجلدية الأخرى، وأنواع الورم الأخرى (مثل سرطان الجلد)، وغيرها من التخصصات والممارسات الجراحية لتوفير عينات الأنسجة البشرية للأبحاث متعددة الأوجه في سرطان الإنسان. التعديلات الطفيفة من هذا البروتوكول من المرجح أن تكون ضرورية لممارسات أخرى ولكن، من حيث المبدأ، وهذا البروتوكول ينطبق على أي ممارسة الجراحية التي تتجاهل بشكل روتيني عينات المريض التي تم جمعها في سياق علاج المريض.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على عينات الأنسجة البشرية من قبل إيرب الغربية (بروتوكول ويرب # 20142461). المعيار الوحيد لجمع الأنسجة لهذه الإجراءات هو تشخيص خزعة ثبت من شك. لم يتم تحديد معايير الاستبعاد في بروتوكول إيرب الأصلي، ولكن لم يتم استخدام عينات من المرضى الذين يعانون من الأمراض المعدية المنقولة عن طريق الدم. تم الحصول على موافقة مستنيرة قبل جمع الأنسجة الجلدية والدم واللعاب. وافق مجلس المراجعة المؤسسية الغربية الغربية على عمل التحقق من صحة مع عينات المستودع الحيوي المستندة إلى العيادة في جامعة ميدوسترن (أز # 807).

1. الجلدي معالجة الأنسجة الورم

ملاحظة: هذا هو ليتم تنفيذها من قبل مهندس الهستولوجيا موس.

1. معالجة سرطان الخلايا الحرشفية الطازجة (شك) الأنسجة ل رنا و إكسبلانت الثقافة
   1. بعد أن تم استئصال الأنسجة من قبل جراح موس، حصاد 10 إلى 50 ملغ (≥10 مم ³ ) عينة الأنسجة من مركز الجانب القمي من الأنسجة أثناء الاسترخاء (وهي عملية التلاعب الأنسجة للسماح لها أن تكمن شقة على الشريحة) قبل معالجة إضافية.
      ملاحظة: هذا ممكن فقط إذا كان الورم كبيرة بما يكفي للسماح لعينة 10-50 ملغ حجم (≥10 مم ² ) لإزالتها قبل التقييم النسيجي، الذي هو جزء من إجراء موس. إذا كان الورم ليست كبيرة بما فيه الكفاية للسماح بحد أدنى 2 مم ³ لإزالتها، لا المضي قدما في معالجة ل رنا (تخطي الخطوة 5).
   2. نقل الأنسجة القابلة للحياة إلى أنبوب المسمى 1.5 مل يحتوي على ثقافة المتوسطة (1: 1 خليط من دمم: هام F-12، 25 هيبيس هيبيس، و 100 وحدة دولية / مل من البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين) باستخدام ملاقط وضمان أن الأنسجة مغمورة تماما في المتوسطة. تخزين هذا الأنبوب في 4 درجات مئوية قبل معالجة إضافية.
   3. استخدام الأنسجة لعزل الحمض النووي الريبي وتحليل التعبير (انظر الخطوة 5) و / أو إنشاء(انظر الخطوة 6) خلال 24 ساعة.
   4. وضع ما تبقى من عينة الورم التي تمت إزالتها من المريض (الخطوة 1.1.1) على حامل الأنسجة البرد البرد (أو "تشاك"). تضمين الأنسجة في درجة حرارة القطع الأمثل (أكتوبر) مجمع، وتجميد الأنسجة داخل حامل، للسماح لاستكمال موس الأنسجة ولإعداد الشرائح النسيجية إضافية للتحليل التجريبي.
2. إعداد الشرائح النسيجية
   1. قطع أقسام الأنسجة 7 ميكرون سميكة باستخدام البرد وإنشاء اثنين (أو أكثر) الشرائح لكل عينة الورم. تأكد من أن كل شريحة تحتوي على ما يصل إلى ثلاثة أقسام من الورم الكامل.
      ملاحظة: سوف تكون ملطخة واحدة من الشرائح اثنين باستخدام H & E من قبل التكنولوجيا الهوس موهس، والشرائح الإضافية (ق) يمكن معالجتها مع إف، إهك، أو فيش التحليل.
   2. وضع الشرائح في الأسيتون لمدة 1-2 ثانية لإصلاح الأنسجة. تعيين هذه الشرائح جانبا لتجف. لا H & Eوصمة عار أو ساترة الشريحة لاستخدامها في المناعي في المستقبل (إف)، المناعية (إهك)، أو مضان في الموقع التهجين (فيش) التحليل، اعتمادا على البروتوكول التجريبي.
3. تجهيز الأنسجة بعد موس
   1. مرة واحدة وقد تم الانتهاء من تجهيز موهس (الخطوات 1.1-1.2)، والعمل في غرفة البرد ونقش العينة من البرد تضمين المتوسطة ووضع الأنسجة في أنبوب المبردة المسمى.
   2. وضع قارورة المسمى في النيتروجين السائل قبل أن ذوبان الأنسجة. إذا كانت العينات لاستخدامها في تحليل البروتين و / أو الحمض النووي، فإنها يمكن نقلها إلى النيتروجين السائل أو الفريزر -80 درجة مئوية في غضون بضع دقائق ليتم تخزينها لتعبير البروتين في المستقبل وتحليل الحمض النووي طفرة (انظر الخطوات 4-5) .
      ملاحظة: إذا كان المطلوب رنا سليمة من العينة بعد موهس، فمن الضروري للحفاظ على العينة المجمدة أثناء الإزالة من المتوسطة التضمين البرد. إذا لم يتم ممارسة العناية القصوى فيهذه الخطوة، يجب أن تكون محفوظة عينة ما بعد مهس لتحليل البروتين و / أو الحمض النووي.
4. معالجة النمل الطازج
   1. في وقت إغلاق موس، الحصول على أنت من جراح موس.
   2. إزالة كمية متساوية أو أكبر من أنت كما تم حصادها من عينة شك (انظر أعلاه) من الجانب القمي من الأنسجة الطبيعية ونقله إلى أنبوب المسمى 1.5 مل تحتوي على مستنبت (1: 1 خليط من دمم: هام F- 12 تستكمل مع 25 ملي هيبيس، 100 وحدة دولية / مل من البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين) باستخدام ملاقط.
   3. تزج تماما الأنسجة في نفس المتوسطة الثقافة وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى المعالجة اللاحقة (انظر الخطوات 4-6).

