عالية الدقة التصوير والتحليل من الأفراد بالنجوم أنيبيب حيوية في مهدها الخميرة

Summary

في مهدها الخميرة هو نموذج متميز لدراسة ديناميات أنيبيب في الجسم الحي بسبب الوراثة القوية وبساطة الهيكل الخلوي أنيبيب لها. يصف بروتوكول التالية كيفية تحويل والخلايا الثقافة الخميرة، واكتساب مبائر الصور المجهري، وكميا تحليل ديناميات أنيبيب في الخلايا الحية الخميرة.

Abstract

الأنابيب الدقيقة حيوية أساسية للعديد من العمليات الخلوية، ويمكن أن قياسات دقيقة للديناميات أنيبيب توفير نظرة ثاقبة كيف تنظم خلايا هذه العمليات وكيف راثية الطفرات تنظيم تأثير. القياس الكمي لديناميات أنيبيب في نماذج متعددة الخلايا لديها عدد من التحديات المرتبطة بها، بما في ذلك الكثافة العالية أنيبيب والقيود المفروضة على التلاعب الجيني. في المقابل، فإن نموذج الخميرة في مهدها يوفر المزايا التي تغلب على هذه التحديات. يصف هذا البروتوكول وسيلة لقياس ديناميكية الأنابيب الدقيقة واحدة في الخلايا الحية الخميرة. يتم الالتزام الخلايا معربا عن تويولين الموسومة fluorescently إلى غرف الشريحة تجميعها، والسماح لمستقر الحصول على الصور مرور الزمن. دليل مفصل لسرعة عالية، يتم توفير الحصول على الصور رباعية الأبعاد أيضا، وكذلك بروتوكول لقياس خصائص الأنابيب الدقيقة ديناميكية في مداخن صورة مبائر. هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع علم الوراثة الخميرة التقليدية، سفر الأمثالايديس وهو نهج غير مناسبة فريدة لتقييم كمي لآثار المنظمين أنيبيب أو الطفرات التي تغير نشاط مفارز تويولين.

Introduction

الأنابيب الدقيقة هي البوليمرات هيكل الخلية مصنوعة من مفارز البروتين αβ تويولين وتستخدم في طائفة واسعة من السياقات الخلوية، بما في ذلك النقل داخل الخلايا، انقسام الخلايا، التشكل، والحركة. لبناء شبكات أنيبيب لهذه الأدوار المتنوعة، يجب أن خلايا تنظيم بعناية أين ومتى الأنابيب الدقيقة النموذج. ويتم إنجاز هذا النظام عن طريق التحكم في ردود الفعل التي إما تجميع مفارز-αβ تويولين في البوليمرات أنيبيب أو الأنابيب الدقيقة تفكيك إلى وحدات الحرة؛ هذا هو المعروف باسم ديناميات أنيبيب.

والهدف الرئيسي من حقل أنيبيب هو توضيح الآليات الجزيئية التي تنظم ديناميات أنيبيب، بما في ذلك دراسات مفارز-αβ تويولين والمنظمين خارجي أن ربط تويولين و / أو الأنابيب الدقيقة. والمنهج التجريبي راسخة هو إعادة هذا النظام في المختبر باستخدام تنقية البروتين αβ تويولين، في كثير من الأحيان في كومbination مع المنظمين خارجي النقاء. ورغم أن هذا هو نهج مفيد، فمن الواضح أن ديناميات أنيبيب في أنظمة أعيد تختلف بشدة من تلك التي لوحظت في الخلايا الحية. على سبيل المثال، الأنابيب الدقيقة تنمو بشكل أسرع وأبطأ يتقلص في الجسم الحي من في المختبر. ويمكن أن يعزى هذه الاختلافات بتوافر المعروف المنظمين خارجي ^1، فضلا عن العوامل بعد، غير محددة في الخلايا. لذا، فمن الأهمية بمكان لتحديد أنشطة المنظمين أنيبيب والمسوخ التي تعطل ديناميكية في سياق الخلوي الأصلي.

