JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

والهدف من هذا البروتوكول هو للتدليل على إعداد والثقافة والعلاج، والمناعية من إكسبلانتس القوقعة الفئران حديثي الولادة. ويمكن استخدام هذه التقنية كأداة في المختبر الفحص في سماع البحوث.

Abstract

في حين كان هناك تقدما ملحوظا في سماع البحوث على مدى العقود القليلة الماضية، لا يزال هناك أي علاج لفقدان السمع الحسي العصبي (سنهل)، وهو الشرط الذي ينطوي عادة على الضرر أو فقدان الهياكل الحسية الحسية الدقيقة للأذن الداخلية. ظهرت في المختبر في المختبر وفحص الجسم الحي في السنوات الأخيرة، مما يتيح فرز عدد متزايد من المركبات العلاجية المحتملة مع تقليل الموارد وتسريع الجهود لتطوير علاجات ل سنهل. على الرغم من أن الثقافات المتجانسة لبعض أنواع الخلايا لا تزال تلعب دورا هاما في البحوث الحالية، فإن العديد من العلماء يعتمدون الآن على ثقافات عضلية النمط الأكثر تعقيدا من الأذنين الفئران الداخلية، المعروف أيضا باسم المستكشفات القوقعة. الحفاظ على الهياكل الخلوية المنظمة داخل الأذن الداخلية يسهل التقييم في الموقع من المكونات المختلفة للبنية القوقعة، بما في ذلك خلايا الشعر الداخلية والخارجية، والخلايا العصبية دوامة العقدة، العصبيةإيتس، والخلايا الداعمة. هنا نقدم إعداد والثقافة والعلاج، والمناعية من إكسبلانتس القوقعة الفئران حديثي الولادة. إن الإعداد الدقيق لهذه المستكشفات يسهل تحديد الآليات التي تسهم في سنهل ويشكل أداة قيمة لمجتمع البحث السمعي.

Introduction

فقدان السمع الحسي العصبي (سنهل) يعكس الأضرار التي لحقت الأذن الداخلية أو الصاعد المسار السمعي. في حين أن فقدان السمع هو العجز الحسي الأكثر شيوعا في البشر 1 ، العلاجات العلاجية لا وجود لها حتى الآن 2 . على الرغم من أن زراعة قوقعة الأذن أو السمع يمكن أن تستعيد درجة معينة من السمع للمرضى الذين يعانون من سنهل شديدة وعميقة، فإن السمع التي تقدمها هذه الأجهزة لا تزال مختلفة جدا عن السمع "الطبيعي"، وخصوصا أثناء محاولات لفهم الكلام في الضوضاء أو للاستماع إلى الموسيقى.

في حين يعتبر انحطاط خلية الشعر منذ فترة طويلة النتيجة الرئيسية للأحداث السمعية الصادمة (على سبيل المثال، التعرض للضوضاء الصاخبة)، وهناك أدلة متزايدة على أن نقاط الاشتباك العصبي التي تنقل المعلومات من خلايا الشعر إلى العصب السمعي هي على الأقل عرضة للصدمات الصوتية 3 ، 4 ، 5 > ، 6 . منذ عتبات قياس السمع البشري، ومعيار الذهب الحالي لتقييم وظيفة السمع، لا تتنبأ الضرر الخلوي محددة في الأذن الداخلية، وهناك حاجة إلى أدوات أكثر دقة للكشف عن انحطاط الخلوي في أقرب وقت ممكن والشروع في العلاج المناسب 7 .

وغالبا ما يتم اختبار علاجات الأدوية الواعدة لفقدان السمع على ثقافات الخلايا المتجانسة في المختبر ، ولكن مثل هذه النظم لا نموذج بدقة المكروية القوقعة. ومن المعروف أن خلايا كوكلار تفرز العوامل الغذائية التي تؤثر على أنواع الخلايا الأخرى داخل القوقعة 8 ، 9 ، وهي عملية حاسمة في الجسم الحي التي فقدت عندما يتم استزراع عضو كورتي 10 ، 11 أو العصبونات العصبية الحلزونية (سغنز) 12 في عزلة أو عندما يتم تحليل علامات الجزيئيةإف "> 13. ومع ذلك، في الدراسات المجراة التي قد تكون ضرورية للتحقق من صحة البيانات في المختبر لإنشاء علاجات جديدة، شخصية لفقدان السمع في السعي من" الطب الدقيق "تتطلب موارد كبيرة والوقت، وهذا أمر مهم خصوصا عند النظر ومقدار الجهد المطلوب من أجل الكمال وأداء الأذن الوسطى أو مستديرة حقن غشاء النافذة مع اختبارات السمع وتشريح لاحق من القوقعة كاملة يتصاعد.فحص كفاءة المركبات الواعدة في الثقافات عضوي النمط السابقين فيفو المعروفة باسم إكسلانتس القوقعة يوفر بديلا اقتصاديا وموثوق بها 14 ، 15 ، 16 ، 17 .