2. الدم واللعاب، ومعالجة مسدق الشدق

1. الحصول على حوالي 10 مل من الدم في أنابيب جمع إدتا عن طريق الوريد.
2. نقل الدم من أنابيب جمع إلى العقيمة 15- أو 50 مل أنبوب الطرد المركزي. إزالة حوالي 200 ميكرولتر في أنبوب المبردة 1.5 مل، وتجنب فقاعات. تخزين هذه العينة كاملة الدم في -80 درجة مئوية، لاستخدامها في التنميط الجيني في المستقبل والأنسجة مطابقة، إذا لزم الأمر.
   1. تدور الدم المتبقية في 1000 x ج لمدة 30 دقيقة واتبع الإجراءات القياسية لجمع جزء البلازما.
   2. قسامة البلازما إلى 1 مل الزيادات في 1.5 مل أنابيب المبردة وتخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها خلال تحليلات الخزعة السائل في المستقبل.
3. استخدام مسحة معقمة للحصول على عينة مسحة الشدق وتخزين مسحة في أنبوب معقمة في درجة حرارة الغرفة.
4. إذا لزم الأمر، والحصول على عينة اللعاب وتخزينها في أنبوب معقمة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يمكن استخدام هذه العينات لالمستقبلية التنميط الجيني والأنسجة مطابقة، إذا لزم الأمر.

3. ريكوردكيبينغ من العينات

1. نقل المعلومات من القائمة المرجعية لعينات المرضى إلى قاعدة بيانات التخزين الحيوي. تضمين معلومات المريض و دياغنوسيس من المخطط المريض.
2. طباعة تسميات مع الباركود لكل عينة وتسجيل كل في قاعدة البيانات لربط كل عينة تم جمعها مع بيانات المريض.
3. تسجيل توزيع العينات التي تم تحديدها في قاعدة البيانات البيولوجية قبل نقل العينات إلى مختبر البحوث.