على الرغم من أن نماذج متعددة الخلايا وقد ثبت أن الأنظمة السائدة للتحقيق وظيفة أنيبيب وتنظيم عالي المستوى، والعديد من الاهتمامات العملية تحد بشدة من فائدة هذه نماذج لقياس دقيق للديناميات أنيبيب. أولا، عدد كبير من الأنابيب الدقيقة، التي تتراوح بين عشرات الآلاف في كل خلية، يجعل من الصعب بثقةتتبع الأنابيب الدقيقة الفردية على مر الزمن. وتتناول العديد من الدراسات هذا التحدي من خلال تصوير البروتينات التي توطين بشكل انتقائي لغايات أنيبيب، مثل البروتينات في (EB) أسرة ملزم نهاية. ومع ذلك، ومن المعروف أن هذه البروتينات في توطين فقط إلى أقاصي المتزايد الأنابيب الدقيقة في metazoans ^2. ولذلك، يقتصر فائدة هذه البروتينات لقياس مباشرة معدلات النمو، في حين فقط قياس غير مباشر جوانب أخرى من ديناميكية، مثل تكرار كارثة. ثانيا، على الرغم من التقدم في التكنولوجيا التحرير الجينوم، وخلق الخلايا التي تعبر عن ثابت تويولين fluorescently المسمى أو إدخال تحولات على التعامل بشكل انتقائي تويولين أو أنيبيب المنظمين لا يزال يشكل تحديا كبيرا. وعلاوة على ذلك، فإن وجود العديد من isotypes تويولين في metazoans يفند دراسة كيفية تأثير الطفرات الجينات تويولين الفردية.

ويوفر نظام الخميرة في مهدها العديد من المزايا الهامة لقياس في الجسم الحي microtubuديناميات جنيه. الخميرة لديها شبكة أنيبيب مبسطة تسمح التصور من الأنابيب الدقيقة الفردية. في الخميرة، والأنابيب الدقيقة تنبع من تنظيم المراكز المعروفة باسم الهيئات القطب المغزل (SPBs)، والتي هي جزء لا يتجزأ في الغلاف النووي ^3. وSPBs بمثابة السقالات لمجمعات للγ تويولين الصغيرة التي nucleate الأنابيب الدقيقة ^{4، 5.} SPBs nucleate فئتين من الأنابيب الدقيقة، الأنابيب الدقيقة المغزل والأنابيب الدقيقة نجمي. ميكروتثبول المغزل مشروع في جبلة النواة ومهمة لربط إلى الكروموسومات عبر الأنابيب الدقيقة الحيز الحركي ولتحقيق الاستقرار في المغزل عبر تداخل الأنابيب الدقيقة بين القطبين ^6. في المقابل، مشروع الأنابيب الدقيقة نجمي الخارج في العصارة الخلوية ونادرة نسبيا مقارنة مع شبكة كثيفة من الأنابيب الدقيقة المغزل. خلال الانقسام، وخلايا ما قبل طور الصعود ليس لها سوى 1-2 الأنابيب الدقيقة نجمي المنبثقة من أي SPB. هذه موجودة وأناالأنابيب الدقيقة ndividual بدلا من حزم ^7. دور الأنابيب الدقيقة نجمي خلال الانقسام هو نقل نواة والمغزل في تقاطع بين الأم وبرعم المقصورات، والمعروفة باسم الرقبة مهدها. وتنطوي هذه الحركة مسارات واضحة المعالم التي تولد قوة على الأنابيب الدقيقة نجمي، وسحب نواة والمغزل نحو وفي نهاية المطاف إلى الرقبة برعم ^8.

ميزة أخرى للنظام الخميرة هي فائدة علم الوراثة، والتي يمكن استخدامها لتحقيق المنظمين أنيبيب ومفارز تويولين بدقة لا مثيل لها. تمتلك الخميرة أيضا مرجع مبسط لisotypes تويولين: واحد-β تويولين الجين (TUB2) واثنين من الجينات ألفا تويولين (TUB1 وTUB3). الطفرات يمكن إدخال بسهولة في هذه الجينات، وبالتالي درس في عدد السكان تويولين متجانسة ^{9 و 10.} وهناك عدد من على نطاق واسعيبني المتاحة لوضع العلامات الأنابيب الدقيقة، وهذه يمكن أن تكون موجهة لتحقيق التكامل في مواضع الكروموسومات للتعبير مستقر (انظر مناقشة).

ويتمثل الهدف العام من هذه الطريقة هو أن الأنابيب الدقيقة صورة واحدة في الخلايا الحية الخميرة في أربعة أبعاد (X، Y، Z، وT) لقياسات عالية الدقة للديناميات أنيبيب. وصفت وسائل لدمج يبني لوالتعبير على مستوى منخفض التأسيسية من تويولين fluorescently المسمى في خلايا الخميرة. قبل التصوير، هي التي شنت الخلايا الحية إلى غرف الشرائح المغلفة مع كتين كونكانافالين A لتحقيق الاستقرار في الخلايا للتصوير على المدى الطويل. المعلمات المثلى لاقتناء الصور، فضلا عن سير العمل لتحليل البيانات، وتوصف أيضا.

