الرقم الهيدروجيني "الكمي داخل الخلايا" الضوئية في Epithelia نبيب Malpighian melanogaster المورفولوجية مع الرقم الهيدروجيني "الفلورسنت وراثيا" ترميز مؤشر

Summary

يمكن تقييم النقل أيون الخلوية غالباً عن طريق مراقبة درجة الحموضة داخل الخلايا (الأس الهيدروجيني_أنا). وراثيا مرمز الأس الهيدروجيني-المؤشرات (جيفيس) توفر الكمي البصري لدرجة الحموضة داخل الخلايا في الخلايا سليمة. تفاصيل هذا البروتوكول التحديد الكمي لدرجة الحموضة داخل الخلايا عن طريق الخلوي السابقين فيفو العيش-التصوير للأنابيب مالباييان من melanogaster المورفولوجية مع فري، زائفة-راتيوميتريك وراثيا ترميز مؤشر الرقم الهيدروجيني.

Abstract

النقل أيون الظهارية أمر حيوي للتوازن أيون النظامية، فضلا عن الحفاظ على التدرجات الكهروكيميائية الخلوية الأساسية. PH داخل الخلايا (درجة الحموضة_أنا) يتأثر بالعديد من أيون الناقلين وهكذا رصد درجة الحموضة_أنا أداة مفيدة لتقييم نشاط الناقل. الحديثة "وراثيا ترميز" الأس الهيدروجيني-(جيفيس) توفر المؤشرات الضوئية الكمي لدرجة الحموضة_وأنا في خلايا سليمة في نطاق الخلايا وسوبسيلولار. يصف هذا البروتوكول الكمي في الوقت الحقيقي للأس الهيدروجيني الخلوية_أنا تنظيم في الأنابيب Malpighian (MTs) من melanogaster المورفولوجية عن طريق السابقين فيفو العيش-تصوير فري، جيفي زائفة-راتيوميتريك مع فك مناسبة جداً لتعقب التغييرات الأس الهيدروجيني في سيتوسول. يطير الكبار المستخرجة MTs تتألف من فروع متميزة وظيفيا وشكليا من طبقة وحيدة الخلية ابيثيليا، ويمكن أن تكون بمثابة نموذجا موجوداً وتتبعها وراثيا للتحقيق في النقل الظهارية. جيفيس تقدم العديد من المزايا التقليدية الأصباغ الفلورية حساسة لدرجة الحموضة واقطاب الأيوني الانتقائي. يمكن تسمية جيفيس السكان خلية متميزة شريطة توافر عناصر المروج المناسبة. هذه العلامات مفيدة بشكل خاص في السابقين فيفو، في فيفو، و في الموقع الاستعدادات، التي أصلاً غير متجانسة. كما تسمح جيفيس الكمي pH_i في أنسجة سليمة مع مرور الزمن دون الحاجة لتخريج المعاملة أو الأنسجة صبغ المتكررة. العيب الرئيسي من جيفيس الحالي هو الميل إلى تجميع في تضمينات سيتوسوليك استجابة لتلف الأنسجة وبناء التعبير المفرط. وأظهرت أوجه القصور هذه، وحلولها، ومزايا جيفيس المتأصلة في هذا البروتوكول من خلال تقييم للنقل بروتون (H⁺) باسولاتيرال في الخلايا الرئيسية وتلعبه متميزة وظيفيا ذبابة المستخرجة النظام التجاري المتعدد الأطراف. التقنيات وتحليل ووصف القابلة للتكييف وفقا لمجموعة متنوعة من الأعمال التحضيرية الفقاريات واللافقاريات، ويمكن تحجيمها تطور المقايسة من تدريس مختبرات لتحديد معقدة لايون الجريان عبر الناقلين محددة.

Introduction

والهدف من هذا البروتوكول هو وصف التقدير الكمي لدرجة الحموضة داخل الخلايا (pH_i) باستخدام ترميز وراثيا الأس الهيدروجيني-مؤشر (جيفي) وتبين كيف يمكن استخدام هذا الأسلوب لتقييم باسولاتيرال ح⁺ النقل في نموذج حشرة (د ميلانوجاستير) هيكل الكلوي، أنبوب مالباييان (طن متري). النظام التجاري المتعدد الأطراف بمثابة أجهزة مطرح ذبابة الفاكهة وتتشابه وظيفيا كليون الثدييات في عدة نواح رئيسية¹. يتم ترتيب النظام التجاري المتعدد الأطراف كأزواج 2 من الأنابيب (الأمامي والخلفي) في الصدر والبطن من الطاير. يتألف أنبوب الظهارية خلية واحدة لكل طن متري النشط أيضي الخلايا الرئيسية مع متميزة قمي (لومينال) والأقطاب باسولاتيرال (هيموكول)، فضلا عن الخلايا النجمية المقحم. النظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامية تتكون من 3 شكلياً، ووظيفيا، وشرائح متميزة تنمويا، لا سيما الأولى المتوسعة الجزء والجزء الانتقالي الافرازية الجزء الرئيسي، الذي ينضم إلى الحالب². على المستوى الخلوي ويتم إنجاز النقل أيون عبر الظهارية في التجويف غشاء البلازما قمي الخامس-ATPase³ ومبادل قلوي-معادن/ح⁺ ، فضلا عن باسولاتيرال نا⁺-ك⁺-أتباسي⁴، القنوات إلى الداخل-مقوم ك^{+ 5}غ⁺-مدفوعة Cl⁻/HCO⁻ ₃مبادل (NDAE1)⁶، و Na⁺-ك⁺-2 Cl⁻ كوترانسبورتير (نككك؛ Ncc69)⁷، بينما الخلايا النجمية التوسط Cl^– ، ونقل المياه^8،9. ويوفر هذا النظام الفسيولوجية المعقدة لكن موجوداً فرصاً ممتازة لتحقيق آليات النقل أيون الذاتية عندما يقترن toolsets الجينية والسلوكية المتنوعة من المورفولوجية.