4. عزل البروتين وتحليل لطخة غربية

1. وضع كل عينة الأنسجة (شك و / أو أنت) في قارورة تحتوي على 500 ميكرولتر من العازلة تحلل الخلية التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني لكل 100 ملغ من الأنسجة إلى ليز الأنسجة.
   ملاحظة: استخدمنا فحص مقايسة مناعي رادي (ريبا) العازلة، تتألف من 50 ملي تريس درجة الحموضة 8.0، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم، 1.0٪ نب-40، و 0.1٪ سدز. ويمكن استخدام مخازن أخرى تحلل الخلية.
2. تجانس الأنسجة باستخدام الخالط الأنسجة لمدة 5 دقائق في فترات 20 ثانية في 4 درجات مئوية. تدور العينات في 21،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وجمع طاف تحتوي على البروتين إلى تو الطازجةيكون. إعادة تدور طاف باستخدام نفس الظروف وجمع طاف النهائي في أنبوب جديد.
3. إليكتروفوريز 30-50 ميكروغرام من البروتين من كل عينة باستخدام 4-20٪ سدز بولي أكريلاميد التدرج هلام. وصمة عار الجل مع كوماسي الأزرق لتصور العصابات البروتين، إذا رغبت في ذلك.
4. إذا كان هناك حاجة إلى تحليل لطخة غربية من البروتينات أعرب، ونقل البروتينات من هلام إلى غشاء البولي فينيلدين (بفدف) غشاء بعد البروتوكولات القياسية. بعد نقل، بونسو وصمة عار على غشاء بفدف لتصور العصابات البروتين، إذا رغبت في ذلك.
5. منع غشاء بفدف والمسبار للكشف عن البروتينات من الفائدة بعد البروتوكولات القياسية. استخدام الأجسام المضادة الأولية محددة للبروتين (ق) من الفائدة، جنبا إلى جنب مع الأجسام المضادة الثانوية المقابلة المقابلة للأجسام المضادة الأولية، في تركيزات الموصى بها من قبل الشركة المصنعة لتحليل لطخة غربية.
6. فضح غشاء التحقيق باستخدام الركيزة تشيميلومينسنت وصورة الغشاء باستخدام الخيالنغ.

5. عزل الحمض النووي الريبي وكمية البلمرة تفاعل سلسلة (قر)

1. وضع فورا عينات الأنسجة الطازجة (شك و / أو أنت) في أنبوب 1.5 مل تحتوي على حل الاستقرار الحمض النووي الريبي ومكان ما بعد عينات الأنسجة موس في أنبوب 1.5 مل تحتوي على حل الانتقال الأنسجة المجمدة، في أعقاب توصيات الشركة المصنعة. تأكد من أن الأنسجة مغمورة تماما. تخزين هذه العينات في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. إزالة عينات الحمض النووي الريبي من -80 درجة مئوية والذوبان على الجليد. نقل الأنسجة إلى أنبوب 1.5 مل جديد يحتوي على 1 مل من العازلة استخراج الحمض النووي الريبي (الفينول / غوانيدين ثيوسيانات) لكل 50-100 ملغ من الأنسجة.
3. ليس الأنسجة باستخدام الخالط الأنسجة. أداء ست دورات من التجانس، تليها فترة من عينة التبريد. كل دورة تتكون من 20 ثانية من التجانس في 4 درجات مئوية وفترة التبريد 40 ثانية. بعد التجانس، واحتضان العينة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
4. إضافة 0.2مل من الكلوروفورم لكل 1 مل من العازلة استخراج الحمض النووي الريبي ويهز الأنبوب بقوة باليد لمدة 15 ثانية. احتضان لمدة 2-3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. تدور العينات في 12،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. إزالة المرحلة المائية للعينة ووضعه في أنبوب 1.5 مل جديد.
6. إضافة 0.5 مل من الأيزوبروبانول 100٪ لكل 1 مل من العازلة استخراج الحمض النووي الريبي المستخدمة في الخطوة 5.2 إلى المرحلة المائية واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: إذا كان من المتوقع أن تكون منخفضة الغلة ( أي، وحجم الأنسجة ابتداء من أقل من 10 ملغ)، وعينات قد عجلت بين عشية وضحاها في -80 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك، 5 ميكروغرام من الجليكوجين خالية من ريبونوكلياز لكل 500 ميكرولتر من العازلة استخراج الحمض النووي الريبي يمكن أن تضاف خلال خطوة هطول الأيزوبروبانول لتحسين غلة الحمض النووي الريبي.
7. تدور العينة في 12،000 x ج في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. إزالة طاف وغسل بيليه مع 1 مل من الايثانول 75٪.
8. دوامة العينة لفترة وجيزة ثم تدور في 7،500 زغ و 4 درجةC لمدة 5 دقائق. تجاهل غسل والهواء الجاف بيليه لمدة 5-10 دقيقة.
9. ريسوسبيند بيليه الحمض النووي الريبي في 20 ميكرولتر من المياه خالية من ريبونوكلياز.
   1. إذا رغبت في ذلك، وتنقية كل عينة رنا باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي بعد توصيات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: سيتم فقدان رنا صغيرة من العينة إذا تم تنفيذ هذه الخطوة.
10. إلكتروفوريز عينة 1 ميكروغرام باستخدام الفورمالديهايد - 1٪ الفورمالديهايد - هلام الاغاروز لتحليل نوعية الحمض النووي الريبي.
    ملاحظة: كبديل، وتحليل العينات باستخدام بيواناليزر للحصول على رقم رين ¹³ .
11. عكس نسخ الحمض النووي الريبي إلى [كدنا] باستخدام بروتوكول النسخ العكسي لتحليل قر من مرناس الهدف (أو ميرناس) من الفائدة.