توضح هذه المقالة بروتوكولا يمكن من خلاله إنشاء والحفاظ على وتقييم إكلانتس القوقعة المعالجة. يتم التأكيد على تطبيقات محددة لهذا النموذج، بما في ذلك استخدامه في الفرزمن المركبات العلاجية المحتملة والتقييم المقارن للنواقل الفيروسية للعلاج الجيني. نهج إكسيلانت فيفو السابقين يسمح للباحثين لتصور آثار علاج معين على السكان خلية مختلفة في الموقع ، وتسهيل تحديد آليات نوع خلية محددة وتنقيح لاحق من العلاجات المستهدفة.

عموما، توفر هذه التقنية نموذجا لدراسة القوقعة خارج الجسم الحي مع الحفاظ على الحيوية عبر الحديث بين أنواع الخلايا المختلفة إلى حد كبير التي تتعايش داخل القوقعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) من ماساتشوستس العين والأذن. وأجريت التجارب وفقا لمدونة أخلاقيات الجمعية الطبية العالمية.

1. إعداد تشريح

  1. إعداد الجدول الجراحي
    1. استخدام الايثانول 70٪ لتطهير الجدول الجراحي.
    2. وضع اثنين من منصات الإعدادية غير معقمة بجوار المجهر.
    3. إعداد صينية الصك، بما في ذلك مقص التشغيل تعقيم الحرارة، مقبض مشرط، سكين الصغير، وملقط (اثنين من كل من # 4 و # 55). ضع صينية الصك وطبق بتري ذو قاع زجاجي بقياس 50 مم، على لوحة واحدة غير معقمة.
    4. الحصول على العقيمة شفرة 15 مشرط. كيس من البلاستيك أو حاوية قابلة للاشتعال (للتخلص من الذبائح وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية)؛ الجليد في دلو؛ والبرد، حل الملح المتوازن هانك المعقم (هبس). ضع هذه العناصر علىلوحة غير معقمة أخرى.
    5. نقل هبس إلى أنبوب مختبر البلاستيك 50 مل ووضعه على الجليد.
  2. إعداد الثقافة
    1. إعداد جميع المواد في غطاء تدفق الصفحي. لكل أربعة عينات، ووضع أربعة تعقيمها 10 ملم جولة زلات غطاء الزجاج في أربعة تطعيم من 35 ملم طبق 4 بتري جيدا.
    2. لكل 4 العينات، مزيج من حجم إجمالي 300 ميكرولتر تتكون من ما يلي في أنبوب ميكروسنتريفوج: 10 ميكرولتر من لاصقة الأنسجة، 285 ميكرولتر من ناهكو 3 ، و 5 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم.
    3. وضع 45 ميكرولتر من الحل الناتج على كل زلة غطاء وترك الأمر هناك لمدة 20 دقيقة على الأقل في رت. يمكن ترك هذا الحل على ساترة لعدة ساعات ولكن لا يمكن ترك O / N.
    4. وضع واحد أو اثنين 35 ملم 4-جيدا طبق بتري (إس) داخل طبق بتري 10 سم من أجل خلق اثنين من الحواجز ضد التلوث.
    5. إعداد وسط الثقافة التي تحتوي على 98٪ دولبيكو في تعديل النسر المتوسطة (دمم)، 1٪ N-2، و 1٪ أمبيسلين (65 ميكرولتر لكل بئر في (مايكرو) أنبوب الطرد المركزي). تسخين الحل إلى 25 درجة مئوية قبل الاستخدام.