وكان الأساس المنطقي لهذا البروتوكول لوصف نظام طيع وراثيا لدراسة النقل أيون الظهارية مع إمكانات التكامل من الخلية إلى السلوك وتصدير أدوات لنظم نموذجية أخرى. التعبير عن فري¹⁰، جيفي المستمدة من مزيج من الأخضر حساسة لدرجة الحموضة دائرة البروج فائقة فلورين^11،12 (SEpH) ومشري غير متحسسة للأس الهيدروجيني الأحمر¹³، في النظام التجاري المتعدد الأطراف يسمح التحديد الكمي للنقل ح⁺ في الخلايا طن متري واحد من خلال ارتفاع ك⁺/nigericin المعايرة تقنية¹⁴. كما نقل العديد من الناقلين أيون مكافئات ح⁺ ، التحديد الكمي لدرجة الحموضة داخل الخلايا_وأنا بمثابة تمثيل وظيفية لحركة أيون عبر مجموعة متنوعة من الناقلين. كما يوفر النظام النموذجي المورفولوجية طن متري أدوات الوراثية قوية في التحوير الأنسجة على حدة¹⁵ والجيش الملكي النيبالي التدخل ([رني])¹⁶ التعبير، التي يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع التصوير بالهاتف الخلوي وفحوصات الجهاز الجامع^{17 , 18 , 19} وظيفة أنبوب لإنشاء مجموعة أدوات قوية مع التكامل الرأسي من الجزيئات للسلوك. وهذا يقف في المقابل للعديد من البروتوكولات الأخرى لتقييم البيولوجيا الظهارية، كما اعتمدت تاريخيا هذه القياسات على معقدة وشاقة والتشريح الدقيقة والمتطورة من أقطاب الأيوني الانتقائي^20،21، والأصباغ غالية حساسة لدرجة الحموضة²² مع متطلبات تحميل التقييدية والفقيرة خصوصية الهاتف الخلوي في الأنسجة غير متجانسة. وقد استخدمت جيفيس لقياس درجة الحموضة_وأنا في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا²³على نطاق واسع. العمل في وقت مبكر في استغلال الملازمة للأس الهيدروجيني-الحساسية من الأخضر الفلورسنت البروتين (التجارة والنقل) لرصد درجة الحموضة_أنا في الخلايا الظهارية مثقف²⁴ ولكن خلال العقدين الماضيين شهدت جيفيس المستخدمة في الخلايا العصبية²⁵،²⁶من إطلاق، الفطريات²⁷ ، والخلايا النباتية²⁸. مزيج احتمال استهداف الخلوية الوراثية بنيات من خلال نظام التعبير GAL4/UAS¹⁵ وإمكانية الوصول إلى الفسيولوجية المورفولوجية طن متري جعل هذا إعداد مثالية للتحقيقات للأس الهيدروجيني_أنا التنظيم والنقل أيون الظهارية.

تنظيم درجة الحموضة_أنا درست على مدى عقود وأمر حيوي للحياة. ويوفر إعداد طن متري متطورة نموذج قوي تدريس علم وظائف الأعضاء تنظيم الأس الهيدروجيني_أنا ولكن أيضا إجراء التحقيقات pH_i التنظيم السابقين فيفو و في فيفو. هذا البروتوكول يصف التحديد الكمي لحركة ح⁺ عبر الغشاء باسولاتيرال للخلايا الظهارية من المورفولوجية استخدام NH₄حمض نبض Cl تحميل تقنية²¹مليون طن، ولكن كمؤشر الرقم الهيدروجيني-وراثيا ترميز، هذه الأساليب وإطارها النظري يمكن تطبيقها على أي إعداد قابلة ترانسجينيسيس وتصوير العيش.

Protocol

كافة الخطوات في هذا البروتوكول الامتثال للمبادئ التوجيهية استخدام الحيوان "كلينيك" (روتشستر، مينيسوتا).

1-يطير تربية

1. رفع الذباب وتقاطع مجموعة وفقا لمعيار تربية²⁹.
   ملاحظة: التعبير مراسل الفلورسنت بنظام GAL4/UAS متناسبة مع درجة الحرارة وهكذا تربية درجة الحرارة يمكن تعديلها لتغيير مستوى التعبير. بينما مستويات عالية من التعبير غالباً ما تؤدي إلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء أفضل هذا الشرط يرتبط أيضا بزيادة المجاميع سيتوسوليك وأورجانيلار عند استخدام التجارة والنقل للانصهار الأحمر نيون البروتين (RFP) يبني مثل فري^{10، 30،31}. إذا كان التجميع أمر لا مفر منه، التقدير الكمي لا يزال من الممكن عن طريق إجراء نقطة التحديدات في كل تجربة وتطبيع البيانات أن يقابل نسبة الأسفار من 1.0 إلى درجة الحموضة_أنا 7.0 (راجع الخطوة 7، 4 مذكرة بشأن معايرة أدناه).
2. تقاطع مجموعة من الذكور³² متماثل كبار GAL4متماثل الإناث العذراء¹⁰ UAS-فريو متماثل c724-GAL4² الذكور إلى الإناث العذراء UAS-فري متماثل السماح بتصوير لدرجة الحموضة_وأنا في الخلايا الرئيسية والخلايا النجمية للنقل المتعدد الوسائط، على التوالي. 6 مكان UAS-فري الإناث مع الذكور GAL4 3 في قارورة جديدة من الأغذية والإجازات رفيقه في 28 درجة مئوية.
   ملاحظة: ينبغي أن يكون يرقات واضحا داخل د 4 والكبار ستبدأ اكلس حول يوم 10.
3. جمع الذباب الإناث عند اكلوسيون وتوضع جانبا لسن د 10 في 28 درجة مئوية.
   ملاحظة: يمكن ضبط توقيت التجريب لتتوافق مع أي فحوصات السلوكية التقييدية (مثل رامزي إفراز الإنزيم^،من¹⁷¹⁹) التي سوف ترتبط بتصوير pH داخل الخلايا الحية. يمكن استخدام الذباب الذكور ولكن غالباً ما تكون الأنابيب من الإناث أكبر حجماً وأكثر قوة.