Protocol

1. إعداد لوحات -LEU التسرب

1. إضافة 800 مل من عقيم، الماء منزوع الأيونات (DIH ₂ O) إلى قارورة 2 L. إضافة 26.71 غرام من قاعدة التسرب مسحوق (تاريخ الميلاد)، 0.69 غرام من CSM-لوي، و 20 غراما من أجار. الاختلاط مع شريط مغناطيسي. جلب إلى 1 L مع DIH ₂ O.
2. الأوتوكلاف في 121 ° C و 19 رطل لمدة 30 دقيقة.
3. إزالة قارورة من الأوتوكلاف والسماح لتبرد إلى ~ 65 درجة مئوية مع التحريك لطيف.
4. صب 30 مل / لوحة إلى 100 ملم لوحات قطر. فلتكن هذه الجلوس في درجة حرارة الغرفة ل36-48 ساعة قبل تخزينها في 4 درجات مئوية.

2. دمج GFP-Tub1 للتعبير التأسيسي تويولين المسمى GFP

1. تغلي تركيز الأسهم من 10 ملغ / مل الذين تقطعت بهم السبل واحد-DNA (ssDNA) لمدة 3 دقائق.
2. الجمع بين 2 ميكرولتر من ssDNA المغلي مع 400 نانوغرام من تنقية GFP-Tub1 DNA البلازميد ^11.
   ملاحظة: هناك مجموعة متنوعة من البلازميدات التي يمكن استخدامها لمستقر، ووضع العلامات الفلوريةمن الأنابيب الدقيقة في الخميرة التي تستخدم fluorophores بديلة وعلامات اختيار. ووصف بعض هذه البدائل في قسم مناقشة.
3. يضاف خليط DNA لقسامة 50 ميكرولتر من خلايا الخميرة المختصة.
   ملاحظة: إعداد خلايا الخميرة المختصة مع حل السوربيتول (فاكهة الغبيراء؛ 100 ملي LiOAc، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 1 ملم EDTA الرقم الهيدروجيني 8 و 1 M السوربيتول، معدلة مع حمض الخليك المخفف لدرجة الحموضة 8). للحصول على وصف مفصل لصنع خلايا الخميرة المختصة، أنظر المرجع ^12.
4. دوامة بدقة.
5. إضافة 6X الحجم الكلي للالبولي ايثيلين جلايكول (PEG) حل (100 ملي LiOAc، 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 1 ملم EDTA / هيدروكسيد الصوديوم درجة الحموضة 8، و 40٪ PEG3350) إلى خليط DNA الخلية.
6. دوامة بدقة.
7. احتضان لمدة 1 ساعة على الأقل عند 30 درجة مئوية مع الإثارة لطيف.
8. إضافة سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) إلى 10٪ من إجمالي حجم ودوامة.
9. احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
10. أجهزة الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 5 دقائق.
إزالة طاف وتعليق الخلايا في 100 ميليلتر من DIH ₂ O.
11. لوحة الخلايا على صفيحة -LEU التسرب.
    ملاحظة: يحتوي بناء GFP-Tub1 علامة بعامل نمائي ليسين، في حين بنيات أخرى يمكن استخدام علامة بديلة. وينبغي أن يكون وسيلة التسرب محددة لعلامة بعامل نمائي للبناء.
12. السماح للخلايا تتحول لتنمو لمدة 3-5 أيام عند 30 درجة مئوية.
13. إعادة خط المستعمرات التحول واحدة على الطازجة لوحة -LEU التسرب عن طريق نقل المستعمرات باستخدام المسواك تعقيمها. احتضان لوحة بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.
14. فحص البصر كل المحولة للإشارة GFP من خلال تعليق ما يقرب من 1 ميكرولتر من الخلايا من مستعمرة واحدة من لوحة في الخطوة 2.14 في 2 ميليلتر من الماء على شريحة نظيفة. تغطية الخلايا مع وقف التنفيذ مع ساترة ومراقبة باستخدام المجهر مضان.
    1. تثير transformants مع 488 نانومتر ضوء والبحث في وجود إشارة GFP.
       ملاحظة: هذه الخطوة يمكن استخدام قرص الغزل المجهر متحد البؤر، ولكن المجهر widefield مجهزة الهدف 100X والبصريات المناسبة لتصوير وGFP يكفي. الخلايا مع عدم وجود الأنابيب الدقيقة المسمى GFP مرئية، أو الذين لديهم مضان عالية بشكل غير طبيعي، ينبغي رفض. بعد ذلك، فإن سلالات الخميرة على استعداد ليكون مثقف للتصوير.