2. الفئران القوقعة تشريح إكسبلانت

  1. قطع الرأس من الماوس حديثي الولادة
    1. الحصول على 60 ملم طبق بتري البلاستيك ورذاذ الإيثانول 70٪ في غطاء بحيث السطح هو الرطب.
    2. صب هبس الباردة من أنبوب المختبر البلاستيك في الجزء السفلي من البلاستيك 60 ملم و 50 ملم واضح الجدران، طبق بتري الزجاج القاع. تخزين أنبوب المختبر البلاستيك وكلاهما أطباق بتري على الجليد للحفاظ على الأنسجة الباردة كلما لم يتم تشريحها.
    3. وضع P3 - P5 العمر الماوس الماوس حديثي الولادة على الجليد في اصبع قطع من قفاز اللاتكس والانتظار حتى انخفاض حرارة الجسم يؤدي إلى فقدان الوعي (حوالي 1-3 دقيقة).
    4. قطع رأس الفأر بسرعة مع مقص التشغيل والتخلص من الجسم في كيس من البلاستيك قابل للاشتعال. وضع قطع رأس الوليد في70٪ من الإيثانول في غطاء طبق بتري البلاستيك 60 مم.
  2. تشريح المجهري للعظم الصدغي
    1. إزالة الجلد من الجمجمة عن طريق إجراء قطع سطحية من الأمامي إلى نهاية الخلفي (مباشرة على رأس خياطة السهمي) باستخدام شفرة مشرط.
    2. قطع كل القنوات السمعية الخارجية مع شفرة مشرط وأضعاف الجلد الأمامي لفضح الجمجمة كاملة.
      ملاحظة: على الرغم من عدم وجود حاجة عادة المجهر تشريح لهذه الخطوة، ويمكن استخدامه لتحسين التصور.
    3. فتح الجمجمة على طول خياطة السهمي باستخدام شفرة مشرط # 15. تأكد من قطع الجمجمة عن طريق تحريك بلطف شفرة صعودا وهبوطا من الأمامي إلى الخلفي لتجنب ضغط القوقعة.
      ملاحظة: الجمجمة لا ينبغي أن تكون عظمة في هذا العصر، وينبغي أن تقطع بسهولة.
    4. إزالة وتجاهل خطم عن طريق جعل قطع العمودية مباشرة مباشرة إلى المدارات باستخدام مشرط # 15شفرة.
      ملاحظة: الجزء الخلفي من الجمجمة لا يزال يحتوي على الدماغ والقوقعة.
    5. تخلص من الدماغ الأمامي، المخيخ، ودماغ الدماغ من خلال تشريح حادة مع ملقط # 4.
  3. استخراج المجهرية من القوقعة
    1. ضبط المجهر (6.5X التكبير) ومصدر الضوء عن طريق وضع ملقط تحت نطاق وتحسين الإضاءة والتركيز.
    2. وضع نصفين من الجمجمة في طبق بتري البلاستيك مم 60 مليئة هبس الباردة.
    3. كشف تماما القوقعة / ه، يمكن التعرف على أنها المتاخمة للشريان ستابديال المحيطة (شريان متعرج داخل العظم الصدغي)، وفصل بصراحة الجهاز من العظم الصدغي باستخدام ملقط # 4.
    4. نقل القوقعة في 50 ملم، واضحة الجدران، طبق بيتري القاع الزجاجي ووضع الطبق تحت المجهر.
    5. وضع 60 ملم طبق بتري البلاستيك مع النصف الآخر من الجمجمة على الجليد.
    6. إزالة القوقعة من النظام الدهليزي وتشريح بعناية قوقعة الأذن الدموية القوقعة (عادة غضروفي في هذا العصر) مع ملقط # 4. استخدام ملقط # 55 لجميع الخطوات الأخرى.
  4. الخطوات النهائية لمعالجة الأنسجة
    1. مواصلة معالجة الأنسجة الأذن الداخلية عن طريق فصل بعناية الرباط دوامة ملتصقة لجهاز كورتي من بقية القوقعة و موديولوس باستخدام سكين الجزئي أو ملقطين.
      1. تقطع إلى المنطقة الأكثر قتامة وشفافة في شق بين الرباط الحلزوني ومنطقة خلية الشعر والمضي قدما في إزالة لاحقة من الرباط دوامة من خلال استيعابه في الجانب الأكثر القاعدية ولفك بلطف أثناء التحرك أبيكالي.
    2. وضع العينة للحصول على عرض طولية، سهمي من القوقعة وخفض القوقعة في قسمين إلى ثلاثة أقسام باستخدام سكين الجزئي، وتصنيف هذه المقاطع كما القمي، (الأوسط) و بيتحول أسال. إزالة الأنسجة متفوقة وأدنى شأنا من الطبقة الفعلية من خلايا الشعر و نيوريتس من أجل تحقيق قطعة مستكشفة القوقعة التي يمكن أن تضع أفقيا على طبق بتري.
      ملاحظة: حجم مناسب لالتصاق مستقرة لصحن الثقافة ما يقرب من نصف بدوره قوقعة الأذن.
    3. إزالة الغشاء السقفي، طبقة شفافة رقيقة جدا متفوقة على الفور إلى الجهاز كورتي، عن طريق تقشير بلطف بعيدا مع ملقط.
    4. إزالة غشاء ريسنر، متفوقة على الفور إلى سغنز، عن طريق لمسه مع ملقط على كلا الجانبين وتقشير بعيدا.
      ملاحظة: إزالة أي مناطق خلية الشعر التالفة تقع أفقيا عن طريق قطعها بعيدا مع سكين الجزئي.