2-إعداد الشرائح بولي-L-يسين.

1. رسم حدود 40 × 20 ملم مع قلم PAP مسعور حول الجزء العلوي من الشرائح القياسية 75 × 25 مم وتوضع جانبا لتجف لمدة 15 دقيقة في استخدام الرايت كوفيرسليبس كبيرة إذا كانت الشرائح غير متوافقة مع التصوير البصريات.
2. نقل 2 مل محلول بولي-L-يسين (PLL) 0.01 ٪ الأسهم على كل شريحة وتوضع جانبا ح 1 في الرايت
3. إزالة PLL الزائدة مع ماصة. حفظ الحل في قنينة 50 مل مخروطية لاستخدامها في المستقبل. مخزن في 4 درجات مئوية.
4. نضح أي حل المتبقية مع خط فراغ. قم بتشغيل سطر فراغ على سطح الشريحة بأكملها لضمان أن أي حل لا يزال على الشرائح.
5. تعيين الشرائح جانبا ح إضافية 1 RT قبل الاستخدام. تخزين الشرائح الجافة في RT لتصل إلى شهر واحد في كتاب شرائح قياسية.

3-إعداد تشريح طبق وقضبان الزجاج

1. إضافة 0.5 مل عامل علاج الاستومر إلى 4.5 مل الاستومر قاعدة في البوليسترين 35 × 10 مم طبق بيتري في RT لإنتاج بعمق من 5 مم-ميكس مع تلميح ماصة المتاح. السماح الاستومر لعلاج O/N في الرايت
   ملاحظة: يجب أن يكون الاستومر واضحة وخالية من الفقاعات. قد يتيسر إزالة الفقاعات بإبقاء لوحات الاستومر في جرة فراغ لمدة 10-15 دقيقة بعد سكب.
2. يعقد قضيب زجاج قطرها 5 ملم بين يديه وتذوب وسط القضيب فوق موقد بنسن مضاءة حين سحب الغايات عن بعضها البعض. كالزجاج يذوب سحب أكثر بسرعة لإنتاج رقيقة (0.1 مم) ورمح مدبب (الشكل 1).
   ملاحظة: بزاوية 45 درجة في شأنك غالباً مفيدة في التعامل مع الأنابيب. يمكن تحقيق هذا عن طريق خفض يدا واحدة كما يتم سحبها شأنك (انظر الشكل 1).
3. كسر رمح رقيقة في الوسط مع الجانب كليلة شفرة الحلاقة المصنوعة من الصلب الكربوني واحد ذو حدين. فحص نهاية القضيب تحت نطاق تشريح للتأكد من الكسر نظيفة رقيقة.

الشكل 1: اختﻻق قضبان الزجاج للتعامل مع الأنابيب مالباييان.
أ-ه. عملية التسخين وسحب قضيب زجاج لإنتاج تفتق وزاوية مناسبة للتعامل مع "الأسهم mts." تدل على اتجاه وحجم القوة التي يمكن تطبيقها. و-صورة فوتوغرافية لأداة الزجاج ملفقة على نحو ملائم. شريط مقياس = 10 مم- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

4-إعداد نظام التروية والحلول

ملاحظة: أنظمة نضح تختلف حسب الشركة المصنعة. ويستند هذا البروتوكول حول الجاذبية 8-قناة مفتوحة خزان مع منظم معدل تدفق إدخال وتدفقا يحركها من فراغ، ولكن طريقة تركيب النظام التجاري المتعدد الأطراف كما هو موضح هنا يمكن تكييفها للعمل مع أي نظام التروية.