3. تزايد السائلة الثقافة الخميرة

1. تطعيم ~ 1 ميكرولتر من خلايا الخميرة من مستعمرة واحدة على لوحة في 3 مل من المتوسط ​​الشامل الاصطناعية. السماح للخلايا أن تنمو بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
2. تمييع الثقافة المشبعة في اليوم التالي إلى OD ₆₀₀ من <0.1 في المتوسط. عودة ثقافة المخفف إلى 30 ° C شاكر لمدة 3-4 ساعة أو حتى OD ₆₀₀ ما بين 0.4 و 0.8، عندما الخلايا جاهزة للتحميل إلى غرف للتصوير.

4. إعداد تدفق غرفة الشرائح

1. يقطعورقة من فيلم البارافين في قطعة 4 في نطاق واسع و 7 في فترة طويلة.
2. ضع شريحة المجهر القياسية بالطول على عرض 4 بوصة من فيلم البارافين والتفاف الفيلم حول الشريحة 3-4 مرات بحيث تغطي الشريحة في الفيلم الذي هو 3-4 طبقات سميكة. اضغط على طبقات معا لضمان وجود ختم معقول؛ وهذا سيجعل من الاسهل للقطع. تجنب الضغط من الصعب جدا أو التسبب في الفيلم لتجاعيد.
3. قطع الفيلم البارافين على طول الحواف الخارجية من الشريحة باستخدام نظيفة الحلاقة مربع القاطع. استخدام شريحة أخرى لتقديم حافة مستقيمة لقطع.
4. قشر الزائدة فيلم خارج الشريحة العمل وتجاهل. ومداخن المتبقية من الفيلم تغطي وجها واحدا من الشريحة وسيتم استخدامها لجعل الجدران بين غرف التصوير.
5. باستخدام الشريحة الثانية كما حافة مستقيمة، وقطع طبقات فيلم مكدسة على طول محور طويل من الانزلاق الى ما يقرب من عشرة اقسام، كل منها 2-4 ملم في العرض.
6. قطع طبقات فيلم البارافين مكدسة عموديا لالتخفيضات في الخطوة 4.5، وعلى طول محور قصيرة من الشريحة، لخلق شرائح 2-4 ملم في العرض، 23-24 ملم في الطول، و3-4 طبقات سميكة.
7. قشر قطع شرائح باستخدام شفرة حلاقة في زاوية 45 درجة. باستخدام ملقط، بالتساوي توزيع شرائط قطع الفيلم على شريحة المجهر نظيفة لإنشاء أرقام المطلوب من الغرف. تصل إلى 3 غرف (مع 4 شرائح فيلم البارافين) يمكن إنشاؤها على شريحة واحدة.
8. وضع ساترة واحدة على رأس شرائط السينما ونقلها إلى موقف بالملقط.
9. ضع الشريحة مستعدة، ساترة يصل، على موقد وضعت في ~ 95 درجة مئوية (وهذا هو تقريبا متوسطة منخفضة الإعداد على معظم سخانات). حرارة الشريحة حتى يتم شفافة شرائط فيلم (حوالي 3 دقائق)، ثم ختم الشرائح وساترة معا عن طريق الضغط بلطف على ساترة مع ملاقط.
   ملاحظة: من المهم أن الصحافة الوحيد على مناطق ساترة التي هي مباشرة فوق شرائح فيلم البارافين، كما خدش مناطق فوق جيمكن hambers يقلل من جودة الصورة. والحرص على عدم ارتفاع درجة حرارة الشريحة. المتبخرة إرادة فيلم معطف داخل الغرفة مع فيلم مسعور الذي يمنع الخلايا من الالتصاق.
10. استخدام ملقط لإزالة الشريحة من موقد (سوف الشريحة تكون ساخنة) وضعه جانبا لتبرد مع الجانب ساترة مواجها لها. كما يبرد الشريحة، فإن الفيلم يعود إلى الأبيض، تلوين مبهمة.
    ملاحظة: عند هذه النقطة، الشرائح جاهزة للتحميل مع خلايا الخميرة مثقف. شرائح إضافية يمكن إدخالها على هذه النقطة وتخزينها في مكان نظيف وجاف لفترة غير محددة من الزمن.