3. نقل العينات إلى لوحات الثقافة

  1. إزالة 45 ميكرولتر من محلول لاصق الأنسجة من زلات تغطية أربعة. غسل كل زلة غطاء مع 50 ميكرولتر من العقيمة H 2 O. نضح الماء.
  2. التقاط ماصة 1 مل. الرطب طرف ماصة مع ما يقرب من 120 ميكرولتر من دمم لمنع العينة من التمسك داخل الطرف.
  3. نقل العينات بشكل فردي باستخدام ماصة 1 مل. ماصة بحد أقصى 70 ميكرولتر من هبس مليئة، صغيرة، واضحة الجدران، طبق بيتري قاع الزجاج، ووضع العينة جنبا إلى جنب مع السائل على واحدة من 4 ترصيع (أعدت مع زلات تغطية) في طبق بتري 4 جيدا .
  4. تحقق تحت المجهر (50X التكبير) أن العينة في الاتجاه الصحيح. تأكد من أن المنطقة من خلايا الشعر التي تم إزالة الغشاء السقفي يواجه أعلى. تأكد من أن الغشاء القاعدي، جنبا إلى جنب مع قلص، الجزء القاعدي من موديولوس، يواجه أسفل ويلتزم ساترة.
    1. إذا تم توجيه العينة رأسا على عقب عند التفتيش، إيداع هبس الذي يبقى في طرف ماصة في ترصيع وإعادة وضع قطعة حتى يتم توجيهها بشكل صحيح.
      لاتي: هذا سوف يمنع خلايا الشعر من العائمة في وسط الزراعة دون الدعم الهيكلي من ساترة، والتي يمكن أن تؤدي إلى انحطاط.
  5. نضح الزائد هبس باستخدام ماصة 1 مل. انتظر لمدة 15 ثانية.
  6. ماصة 60 ميكرولتر من وسط ثقافة دافئة أعدت (98٪ دمم، 1٪ N-2، و 1٪ أمبيسيلين) مباشرة على العينة. الحرص على عدم لمس العينة مع ماصة. استبدال يغطي طبق بتري الداخلي والخارجي واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية.
  7. وضع جميع حلول الأسهم مرة أخرى في أماكنهم الصحيحة، والتخلص من الذبائح والنفايات المتبقية، وتطهير الجدول الجراحي وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية (على سبيل المثال، باستخدام الإيثانول أو هيبوكلوريت)، نظيفة والأوتوكلاف الصكوك، وتجاهل الحادة في الحاوية المناسبة .

4. إضافة وسائل الإعلام والثقافة النهائية والمواد ذات الأهمية

ملاحظة: سوف إكسبلانتس قوقعة تكون جاهزة للاستخدام 10-16 ساعة في وقت لاحق.