1. إعداد الحلول التالية:
   1. الكوة شنايدر المتوسطة (مل 40 إلى 50 مل قارورة مخروطية الشكل) ومخزن في 4 درجات مئوية.
   2. إعداد الحلول (أي الحشرات "فوسفاتيبوفيريد المالحة" (المتكاملة) ومتكاملة مع NH₄Cl) في الرايت حسب الحاجة ووفقا الجدول 1). حلول الحارة ل RT قبل استخدامها في يوم تجربة.
      ملاحظة: المتكاملة ومتكاملة مع 40 مم NH₄Cl يمكن إعدادها بكميات كبيرة (1 لتر أو أكثر) وتخزينها في 4 درجات مئوية.
   3. إعداد حلول المعايرة 8 في حجم 500 مل على درجة الحموضة = 5.0 و 6.0، 6.5، 7.0، 7.3، 7.6، 8.0 و 9.0 كما هو مبين في الجدول 1 ومخزن في 4 درجات مئوية. ضبط الأس الهيدروجيني لكل حل بالمعايرة مع N-الميثيل-د-جلوكاميني (نمدج) و HCl.
   4. اليوم من تجارب، الحارة مختبرين 5 مل من حلول المعايرة على RT وإضافة حل نيجيريسين الأسهم (20 ملم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])) لإنتاج بتركيز نهائي 10 ميكرون.
      تنبيه: تعامل مع نيجيريسين مع القفازات. التعامل مع جميع المعدات التي تأتي على اتصال نيجيريسين حسب المتاح. نيجيريسين ما زال على الزجاج والبلاستيك وسيتم حل وسط الاستعدادات البيولوجية إذا تم إعادة استخدام المعدات.
2. نظام التروية:
   1. رئيس الوزراء نظام التروية بتعبئة جميع خزانات مع ddH₂س (الشكل 2). فتح قنوات واحد في وقت واحد للسماح لكافة بنود الدانية إلى منظم معدل التدفق لملء.
      ملاحظة: قد يكون من الضروري لمسح جوي في الخطوط بفتح القناة المتوقفة واستخدام المكبس لتدفق محرك الأقراص من الخزان.
   2. 2 القنوات المفتوحة وتسمح ddH₂س لاستنزاف. بمجرد الخزانات الفارغة تقريبا، ملء الخزان الأولى مع متكاملة والخزان الثاني مع NH₄ستوجز نابض Cl. تعيين معدل التدفق إلى الحد الأقصى مع الجهة المنظمة لمعدل التدفق والسماح لكل حل بالتدفق لمدة 1 دقيقة لملء الخطوط البعيدة، ثم وقف التدفق (الشكل 2).
   3. موقف 2 مجموعات لحام المشابك "يد العون" في مرحلة مجهر التصوير. وضع المشبك واحدة على كل جانب من منصة التصوير.
   4. الحرارة بدقة 0.5 بوصة القاصي قطعة من الزجاج الشعرية (القطر الداخلي 1.5 ملم، القطر الخارجي 0.86 ملم، طول 100 مم) فوق موقد بنسن. إنشاء منحنى 45 ° بالسماح للنهاية البعيدة لينحني بالجاذبية وإزالة الزجاج من اللهب حالما يتحقق الزاوية المطلوبة. كرر هذه العملية مع قطعة زجاج الشعرية ثانية.
   5. إدراج الزجاج عازمة الشعيرات الدموية في سطر في تدفق وتدفق متصل بفراغ الخط، على التوالي، وجبل لهم في "يد العون" لمواءمتها مع مرحلة التصوير المجهر (الشكل 3).

الشكل 2: نظام التروية والتصوير التكوين.
العناصر اللازمة لتقييم وظيفة النقل باسولاتيرال طن متري من خلال متزامنة الفسيولوجية يعيش fluorescence التصوير وسرعة تبادل الحلول. خطوط الغاز أظهرت اختيارية، ويسمح بالتوسع في تجارب لتقييم النقل HCO₃^– . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الشكل 3: تجارب التخطيطي تدفق جهاز نضح ل NH₄Cl النبض.
سهام تصور مسار التدفق وصمام تحويل النقاط. الحل ينتقل من الخزان إلى العينة بتدفق الجاذبية ومستمد من قاعة العينة إلى قارورة النفايات بشفط فراغ. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

5-تشريح للأنابيب مالباييان الأمامي الكبار المورفولوجية .

1. جمع الصحن التشريح وسحب الشحوم فراغ، المفرق جيدا نضح لاصقة، قطاع 4 × 2 "لختم الفيلم، قضيب الزجاج من الباب 3، شريحة المغلفة PLL من الباب 2، 2 زوجاً من #5 غرامة الملقط، ومختبرين 40 مل المتوسطة وستوجز RT المثلج شنايدر.
2. انتشار الشحوم فراغ في الشريط الختم واضغط الفاصل جيدا نضح لاصقة على الشريط الأسفل مع الشحوم معطف. تقشر مقسم جيدا نضح لاصقة ووضعه الشحوم الجانب-لأسفل على أعلى شريحة مغلفة PLL. إزالة الفاصل نضح جيدا إلى ترك العينة الفردية الآبار التي تتبع في الشحوم مسعور.
3. مكان 200 ميليلتر من ستوجز RT في الشحوم-طوق جيدا على الشريحة المغلفة PLL وتحريك الشريحة تحت ستيريوسكوبي.
4. فيال الذباب UAS-فري/كبار-GAL4 مكان في يطير فارغة وتخدير لهم على الجليد لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: هذه الطريقة من التخدير، على عكس CO₂، يضمن أن الذباب لا يذوي.
5. صب المتوسطة المثلج شنايدر في طبق تشريح واستخدام الملقط غرامة لنقل ذبابة أنثى واحدة أنيسثيتيزيد في الطبق تحت ستيريوسكوبي تشريح.
6. عقد الطاير بالصدر مع مجموعة من الملقط واستخدام أخرى بلطف قبضة الخلفي البطن. سحب فتح مؤخرة ذبابة باستخدام الملقط وباختصار، التماسات متعمدة. بمجرد المعي الخلفي مرئياً، قبضة نهاية القاصي ومجانا على القناة الهضمية والنظام التجاري المتعدد الأطراف من tracheoles الكامنة عن طريق سحب المعي الخلفي خارج الجسم عن طريق القاطرات قصيرة ومتكررة.
   ملاحظة: النظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامية والخلفية ستكون مرئية حيث يلتقي تقاطع الأمامي والمعي الخلفي من خلال الحالب. أول زوج من النظام التجاري المتعدد الأطراف تكون الإرادة الحرة يحتمل أن تكون الأنابيب الخلفي كما أنها محاصرة المعي الخلفي. يمكن أن تكون هذه تجاهل (الشكل 4 أ).
7. قرصه خارج النظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامية في الحالب مع غرامة الملقط بعد المجموعة الثانية من النظام التجاري المتعدد الأطراف خال من البطن. وهذا فصل النظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامي من القناة الهضمية وإغلاق الحالب.
8. التقاط النظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامية مجاناً مع قضيب الزجاج سحبت من انزلاق القضيب تحت الحالب أن الأنابيب تقع على جانبي. رفع النظام التجاري المتعدد الأطراف مباشرة من الحل.
9. دورة قضيب الزجاج أن النظام التجاري المتعدد الأطراف والحالب التقيد بالجانب السفلي القضيب، وانخفاض الحالب إلى أسفل داخل الشريحة. إلصاق الحالب وختم الغايات البعيدة للنظام التجاري المتعدد الأطراف عن طريق الضغط على الحالب إلى أسفل على شريحة الزجاج (الشكل 4 باء). عدم التلاعب بالنظام التجاري المتعدد الأطراف أكثر من اللازم. النظام التجاري المتعدد الأطراف ينبغي العائمة حتى في الحل مع الحالب ترتكز إلى الشريحة.
10. استخدام نهاية قضيب الزجاج غرامة لاكتساح كل أنبوب بلطف عبر سطح الشريحة. يستعدوا للقضيب ضد الشريحة لتجنب سحق أنبوب والشريحة القضيب فوق الجزء العلوي من أنبوب، تتحرك القاصي إلى الدانية، تعلق كامل طول كل أنبوب على سطح الشريحة المغلفة PLL (الشكل 4).
11. ضع الفاصل جيدا نضح لاصقة مرة أخرى على الشريحة بتشكيل صغيرة مملوءة بسائل أكثر من أنبوب المحملة.
12. وضع العينة على مرحلة المجهر. ضع التدفق وتدفق الشعيرات الدموية على مدخل ومخرج افتتاح نضح جيدا، على التوالي.
    ملاحظة: يمكن أن تترك مقسم جيدا إذا كان هو المطلوب دائرة مفتوحة التروية. في هذه الحالة يمكن أن تكون محاذاة الشعيرات الدموية تدفق وتدفق على طرفي نقيض التصوير جيدا.