5. خلايا الخميرة تحميل في إعداد تدفق غرفة الشرائح

1. ذوبان الجليد في المجمدة، 200 ميكرولتر قسامة من كونكانافالين ألف (2 ملغ / مل في العقيمة DIH ₂ O).
2. إضافة ما يقرب من 100 ميكرولتر من إذابة كونكانافالين ولكل غرفة من الشريحة مستعدة قبل pipetting في واحدة من نهايات مفتوحة. إضافة ما يكفي من كونكانافالين A لملء الغرفة. لهذا لياليفاتر، سيتم سحب كونكانافالين A من خلال غرفة عبر العمل الشعري.
3. تعليق الشريحة، ساترة إلى أسفل، بين اثنين من الرفوف microfuge أنبوب أو الأقلام لمدة 5 دقائق للسماح للكونكانافالين والتمسك ساترة (أي غرفة).
4. العودة الشريحة إلى موقف ساترة يصل. غسل الغرفة مع 2X حجم الغرفة (تحديدها في الخطوة 5.2 أعلاه؛ ما يقرب من 200 ميكرولتر) من المتوسط الشامل الاصطناعية لإزالة كونكانافالين A.
   1. تدفق المتوسطة من خلال غرفة، وذلك باستخدام إما زاوية منشفة ورقية أو ورق الترشيح في نصف مطوية رسم السوائل من طرف واحد من الغرفة في حين pipetting لفي وقت واحد السائل النقي إلى الآخر. بدلا من ذلك، استخدام الشافطة فراغ لرسم بعناية السوائل من طرف واحد في حين pipetting لسائل جديدة في الآخر.
5. خلايا الحمل التي تتدفق 2X حجم الغرفة (حوالي 200 ميكرولتر) من تعليق خلية (من الخطوة 3.4) باستخدام metho تدفق موجهةد موضح في الخطوة 5.4.1.
   ملاحظة: إن الهدف هو صورة طبقة واحدة من الخلايا في ساترة. ولذلك، فمن المهم لتحميل تركيز خلايا صغيرة بما يكفي أنهم لا تتراكم فوق بعضها البعض، ولكن كبيرة بما يكفي أن الخلايا كافية موجودة في الميدان لجمع أكبر قدر ممكن من البيانات في الحصول على الصور. تركيز الأمثل للخلايا داخل غرفة يمكن أن تختلف وينبغي أن تحدد تجريبيا. لزيادة تركيز خلايا في غرفة التدفق، بلطف بيليه زراعة الخلايا في 1000 x ج لمدة 2 دقيقة وإزالة بعض من طاف. لتقليل تركيز الخلايا، إضافة المتوسطة كاملة الاصطناعية جديدة لتعليق الخلية. تركيز خلايا يمكن تقييم بعد خطوة 5.7 (أدناه) بتفقد الغرفة على المجهر مرحلة التباين. عند هذه النقطة، يمكن إضافة خلايا إضافية إلى الغرفة التي تتدفق في مزيد من التعليق الخلية. ومع ذلك، والحد من كثافة الخلايا في هذه المرحلة لم يكن ذلك ممكنا، وأفضل طريقة لتحقيق عن طريق تحميل غرفة جديدة مع تعليق خلية المخفف.
6. تعليق الشريحة ساترة إلى أسفل، كما هو موضح في الخطوة 5.3، لمدة 10 دقيقة للسماح للخلايا على الانضمام إلى ساترة.
7. طرد أي خلايا unadhered التي تتدفق من خلال 4X حجم الغرفة (حوالي 400 ميكرولتر) من المتوسط ​​الشامل الاصطناعية. هذا سيقضي على خلايا التعويم الحر في الغرفة، التي يمكن أن تلوث الحصول على الصور.
8. بعناية تجف نهاية كل من غرفة مع زاوية نظيفة من منشفة ورقية، وبذلك يصبح الغضروف المفصلي إلى حافة ساترة.
9. ختم كل نهاية الغرفة مع دافئ (75 درجة مئوية) تسرب (على سبيل المثال، VALAP، أجزاء متساوية الفازلين، شمع الصوف، وشمع البارافين).
   ملاحظة: عند هذه النقطة، الشريحة مستعدة للصورة. الدوائر يمكن تصوير لمدة تصل إلى 9 ساعات، اعتمادا على كثافة الخلايا في كل غرفة. الخلايا سوف تنتج ثاني أكسيد الكربون (CO ₂₎ مع مرور الوقت، والتي سوف تخلق تدريجيا الفقاعات التي تحل محل الخلايا.