  1. إعداد ميكستوإعادة 97٪ دمم، 1٪ مصل بقري جنيني (فبس)، 1٪ N-2، و 1٪ أمبيسيلين (65 ميكرولتر لكل بئر في أنبوب ميكروسنتريفوج؛ دافئ الحل إلى 25 درجة مئوية قبل الاستخدام).
  2. إضافة المواد الأخرى التي تهم الحلول لمجموعات العلاج المعنية. إذا أضيفت مواد الفلورسنت (على سبيل المثال، بروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) -فيروسات التعبير؛ في منشور صدر مؤخرا، تم استخدام تركيز 10 10 غ من الفيروسات المرتبطة الغدة (آفس) لمدة 48 ساعة في 50 ميكرولتر) 18 ، وحماية من ضوء.
  3. نقل القوقعة تحتوي على إكسلانتس أطباق بتري من الحاضنة ووضعها تحت غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي.
  4. نضح وسط الثقافة القديمة (ث / س فبس) مع ماصة من البطانات.
  5. إضافة 60 ميكرولتر لكل بئر من الثقافة الدافئة استعداد (العلاج) المتوسطة (97٪ دمم، 1٪ فبس، 1٪ N-2، 1٪ أمبيسيلين، والمواد ذات الاهتمام).
  6. وضع طبق بتري مرة أخرى في الحاضنة (37 درجة مئوية).
  7. مشاهدة ملف rإغولارلي تحت المجهر لتحديد علامات التلوث، والهجرة الخلوية، أو مفرزة من المستكشف القوقعة وأداء تلطيخ بعد 7 أيام كحد أقصى.

5. المناعي - يوم 1

  1. إعداد محلول منع (94٪ الفوسفات مخزنة المالحة (بس)، 5٪ الماعز العادي أو مصل الحصان (نغس / نهس، اعتمادا على الأجسام المضادة الثانوية)، و 1٪ غير الأيونية السطحي (انظر جدول المواد )) والأوراق المالية (98.6٪ بس، 1٪ نهس، و 0.4٪ السطحي غير الأيونية مع الأجسام المضادة المعنية).
    ملاحظة: وتشمل الأجسام المضادة الأرنب المضادة لل Myo7A بتركيز 1: 400 + (ميوسين 7A، لخلايا الشعر الداخلية والخارجية) والفأرة المضادة TOJ1 1: 200+ (β-توبولين، ل سغنز) أو الماوس (IgG1) المضادة -CtBP2 1: 200+ (C- محطة ملزمة البروتين، ل بريسينابس)، والماوس (IgG2a) مكافحة PSD95 1: 50+ (كثافة ما بعد المشبكي، ل بوستسينابس)، والدجاج المضادة لل نف-H 1: 1000+ (العصبية، ل سغنز والألياف العصبية). "+" ميينس "أو أعلى".
  2. نضح وسط الثقافة باستخدام ماصة. الحرص على عدم لمس العينة.
  3. تحت غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي، وشطف إكلانتس القوقعة مرتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة، ووضع العينات على شاكر لمدة 5 دقائق بعد كل غسل.
  4. إصلاح الأنسجة في بارافورمالدهيد 4٪ (بفا - تنبيه) لمدة 20 دقيقة على شاكر (تحت غطاء محرك السيارة). نضح بفا.
  5. تطبيق 60 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ل إكلانتس القوقعة ووضع طبق بتري على شاكر لمدة 5 دقائق. نضح برنامج تلفزيوني. كرر 3X.
  6. وضع إكسلانتس القوقعة في حل حجب استعداد (94٪ بس، 5٪ نهس، و 1٪ غير الأيونية السطحي) لمدة 30 دقيقة على شاكر.
  7. وضع إكسلانتس القوقعة في محلول الأجسام المضادة المخزون أعدت (98.6٪ بس، 1٪ نهس، و 0.4٪ غير الأيونية السطحي) مع الأجسام المضادة الأولية منها (دوامة قبل الاستخدام) O / N على عداد في رت.
    ملاحظة: التفاف أطباق بتري مع المناشف الورقية رطبة المغلقة في غلاف بلاستيكي (أو رقائق الألومنيوم إذا كان حلالا المضافةايون يحتوي على مواد الفلورسنت مثل غفب معربا عن الفيروسات) للحفاظ على الأطباق الرطبة ومنع التبخر من حل الأجسام المضادة O / N.