6-التحقق من صحة التصوير البروتوكول والصحة

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا البروتوكول المعني مجهر مقلوب واسع المجال ابيفلوريسسينت بالتجارة والنقل (SEpH)، وطلب تقديم العروض (متشيري) عامل تصفية مجموعات (470/40 نانومتر الإثارة (السابقين)، 500 نانومتر نانومتر مزدوج اللون و 546/10 ت 590 nm الفلترات م، 565، 515 نانومتر الفلترات الانبعاثات (م) نانومتر مزدوج اللون)، 10 X/ 0.45 الهواء الهدف، كاميرا أحادية اللون لالتقاط الصور ويعيش، وبرامج التصوير. يمكن تكييفها تستقيم أي البروتوكول أو مقلوب مجهر مع عامل التصفية التلقائية التبديل بين التجارة والنقل، وطلب تقديم العروض البصرية والصورة اقتناء البرمجيات، على الرغم من أن تختلف أوقات التعرض الأمثل وشدة الضوء والمعلمات binning. في تحليل كافة، يجب أن يتم تحليل شدة الأسفار ككثافة بكسل يعني في منطقة الفائدة (العائد على الاستثمار)، بعد الطرح الخلفية في كل قناة باستخدام دوروا مع يحتوي على لا الأسفار المتاخمة للإشارة العائد على الاستثمار.