الحمار = "jove_title"> 6. الحصول على الصور

1. جلب الشريحة لمجهر مقلوب مجهزة الهدف NA 1.45 100X CFI خطة آبو، مرحلة كهرضغطية، القرص الغزل وحدة الماسح الضوئي متحد البؤر، ليزر إضاءة، وكاميرا EMCCD. الحفاظ على درجة حرارة مرحلة في درجة حرارة الغرفة (25 ° C) خلال الاستحواذ.
   ملاحظة: الفتحة العددية عالية يسمح لدقة أكبر صورة، والمرحلة كهرضغطية تمكن عالية السرعة اكتساب ض المكدس. متطلبات المجهر الدنيا هي الهدف 100X، ليزر إضاءة، والكاميرا EMCCD.
2. جعل الخلايا في التركيز. ضمان أن حقل اكتساب ديه على الأقل 5-6 خلايا عنقودية معا من خلال البحث الشريحة للخلايا تجميعها معا.
   ملاحظة: على الرغم من أنه ليس من الضروري أن الصورة أكثر من خلية واحدة في وقت واحد، التصوير خلايا متعددة في نفس المجال يحسن كفاءة الحصول على البيانات دون المساس بجودة البيانات. ومع ذلك، فمن الأهمية بمكان أنالخلايا على متن الطائرة الاتصال نفسه وليس مكدسة فوق بعضها البعض.
3. برمجة اكتساب متعدد الأبعاد لجمع متعددة ض سلسلة مع مرور الوقت.
   1. ضبط إعدادات ضمن إعدادات شراء نشطة لما يلي: إجمالي Z-عمق = 6 ميكرون، ليشمل في خلية الخميرة بأكملها؛ Z-خطوة حجم = 300 نانومتر، لتعظيم جمع الضوء من دون الإفراط. مجموع المدة الزمنية = 10 دقيقة. الساعة فترات = Z-سلسلة كل 4 ق. ووقت التعرض = 90 مللي لكل ض الطائرة.
      ملاحظة: الساعة التعرض الأمثل سوف تختلف اعتمادا على الكاميرا، ومصدر ضوء الإثارة، وعوامل أخرى. بشكل عام، فإن الوقت الأمثل التعرض أن يكون الحد الأدنى من الوقت اللازم لتحقيق نسبة 3: 1 من إشارة من الأنابيب الدقيقة نجمي المسمى GFP إشارة من السيتوبلازم على أساس القيم بكسل يقاس EMCCD.
4. تبدأ عملية الاستحواذ عن طريق النقر 'تشغيل'. السماح ليتم تشغيله لمدة 10 دقيقة كاملة. حفظ البيانات كصورةسلسلة (و tiff أو .nd2).
5. حدد حقل جديد إلى صورة داخل غرفة وكرر الخطوات من 6،2-6،4.
   ملاحظة: A غرفة واحدة ينبغي أن تسفر بين 15 و 20 حقلا من الخلايا، اعتمادا على كثافة الخلايا داخل الغرفة. سوف كثافة الخلية أعلى تسفر مجموع الحقول أقل، كما CO ₂ في غرفة سيبني بشكل أسرع.