6. المناعي - يوم 2

  1. إعداد 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (دابي) وصمة عار (300 نانومتر) واستخدام حل الأجسام المضادة الأسهم للحصول على مخاليط الأجسام المضادة الثانوية الصحيحة، مكملة للأجسام المضادة الأولية في الخطوة 5.1. (على سبيل المثال ، الماعز المضادة للأرنب 488 1: 200+ والماعز المضادة للفأر 568 1: 200+ أو الماعز المضادة للفأر (IgG1) 568 1: 1000+، الماعز المضادة للفأر (IgG2a) 488 1: 500+، والماعز المضادة للدجاج 647 1: 200+ أو فالويدين 568 1: 200+ (لخلايا الشعر الداخلية والخارجية)).
  2. نضح حل الأجسام المضادة الأولية.
  3. تطبيق 60 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ل إكلانتس القوقعة ووضع طبق بتري على شاكر لمدة 5 دقائق. نضح برنامج تلفزيوني. كرر 3X.
  4. وضع إكسلانتس القوقعة في محلول الأجسام المضادة أعدت استعداد (98.6٪ بس، 1٪ نهس، و 0.4٪ غير السطحي الأيونية) مع الدقةالأجسام المضادة الثانوية (دوامة قبل الاستخدام) لمدة 1.5 ساعة على العداد وحماية من الضوء.
  5. نضح حل الأجسام المضادة الثانوية وشطف إكلانتس القوقعة مع وصمة عار دابي (وضع على شاكر لمدة 1 دقيقة ثم نضح).
  6. تطبيق 60 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني ل إكلانتس القوقعة ووضع طبق بتري على شاكر لمدة 5 دقائق. نضح برنامج تلفزيوني. كرر 3X.
  7. استخدام ملقط لإزالة كوفرسليبس مع عينات من لوحة 4 جيدا، وتراجع لهم في مستلم مليئة المقطر H 2 O، وتجفيف كوفرسليبس عن طريق عموديا جلبهم في اتصال مع المناشف الورقية.
  8. وضع قطرة من أنتيفاد تصاعد المتوسطة على شريحة المجهر وعكس كوفرسليبس لتزج الأنسجة التي تواجه أسفل في الوسط.
  9. ختم ساترة باستخدام طلاء الأظافر واضحة تغطي كفافي حافة (دون سحق العينة تحت الزجاج). ترك الشرائح مستلقية في منطقة مغطاة بعيدا عن الضوء لمدة 15-20 دقيقة حتى الجافة والثالثةإن وضعها في مربع أو فحص تحت المجهر متحد البؤر.
    ملاحظة: أفضل تلطيخ الفلورسنت هو الحفاظ عليها عن طريق تخزين الشرائح في 4 أو -20 درجة مئوية.

7. التصوير متحد البؤر

  1. الحصول على لمحة عامة والتكبير في الصور لجهاز منطقة كورتي، بما في ذلك نيوريتس و سغنز.
    ملاحظة: إعدادات قياسية لعملية التصوير: شكل 1،024 × 1،024 بكسل، وسرعة 400 هرتز، ومعدل الإطار من 3، 20٪ كثافة الليزر عموما، وعادة 20X و 63X عدسة مع غمر النفط (يحتمل أن تكون جنبا إلى جنب مع تقريب رقمي 2X). تم توضيح إعدادات قناة بروتوكول تلطيخ دابي و Myo7A و TOJ1 أعلاه: 405 5٪ دابي، "سمارت غين" 766.8V، "إزاحة ذكية" 0.0٪ - 488 15٪ فلوريسئين إيسوثيوسيانات (فيتس)، "سمارت غين" 622.2V ، "الإزاحة الذكية" 0.0٪ - 561 13٪ تيتراميثيلرهومادين إيسوثيوسيانات (تريتك)، "سمارت غين" 562.4V، "الأوفست الذكية" 0.0٪.
  2. دمج الصور في z- كومة باستخدامالبرمجيات للحصول على إسقاط محور.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

في حين أن العديد من البروتوكولات تركز على الجهاز من إلكسبلانتس كورتي، يحاول هذا الأسلوب للحفاظ على التشريح من بدوره القوقعة بأكملها، بما في ذلك سغنز. وهذا يعطي الباحثين الفرصة لتحليل آثار علاج معين على نيوريتس و سوماتا من سغنز بالإضافة إلى الجهاز ك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