1. قم بتشغيل المجهر، ومصدر الضوء، ونظام التصوير.
2. فتح برامج التصوير المرتبطة بها.
3. ننظر من خلال العدسة وضبط التركيز يدوياً حتى يصبح التجويف MT مرئية بوضوح تحت الضوء المنقولة.
4. انقر فوق علامة التبويب "حيازة" في صورة تحليل البرامج وحدد "2 × 2" في القائمة المنسدلة "Binning" في المقطع "الحصول على الوضع".
5. إدراج مرشح كثافة محايدة 5% في مسار الضوء تقليل إضاءة الضوء والتقليل من فوتوبليتشينج.
6. انقر فوق قناة التجارة والنقل (SEpH) في قائمة "القنوات"، ثم انقر فوق "حية" لمراقبة الإشارات الفلورسنت عبر الكاميرا.
7. ضبط مربع التمرير "الوقت" لتعيين وقت التعرض أن قيم بكسل ألمع في الرسم البياني شدتها حوالي 40 في المائة من الحد الأقصى للقيمة، ثم انقر فوق "إيقاف" لإيقاف الإضاءة.
8. كرر الخطوات 6.6-6.7 في طلب تقديم العروض (مشري) القناة وتأكيد وجود الجزء الأول متسعة من MT الأمامي وغياب مشري سيتوسوليك مجاميع (يدل على تلف الأنسجة أو overexpression) (الشكل 4).
   ملاحظة: يجب أن يكون الجزء المتوسعة الواضح كما هو الجزء الأكثر الدانية من أنبوب وقطر التجويف الداخلي لهذا الجزء هو ميكرومتر ~ 20 أكبر من الجزء الانتقالية المتاخمة. 2 × 2 binning بكسل كافية في كثير من الأحيان ولكن يمكن زيادة لزيادة خفض شدة الإضاءة المطلوبة. هناك أوقات التعرض نموذجية بين 150 و 800 مللي/القناة. استخدم كالقليل من الضوء قدر الإمكان للتقليل من فوتوبليتشينج. التقليل من فوتوبليتشينج أمر حيوي لاستخدام مؤشرات fluorophore المزدوج مثل فري كما يمكن التبييض fluorophores اثنين بشكل مستقل، وبالتالي إبطال أي معايرة نسبة.
9. تمكين بروتوكول الوقت الفاصل بين تصوير بواسطة النقر فوق خانة الاختيار "السلاسل الزمنية".
10. ضبط "المدة" في القائمة المنسدلة في المقطع "السلاسل الزمنية" إلى 10 دقيقة والمنزلق "الفاصل الزمني" إلى 0 لتعيين وقت الالتقاط الإجمالي بمعدل اقتناء صورة كحد أقصى. غالباً ما يكفي الحصول على مجموع معدل 0.2 هرتز.
11. تحقق من كل من التجارة والنقل (SEpH) وخانات طلب تقديم العروض (مشري) في المقطع "القنوات".
12. فتح خط ستوجز نظام التروية بتفعيل وحدة تحكم صمام المناسبة وبدء تشغيل البروتوكول التصوير بواسطة النقر فوق "ابدأ التجربة." بعد 1 دقيقة، قم بالتبديل إلى NH₄Cl نبض الحل ل 20 s بفتح صمام المناسبة وإغلاق خط متكاملة، ثم العودة إلى متكاملة عن طريق إغلاق NH₄خط Cl وإعادة فتح صمام متكاملة. يسمح بروتوكول تصوير كامل لإكمال قبل إيقاف نظام التروية.
    ملاحظة: ينبغي أن تكشف عن تحليل الوقت الفاصل بين إشارة متشيري مستقرة وإشارة SEpH الذي يزيد من حضور NH₄Cl، ويروي عند تبييض ويتعافى تدريجيا.
13. القيام بمعايرة 2-نقطة.
    1. إزالة الفاصل جيدا إلى جانب تقشير أنه بعيداً عن الشريحة الأساسية وإزالة الشعيرات الدموية نضح والمشابك من التصوير جيدا.
    2. تطبيق 200 ميليلتر المعايرة المتكاملة (درجة الحموضة 7.4، 10 ميكرون نيجيريسين) للتصوير جيدا مع ماصة 200 ميليلتر. إزالة الحل من التصوير جيدا مع الماصة، ثم استبدل ميليلتر 200 آخر حل المعايرة. كرر هذه العملية 4 مرات لضمان تبادل الحل الكامل.
    3. احتضان الإعداد في حل المعايرة لمدة 30 دقيقة قبل التصوير. كرر البروتوكول التصوير باستخدام معلمات نفس العزم في خطوات 6.6 6.11، مع تعديل فقط 1 دقيقة للصورة التقاط.
       ملاحظة: نظام التروية والشعيرات الدموية غير مطلوبة في هذه الخطوة، وينبغي أن يكون غير متصل بالتصوير جيدا لتجنب تعريض الشعيرات الدموية إلى نيجيريسين.
    4. إضافة 200 ميليلتر المعايرة المتكاملة (pH 9.0، 10 ميكرون نيجيريسين) للتصوير جيدا مع ماصة 200 ميليلتر. إزالة الحل من التصوير جيدا مع الماصة، ثم استبدل ميليلتر 200 آخر حل المعايرة. كرر هذه العملية 4 مرات لضمان تبادل الحل الكامل.
    5. احتضان الإعداد في الحل المعايرة الثانية لمدة 10 دقائق قبل التصوير. تكرار التصوير البروتوكول كما هو الحال في الخطوة 6.13.3.
    6. استعراض المكدس الصورة التي تم التقاطها في صورة تحليل البرامج للتأكد من أن لا بكسل في قناة أما المشبعة بالنقر فوق "يعني العائد على الاستثمار" والتمرير على الرغم من المكدس الصورة مع المنزلق "الإطار" مع ملاحظة أن الإبلاغ عن أية قيم في الرسم البياني كثافة الوصول إلى الحد الأقصى لقيمة قابلة للاكتشاف. إذا كان أي إطارات تحتوي على وحدات بكسل التي تصل إلى أقصى شدتها يمكن كشفها، الحد من شدة التعرض الوقت أو الإضاءة وتكرار القسم 6.
       ملاحظة: وبمجرد إنشاء لا تقم بتغيير معلمات التصوير بين تجارب أو المعايرة إذا لم تكن نقطة معايرات لاستخدامها في إعداد كل (راجع الخطوة 8.3).
14. تحليل المكدس صورة الرسم في شدة الفلورسنت ونسبة الأسفار (SEpH/مشري) كدالة للزمن.
    1. انقر فوق "" يعني "عائد الاستثمار" وحدد الأداة شكل حر. اضغط الأيسر لتتبع طول ~ 50 ميكرون من mt. الحق انقر لإنهاء رسم العائد على الاستثمار، ثم كرر في منطقة مجاورة للنقل المتعدد الوسائط لتحديد خلفية عائد الاستثمار (الشكل 5A).
    2. انقر فوق "متوسط كثافة" تحت "القياسات." إنشاء جدول لقيم الكثافة بواسطة النقر فوق "تصدير > جدول البيانات > إنشاء."
    3. انقر على رمز الترس التكوين وإلغاء تحديد كافة المعلمات فيما عدا "تايم" و "تعني كثافة". زر الماوس الأيمن فوق علامة التبويب لجدول البيانات الذي تم إنشاؤه حديثا وحدد "حفظ باسم"، وتصدير البيانات كملف.csv.
       ملاحظة: قياسات مماثلة يمكن أيضا أن استخدام البرمجيات الحرة مثل إيماجيج.
    4. افتح جدول جدول بيانات واستيراد جدول البيانات عن طريق تحديد علامة التبويب "البيانات"، تليها "من النص".
    5. استخدام الدالات في جدول البيانات للطرح كثافة الخلفية SEpH من "كثافة SEpH إشارة" عند كل نقطة في الوقت. كرر هذه العملية للإشارة مشري.
    6. ارسم كل كثافة قناة كدالة للزمن بتحديد الأعمدة التي تحتوي على الوقت وكثافة الخلفية لتصحيح البيانات وثم النقر فوق "إدراج > مبعثر (المخططات) > مبعثر بخطوط مستقيمة" (الشكل 5 (ب)).
    7. استخدام دالات جدول البيانات لحساب نسبة SEpH/مشري fluorescence في كل نقطة من الزمن.
    8. نسبة الأسفار الأرض كدالة للزمن بتحديد الأعمدة التي تحتوي على بيانات الوقت ونسبة وثم النقر فوق "إدراج > مبعثر (المخططات) > مبعثر بخطوط مستقيمة" (الشكل 5).

7-كامل معايرة فري في الأنابيب Malpighian فيفو السابقين.

1. تشريح وتركيب مجموعة جديدة من النظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامية كما هو موضح في القسم 5.
2. تبادل المتكاملة للمعايرة المتكاملة (درجة الحموضة 7.4، نيجيريسين 10 ميكرون) كما هو موضح في الخطوة 6.13.2. احتضان لمدة 30 دقيقة.
3. تحديد موقع النظام التجاري المتعدد الأطراف وجمع أزواج من الصور SEpH/مشري كما هو موضح في الخطوات 6، 1-6، 11. استبدال الحل مع أسهم أخرى للمعايرة المتكاملة كما هو موضح في الخطوة 6.13.4، انتظر 10 دقائق، والصورة مرة أخرى. كرر هذه العملية حتى نسبة SEpH/مشري قد تم تصويرها في جميع الحلول. الحصول على درجة الحموضة الصور 9.0 آخر كما العينة نادراً ما يسترد من درجة الحموضة العالية.
4. مؤامرة fluorescence نسبة SEpH إلى مشري من التحديدات في ثماني عينات آخر كدالة للأس الهيدروجيني المفروض_أنا كما هو موضح في الخطوة 6.14.9. احتواء البيانات المعايرة مع منحنى بولتزمان للحصول على وظيفة كاملة المعايرة وفقا للمعادلة 1 (الشكل 5). إذا كانت البيانات غير متناسقة، ارسم معايرة مجموعات من كل عينة تطبيع أن يقابل نسبة الأسفار من 1.0 للأس الهيدروجيني_i 7.0 وإعادة تحليل (الشكل 5E).
   ملاحظة: إذا كانت العملية الأخيرة ضروري سوف تحتاج التجارب الفردية الخاصة بهم معايرات نقطة الداخلية³³ (انظر الكمي الإجراء التالي (الخطوة 8.3)).
5. معادلة 1
   
   حيث R = نسبة SEpH/مشري و₁،₂، س_سو dx المنحنى المناسب معلمات يمثلون نسبة الأسفار الحد الأدنى ونسبة الحد الأقصى الأسفار، فك، وعرض وظيفة على التوالي. x_س = الظاهر فك من فري، التي يمكن أن تختلف بين 7.1 و 7.4 تبعاً لنوع الخلية وشروط المعايرة الدقيقة.

8-التحديد الكمي لقذف حمض Basolateral من السابقين فيفو أنبوب Malpighian ابيثيليا.

1. معربا عن فري الرئيسي للصورة فري-الإعراب عن الخلايا النجمية والخلايا في وقت واحد.
   1. تشريح MTs الأمامي من ذبابة UAS-فري/كبار-GAL4 كما هو موضح في القسم 5، ولكن لا يتم نقل النظام التجاري المتعدد الأطراف من المتوسطة لشنايدر تشريح لتصوير جيدا.
   2. تشريح MTs الأمامي من ذبابة UAS-فري/c724-GAL4 في طبق تشريح نفسه باستخدام الإجراء المبين في القسم 5.
   3. نقل مجموعات 2 من النظام التجاري المتعدد الأطراف في نفس التصوير جيدا كما هو موضح في الخطوات 5.8-5.11.
      ملاحظة: عندما تجتاح بالأسلحة للنظام التجاري المتعدد الأطراف وصولاً إلى الشريحة، وضع النظام التجاري المتعدد الأطراف UAS-فيري/c724-GAL4 والأنابيب UAS-فيري/كابار-GAL4 القرب من بعضها البعض حتى يمكن تصور الخلايا الرئيسية وتلعبه معربا عن فيري في (الحقل نفسه الشكل 6A).
2. تطبيق NH₄Cl بريبولسي كما هو موضح في الخطوة 6.12.
   ملاحظة: إذا كان لا يمكن معايرة متسقة (الشكل 4 باء)، إجراء معايرة نقطة بتعيين pH_i إلى 7.0 في نهاية كل تجربة المعايرة المتكاملة (pH 7.0، 10 ميكرون نيجيريسين، حضانة 30 دقيقة) بعد لاصقة تم إزالة مقسم نضح-جيدا والمعدات التروية.
3. معايرة آثار من الخلايا النجمية والرئيسية لمختلف قطاعات النقل المتعدد الوسائط (باستخدام نسبة مطلقة أو تم تسويتها حسب الاقتضاء) مع 2 المعادلة وتحليل مرحلة الانتعاش بعد انسحاب Cl NH₄عن طريق تطبيق الدالات تحلل أسي باستخدام برامج التحليل الإحصائي، وإذ تلاحظ ثابت الانحلال (τ) (الشكل 6B).
   المعادلة 2
   