6. الأنسجة الثقافات إكسبلانت

1. تعقيم الأنسجة استئصال قبل الثقافة من خلال غمس الأنسجة إلى 70٪ من الإيثانول.
2. وضع الأنسجة على شريحة أو طبق وإضافة ما يكفي من الوسط الثقافي (1: 1 خليط من دمم: هام &39؛ ق F-12 تستكمل مع 10٪ فبس، 25 هيبيس ملي، 100 وحدة دولية / مل من البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين) لتغطية الأنسجة (لمنع الأنسجة من التجفيف). قطع بعناية الأنسجة إلى شظايا (<1 مم ³ ) باستخدام شفرة مشرط.
3. نقل شظايا الأنسجة إلى طبق الثقافة الأنسجة 35 ملم وإضافة ما يقرب من 20 ميكرولتر من مصل الأبقار الجنين (فبس) على رأس كل جزء.
4. ترك الطبق مفتوحة في غطاء الثقافة لمدة 20-30 دقيقة، أو حتى الجافة تقريبا.
5. إضافة 1 مل من الوسط الثقافي (1: 1 خليط من دمم: هام F-12 تستكمل مع 10٪ فبس، 25 ملي هيبيس، 100 وحدة دولية / مل من البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين) إلى كل طبق واحتضان عند 37 درجة C في 5٪ كو ₂ . ثقافة فرعية أو شبه استنساخ الثقافات إذا لزم الأمر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

وقد استخدمت الورم و أنت بنجاح في عزل البروتين واختبارها من قبل النشاف الغربية. كما هو مبين في الشكل (3) ، يمكن الكشف عن علامات سرطان الخلايا الحرشفية الجلدية (Muc1 ¹⁴ ، فل-1 ¹⁵ ، و p40 ^{16 ، 17} ) ف...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

إلى علم المؤلف، وهذا البروتوكول هو الأول من نوعه الذي يركز على المشتريات السريرية من عينات الأنسجة الجلدية في كل من نهج فعالة من حيث التكلفة وسريعة. وعادة ما يتم تحديد المرضى الذين يخضعون لجراحة المجهرية موه خلال فترات محددة من الزمن، ويقتصر جمع هذه الفترات. جمع العي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with K3EDTA	ThermoFisher Scientific	02-685-2B
Electron Microscopy Sciences Double Edge Blades	ThermoFisher Scientific	50-949-411
Curved Medium Point General Purpose Forceps	ThermoFisher Scientific	16-100-110
Premium Microcentrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	05-408-138
Lonza Walkersville KGM Keratinocyte Medium	ThermoFisher Scientific	NC9791321
Electron Microscopy Sciences Tissue TEK OCT Compound	ThermoFisher Scientific	50-363-579
Leica CM1950 Cryostat	Leica Biosystems	14047743909
Frosted Microscope Slides	ThermoFisher Scientific	12-550-343
Shandon Rapid-Chrome H&E Frozen Section Staining Kit	ThermoFisher Scientific	99-900-01
Nalgene Long-Term Storage Cryogenic Tubes	ThermoFisher Scientific	03-337-7X
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
Boca Scientific BuccalT-Swab	ThermoFisher Scientific	NC9679349
Cell Signaling Technology 10x RIPA Buffer	ThermoFisher Scientific	50-195-822
Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail	ThermoFisher Scientific	PI78443
Eppendorf 5424R Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	05-401-203
Pellet Morter Cordless Homogenizer	ThermoFisher Scientific	12-141-3
RNAse Free Pellet Pestle	ThermoFisher Scientific	121-141-364
Forma SteriCycle CO2 Incubator	ThermoFisher Scientific	13-998-089
HyClone Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Scientific	SH30071.02
Gibco Advanced DMEM/F-12	ThermoFisher Scientific	12-634-028
Gibco Penicillin-Streptomycin	ThermoFisher Scientific	15140148
Gibco 1 M Hepes	ThermoFisher Scientific	15-630-130
Nunc Cell Culture 35 mm with Vent	ThermoFisher Scientific	1256591
Anti-CFH monoclonal antibody clone OX-24	Abnova	MAB12583
Anti-p40 (p63 delta) antibody	Abnova	ABX-144A
Anti MUC-1 antibody	Santa Cruz Biotech	sc-7313
Anti-Snail + Slug (phospho S246)	Abcam	Ab63568
Goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
Alexa Fluor 568 Phallodin	Molecular Probes	A12380
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P36941
Zeiss Axio Imager Z1 Microscope with Axiocam camera	Zeiss	4300009901
Olympus IX51 phase contrast with DP72 camera	Olympus	IX511F3