تحليل 7. صورة

1. فتح ملف الصورة في يماغيج ( https://imagej.nih.gov ) باعتباره hyperstack باستخدام تنسيقات الحيوي المستورد المساعد.
   1. فتح يماغيج واسحب كومة صورة تم الحصول عليها من القسم 6 مباشرة على لوحة التحكم. سيبدأ تنسيقات الحيوي المستورد تلقائيا. حدد "موافق" لتحميل كومة الصورة كما hyperstack.
      ملاحظة: "بيو صيغ خيارات استيراد" سوف موجه فتح وضمان أنه في ظل "المكدس الشخصية" القسم "، عرض كومة مع:" يتم تعيين إلى "Hyperstack". و "المكدس النظام:" من المقرر أن "XYCZT".
2. طي كل Z-سلسلة إلى أقصى كثافة، والإسقاط 2-الأبعاد باستخدام وظيفة المشروع Z.
   1. حدد "صورة" القائمة، و "المكدس" القائمة الفرعية، و "المشروع Z" الميزة. حدد "إسقاط الحد الأقصى" من القائمة المنسدلة وانقر فوق "موافق".
3. تطبيق عامل تصفية متوسط ​​إلى المكدس صورة للحد من الضوضاء التنقيط عن طريق اختيار "عملية" القائمة، و"الفلاتر" القائمة الفرعية، و "وسيطة" الميزة. أدخل 2.0 بكسل في مربع نصف القطر وانقر على زر "موافق".
4. تحديد الخلايا ما قبل طور الصعود في هذا المجال.
   ملاحظة: وتتميز هذه من قبل براعم متوسطة الحجم والمغزل الإنقسامية القصير، 1-1،5 ميكرومتر في الطول (الشكل 1؛ النقاط رأس السهم إلى المغزل الإنقسامية قصيرة). الخلايا في هذه المرحلة هي مثالية لتحليل ديناميات أنيبيب لأنها عادة ما تظهر فقط لا الحصرالأنابيب الدقيقة نجمي ث المنبثقة القطبين المغزل ^7. يمكن التعرف على الأنابيب الدقيقة نجمي كما خيوط الخطية التي يحمل موحدة كثافة إشارة GFP من نهاية ناقص، في SPB، وحتى نهاية زائد، في السيتوبلازم.
5. بدءا من timepoint الأول من سلسلة صورة، استخدم أداة سطر مجزأة لرسم خط على طول أنيبيب نجمي واحد، من نهاية ناقص، وتقع عند تقاطع بين أنيبيب نجمي والأنابيب الدقيقة المغزل وصفت بشكل مكثف، وحتى نهاية زائد ، والتي هي في السيتوبلازم (انظر الخطوط الحمراء في الشكل 1). انقر نقرا مزدوجا على نهاية أنيبيب لاستكمال خط مجزأة.
6. تسجيل القياس في جدول النتائج باستخدام "التدبير" الميزة عن طريق الضغط على زر "M" على لوحة المفاتيح.
   ملاحظة: ميزات إضافية، مثل كثافة الرمادية، يمكن تسجيلها من خلال تحديد القياسات في القائمة "تحليل" و "تعيين القياسات" القائمة الفرعية.
7. تقدم إلى timepoint المقبل إما عن طريق النقر على السهم الأيمن في شريط Z-المنزلق أو الضغط على "./>" مفتاح على لوحة المفاتيح. كرر الخطوات من 7.5 و 7.6 بالنسبة لجميع timepoints في تسلسل الصور.
8. نسخ البيانات من جدول النتائج ولصقها في جدول بيانات. حفظ البيانات عن طريق اختيار "حفظ باسم".
   ملاحظة: وسوف تشمل هذه القياسات عدة قيم، ولكن أهم القيم هي شريحة، مما يدل على timepoint في هذه السلسلة، وطول، مما يدل على طول الخط (أي أنيبيب النجمي). الأعمدة التي تحتوي على قياسات أخرى (على سبيل المثال، منطقة، يعني قيمة بكسل، زاوية، وغيرها) يمكن أن تكون إما الاحتفاظ أو التخلص منها.
9. إنشاء عمود جديد في جدول البيانات عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن وباستخدام وظيفة "إدراج". إدخال الوقت (ق) من كل timepoint.
10. إنشاء مؤامرة XY مبعثر من طول أنيبيب (ميكرون) بوصفها وظيفة من الزمن (ق) باستخدام "إدراج الخطالرسم البياني "الميزة، تحديد قياسات الطول مثل" Y "والعمود الوقت باسم" اكس "
    1. تحديد مناطق البلمرة، والتحلل، وقفة من قبل تبحث عن التغييرات الإيجابية والسلبية في الطول مع مرور الوقت على مؤامرة مبعثر من الخطوة 7.10.
       ملاحظة: أحداث البلمرة زيادة طول أنيبيب بنسبة 0.5 ميكرون على الأقل في ما لا يقل عن 3 timepoints وتناسب الانحدار الخطي مع R ² ≥ 0.9 والقيمة R> 0 (1B الشكل وD، النقاط الخضراء). أحداث التحلل انخفاض طول أنيبيب بنسبة 0.5 ميكرون على الأقل في ما لا يقل عن 3 timepoints وتناسب الانحدار الخطي مع R ² ≥ 0.9 والقيمة R <0 (1B الشكل وD، ونقاط الوردي). أحداث وقفة منفصلة عن البلمرة والتحلل. وتعرف توقف كما صافي التغيرات في طول أنيبيب أقل من 0.5 ميكرون عبر ما لا يقل عن 3 timepoints.تناسب الانحدار الخطي مع القيمة R بين -0.4 و 0.4. ويكون منحدر لا تختلف إحصائيا من الصفر، كما هو محدد من قبل F-الاختبار.
    2. استخدام مؤامرة مبعثر كدليل، وتحديد أقسام وقت التغيير طول ايجابية وتسليط الضوء عليها في اللون الأخضر. تسليط الضوء على مناطق وقت التغيير طول سلبي في اللون الوردي.
    3. حساب الانحدار الخطي لكل أبرز القسم وتسجيل R- وR ² -value لكل مقطع في الأعمدة الأقرب إلى المناطق. تصنيف كل المنطقة الملونة إما الحدث البلمرة أو حدث التحلل.
11. حساب معدلات البلمرة بقسمة صافي التغير في طول من التغيير في الوقت المناسب لكل حدث نمو. تسجيل هذه النتائج في العمود المجاور للقيم الانحدار الخطي من الخطوة 7.10.3.
12. حساب معدلات التحلل بقسمة صافي التغير في طول من التغيير في الوقت المناسب لكل shrinkinز الحدث. تسجيل هذه النتائج في العمود المجاور لقيم معدل البلمرة من الخطوة 7.11.
13. احسب تردد كارثة بقسمة عدد من التحولات البلمرة إلى التحلل من الوقت الكلي لجميع الأحداث نمو ^13. تسجيل هذه النتائج في العمود المجاور لقيم معدل التحلل من الخطوة 7.12.
14. احسب تردد الإنقاذ بقسمة عدد من التحولات التحلل إلى البلمرة في الوقت الكلي لجميع الأحداث انكماش ^13. تسجيل هذه النتائج في العمود المجاور للقيم تردد كارثة من الخطوة 7.13.
15. حساب dynamicity بقسمة مجموع القيمة المطلقة لجميع التغييرات طول من إجمالي مدة الحصول على الصور، وتحسب في خطوة 7.10.1، وضرب من قبل 27.0833 للحصول مفارز تويولين في الثانية ^14. تسجيل هذه النتائج في العمود المجاور لفال تردد الإنقاذUES من الخطوة 7.14 وحفظ جدول النتائج.
    ملاحظة: من الممكن لأتمتة عملية تحليل موضح في الخطوات 7،10-7،15 باستخدام برنامج حسب الطلب (. Estrem، وآخرون، وقدمت مخطوطة). تم تصميم هذا البرنامج لتحديد فترات البلمرة والتحلل في قياسات طول باتباع المعايير المفصلة أعلاه.

النتائج

قياس ديناميات أنيبيب في الخلايا الحية الخميرة يوفر أداة مقنعة لتقييم مدى الطفرات في الجينات ترميز المنظمين أنيبيب أو تويولين مفارز البلمرة تأثير ومعدلات التحلل، وكذلك وتيرة الانتقال بين هذه الدول. الشكل (1) يعرض سلسلة زمنية من ديناميات أن?...

Discussion

ويقدم نموذج الخميرة في مهدها المزايا الرئيسية لجمع قياسات عالية الدقة للديناميات أنيبيب في مكان في الجسم الحي، بما في ذلك القدرة على الأنابيب الدقيقة صورة واحدة مع مرور الوقت والقدرة على التعامل مع tubulins والمنظمين أنيبيب باستخدام أدوات علم الوراثة الخميرة.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOB (dropout bases)	Sunrise science	1650
CSM-Leu	Sunrise science	1005
Agar	Ameresco	N833
100 mm polystyrene plates	Fisher Scientific	FB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  in sterile DiH2O	Sigma-Aldrich	D7656	resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Synthetic Complete Media	Sunrise science	1459-100
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	L7647	resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-1
Microscope Coverslips	Fisher Scientific	12-541-B
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	paraffin film
VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin)			melt at 75 ºC before use
forceps	Fisher Scientific	16-100-106
Poyethylene glycol (PEG) 3350	Sigma-Aldrich	202444
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope
Ti E inverted Perfect Focus microscope	Nikon Instruments	MEA53100
1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective	Nikon Instruments	MRD01905
Piezo electric stage	Physik Instrumente	P-736
Spinning disk scanner	Yokogawa	CSU10
Laser combiner module	Agilent Technologies	MCL400B
EMCCD camera	Andor Technology	iXon Ultra 897
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elements software	Nikon Instruments	MQS31100
Microsoft Excel software	Microsoft
MATLAB software	MathWorks, Inc
ImageJ64	NIH		Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Bio-Formats Importer plug-in	Open Microscopy Environment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1		pSK1050	reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)