   حيث R = نسبة SEpH/مشري و₁،₂، س_سو dx منحنى معلمات المناسب يحدده المعايرة في الخطوة 7، 4 (المعادلة 1).
   1. حساب معدل البثق حمض (J_{H +}، راجع المعادلة 3) كدالة لدرجة الحموضة_أنا لمراعاة الاختلافات في استراحة الأس الهيدروجيني_أنا وحمض تحميل بين الأعمال التحضيرية³⁴. استخدام الدوال الأسية المستمدة في خطوة 8.3 لحساب المشتقة من درجة الحموضة_أنا فيما يتعلق بالوقت في الفترة الزمنية لكل.
      المعادلة 3
      
   2. حساب سعة التخزين المؤقت المضمنة (β_i؛ المعادلة 4) من سيتوسول في درجة الحموضة_أنا من بداية كل فاصل زمني في خطوة 8.3.1 استناداً إلى المؤلفات السابقة (انظر 4 المعادلة).
      ملاحظة: في المورفولوجية، توصيف أدق β_أنا يأتي من المحطات الطرفية الأعصاب الحركية اليرقات³⁵ ويمكن افتراض هذه البيانات لخلايا طن متري في غياب البيانات الأخرى المتاحة.
      المعادلة 4
      
   3. حساب ناتج β_T (من الخطوة 8.3.2)_{و أنا}dpH/dt (من الخطوة 8.3.1) لتحديد J_{H +} (3 المعادلة).
      ملاحظة: في حلول خالية من بيكربونات اسمياً مثل تلك المبينة في هذا البروتوكول، المستمدة من بيكربونات التخزين المؤقت قدرة (β_ب) يفترض أن تكون ~ 0 ملم. مجموع التخزين المؤقت قدرة (β_T) هو مجموع β_{أنا βب}، وهكذا β_{أنا =} β_T في غياب HCO₃^–/CO₂³⁶.
   4. ارسم ي_{ح +} كدالة درجة الحموضة_وأنا في بداية كل الفاصل الزمني كما هو موضح في الخطوة 6.14.9.
   5. تطبيق مهام تحلل أسي على الجزء من جميع مجموعات البيانات التي تتداخل في الأس الهيدروجيني_وأنا باستخدام برامج التحليل الإحصائي. مقارنة معدلات تغير الوظائف الناتجة عن ذلك لمقارنة معدلات البثق حمض بين الخلايا وقطاعات النقل المتعدد الوسائط (الشكل 6).
      ملاحظة: أنسب الدالة المستخدمة لتركيب المنحنى قد لا دائماً تكون واحد أسي. وظائف أخرى يمكن أن تكون بديلاً إذا أنها تحسن الخير صالح.
   6. حساب حمض الجريان (انظر المعادلة 5) كدالة لدرجة الحموضة_أنا لمراعاة الاختلافات في حجم الخلية والشكل.
      المعادلة 5
      
      ملاحظة: أبعاد الخلية يمكن أما قياس مباشرة في الصور أو الاقتراب منها. ويمكن تمثيل الخلايا الرئيسية نصفين أنبوب مجوف مع الأبعاد التالية: القطر الداخلي 24 ميكرومتر؛ القطر الخارجي 48 ميكرومتر؛ ارتفاع 50 ميكرومتر. الانتقالية النجمية الخلايا المتغيرة ولكن يمكن أن تمثل تقريبا كالأسطوانات مع ارتفاعات من 50 ميكرومتر وأقطار من 10 ميكرون. انظر الفقرة الأخيرة من الممثل النتائج أدناه.
   7. تطبيق مهام تحلل أسي على الجزء من جميع مجموعات البيانات التي تتداخل في الأس الهيدروجيني_وأنا باستخدام برامج التحليل الإحصائي. مقارنة معدلات تغير الوظائف الناتجة عن ذلك لمقارنة تدفقات حمض بين الخلايا وقطاعات النقل المتعدد الوسائط (الشكل 6).

النتائج

الأنسجة السليمة والتحديد السليم للنظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامية أمران حيويان لنجاح هذا البروتوكول. أثناء التشريح، ينبغي الحرص على اتصال غير مباشر النظام التجاري المتعدد الأطراف والمؤشر الوحيد لهم الحالب كالتي تجتاح النظام التجاري المتعدد الأطراف مباشرة سوف ي...

Discussion

نجاح التحديد الكمي لدرجة الحموضة_وأنا في MTs المورفولوجية يعتمد كلياً على صحة المستخرجة من النظام التجاري المتعدد الأطراف ونوعية تركيب وتشريح (الشكل A – ج). وهكذا، المعالجة الدقيقة للأنسجة كوصف الحتمي. شرائح طازجة مغلفة في PLL إلى حد كبير المعونة MT تصاع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt	Sigma-Aldrich	N7143	CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors	Bioscience Tools	PS-8S	Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator	Warner Instruments	64-0221	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32"	Fisher Scientific	14-171-129	Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp	Fisher Scientific	05-869	Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	H3375	Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate	Sigma-Aldrich	69892	Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	T5130	Available from multiple vendors.
10X/0.45 Air Objective	Zeiss	000000-1063-139	Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera	Zeiss	Axiocam 506 mono	Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic	Chroma	CZ909	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic	Chroma	CZ915	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope	Zeiss	Axio Observer Z.1	Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software	Microcal	Origin 6.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software	National Institutes of Health	ImageJ 1.50i	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software	Zeiss	Zen 1.1.2.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.