يجب على الباحثين أن يتقنوا تقنية التشريح قبل إجراء التجارب التي تنطوي على إكتشافات قوقعة. وتضرر الخلايا الشعرية عادة أثناء إجراء التشريح في وقت مبكر من منحنى التعلم، وحظة إشكالية خاصة لنزاهتها هي إزالة الغشاء القصبي، الأمر الذي يتطلب أيدي ثابتة، والأدوات المناسبة،...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصمم وغيرها من منح اضطرابات الاتصالات R01DC015824 (كمز) و T32DC00038 (دعم سد)، ومنح وزارة الدفاع W81XWH-15-1-0472 (كمز)، ومؤسسة بيرتاريللي (كمز)، و ومؤسسة نانسي سايلز داي (كمز)، ومركز لور تينيتوس ريزارتش سينتر (كمز). نشكر جيسيكا E. ساغيرز، با للتعليقات الثاقبة على المخطوطة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ampicillin, Sodium SaltInvitrogen11593-027
anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1)BD Transduction Laboratories612044
anti-Myo7A antibody, rabbitProteus Biosciences25-6790
anti-NF-H antibody, chickenEMD MilliporeAB5539
anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a)Antibodies Inc.75-028
anti-TuJ1 antibody, mouseBioLegend801202
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mgCorning354241
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, SterileGreiner Bio-One188161
CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mmGreiner Bio-One664160
CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner ringsGreiner Bio-One627170
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mmGreiner Bio-One628160
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, SterileGreiner Bio-One227261
Clear Nail PolishElectron Microscopy Sciences72180
Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mmTed Pella Inc.14027-20
Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mmTed Pella Inc.260368
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Thermo Fisher ScientificD1306
Distilled water, 500 mLThermo Fisher Scientific15230-162 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mLThermo Fisher Scientific10313-039
Dumont #4 ForcepsFine Science Tools11241-30
Dumont #55 Forceps (Dumostar)Fine Science Tools11295-51
Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5%Sigma-Aldrich459836-1L
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mLThermo Fisher Scientific10437-028 Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
goat anti-chicken-647 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-21469
goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-11004
goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-21124
goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificA-21131
goat anti-rabbit-488 secondary antibodyThermo Fisher ScientificR37116
H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mLEMD MilliporeTMS-006-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mLThermo Fisher Scientific14025-092
Instrument Tray with Lid Stainless SteelMountainside MedicalTechMed4255
Micro (dissecting) knife – angled 30°Fine Science Tools10056-12
Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72VWR16004-382
N-2 Supplement (100X), 5 mLThermo Fisher Scientific17502-048
NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mLThermo Fisher Scientific25080-094
NaOH, sodium hydroxide solution, 1 LThermo Fisher ScientificSS266-1
Normal Horse Serum (NHS)Invitrogen16050130
Operating scissorsRoboz Surgical Instruments Co.RS-6806
Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, CrystallineSigma-AldrichP6148Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mLThermo Fisher Scientific10010-023 Autoclave prior to use
Phalloidin, Alexa Fluor 568 Thermo Fisher ScientificA12380
Prep Pad, Non Sterile Medline05136CS
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mLEppendorf022363719Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mLEppendorf022363204Autoclave prior to use
Scalpel Blades - #15Fine Science Tools10015-00
Scalpel Handle - #4Fine Science Tools10004-13
Stemi 2000-C Stereo MicroscopeZeiss 000000-1106-133
TCS SP5 confocal microscopeLeicaN/A
Triton-X (non-ionic surfactant)IntegraT756.30.30
VectaShield antifade mounting medium for fluorescenceVector Laboratories, Inc.H-1000
Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thickZipline0609132541599

References

  1. Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
  2. Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
  3. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth. J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).
  4. Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after "temporary" noise-induced hearing loss. J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).
  5. Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones. J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).
  6. Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice. PLoS One. 10 (5), (2015).
  7. Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear. Hear Res. , 83-93 (2016).
  8. Wang, H. C., et al. Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells. Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).
  9. Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development. Neural Dev. 6, (2011).
  10. Dinh, C., et al. Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants. Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).
  11. Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti. Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).
  12. Kao, S. Y., et al. Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss. Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).
  13. Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry. J Vis Exp. (58), e3432(2011).
  14. Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation. J Vis Exp. (95), e52260(2015).
  15. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. J Vis Exp. (36), (2010).
  16. Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants. J Vis Exp. (93), e52101(2014).
  17. Wang, Q., Green, S. H. Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro. J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).
  18. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  19. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599(2015).
  20. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. , (2016).
  21. Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons. J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).
  22. Yuan, Y., et al. Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy. J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).
  23. Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in "recovered" ears. J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).
  24. Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea. Neuroscience. , 50-62 (2016).
  25. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  26. Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).
  27. Shu, Y., et al. Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes. Hum Gene Ther. , (2016).
  28. Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear. Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved