نظام متكامل لتشغيل عن بعد توصيل الإشارة داخل الخلايا بوساطة نانوحبيبات Upconversion كيناز فوتواكتيفيشن

Summary

في هذا البروتوكول، معطلة على سطح نانوحبيبات محبوس البروتين كيناز ألف (PKA)، بيوفيكتور توصيل إشارات خلوية، وميكروينجيكتيد إلى سيتوسول وتفعيلها من خلال تحويل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة من الإشعاع (الجرد) القريبة من الأشعة تحت الحمراء، الذي يحفز الإجهاد المصب تفكك الألياف في سيتوسول.

Abstract

نانوحبيبات Upconversion (أوكنب)-فوتواكتيفيشن الوساطة نهج جديد في بيوفيكتورس التحكم عن بعد مع الضيائية أقل بكثير وأعمق اختراق الأنسجة. ومع ذلك، الأجهزة الموجودة في السوق غير سهولة متوافق مع تطبيق upconversion. ولذلك، تعديل الصك متاحة تجارياً ضروري لهذا البحث. في هذه الورقة، ونحن أولاً توضيح التعديلات فلوريميتير التقليدية ومجهر الأسفار لجعلها متوافقة لتجارب upconversion فوتون. ثم يصف لنا توليف القرب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد)-أثارت محبوس البروتين كيناز ألف الحفاز فرعية (PKA) معطلة في مجمع أوكنب. وأفيد أيضا معلمات microinjection وإجراءات الجرد فوتواكتيفيشن. بعد أن يتم ميكروينجيكتيد PKA-أوكنب محبوس في خلايا تنتجها الخلايا الليفية REF52، مشغلات تشعيع الجرد، وتفوق إلى حد كبير لإشعاع الأشعة فوق البنفسجية التقليدية، كفاءة PKA المسار توصيل الإشارات في الخلايا الحية. وبالإضافة إلى ذلك، تؤكد تجارب التحكم الإيجابي والسلبي أن الطريق التي يسببها PKA مما يؤدي إلى تفكك ألياف الإجهاد على وجه التحديد يتم تشغيلها بواسطة تشعيع الجرد. وهكذا، يوفر استخدام أوكنب البروتين تعديل نهج مبتكر التحكم عن بعد بالتضمين في ضوء التجارب الخلوية، التي يجب تجنب التعرض المباشر للأشعة فوق البنفسجية.

Introduction

وقد وضعت البروتينات المعدلة كيميائيا يمكن أن فوتواكتيفاتيد (مثلاً، PKA محبوس البروتينات) كحقل ناشئة في مجال البيولوجيا الكيميائية لمعالجة العمليات الكيميائية الحيوية بين الخلايا^{1،2 غير إينفاسيفيلي ،3}. استخدام الضوء كما يوفر حافزا القرار الزمانية المكانية ممتازة عند تنشيط هذه محبوس البروتينات. ومع ذلك، يمكن أن يسبب ضوء الأشعة فوق البنفسجية التغييرات الشكلية غير مرغوب فيها، والمبرمج، وتلف الحمض النووي للخلايا^4،5. ومن ثم، التطورات الأخيرة في التصميم مجموعات فوتوكاجينج تركز على تمكين فوتوكليفاجي عند الإثارة أطول الطول الموجي أو اثنين-فوتون لتقليل الضيائية، كذلك فيما يتعلق بزيادة التغلغل العميق الأنسجة^6،7. تنشيط مجموعات حبس تستجيب للطول الموجي أطول مما يسمح لنا باختيار الأطوال الموجية أونكاجينج المناسبة (أي، قنوات) إلى بشكل انتقائي بيوفيكتورس عند اثنين أو أكثر الفئات كاجينج الحالي⁷. ونظرا لهذه الخصائص المفيدة، تطوير مجموعات جديدة من فوتوكاجينج الضوء الأحمر عمل المنبع هام جداً في منهجيات الضوئية للدراسات البيولوجية بدءاً من سبر آليات ردود الفعل على مراقبة الأنشطة الخلوية⁸. ومع ذلك، مجموعة كاجينج اثنين-فوتون عادة مسعور جداً بسبب هيكل حلقة عطرية تنصهر فيها، ومجموعة كاجينج الضوء المرئي عادة الفلزية العضوية، مع يغاندس العطرية. هذه الخاصية العطرية/عمود المصباح غير مناسبة عندما يكون بيوفيكتور البروتين أو الإنزيم، كما ديناتوريس الموقع تنشيط الإنزيم/البروتين ويسبب فقدان وظيفة، حتى لو كان التصريف والتحلل الضوئي لا تزال تعمل على مستوى المواد الكيميائية^{2 ،9}.

أوكنبس هي محولات الطاقة الفعالة التي تحول على ضوء الإثارة الجرد بالأشعة فوق البنفسجية. وقد عرضت هذه الخاصية الفريدة والرائعة من أوكنبس قرارات واقعية للتصدي للتحديات المرتبطة فوتواكتيفيشن وتشغيل الإصدار التي تسيطر عليها من الجزيئات الصغيرة، بما في ذلك¹⁰من حمض الفوليك، سيسبلاتين مشتقات¹¹ ،¹²الحمض النووي/siRNA و حويصلات كوبوليمر¹³والجسيمات أجوف¹⁴. ومع ذلك، على حد علمنا، فوتواكتيفيشن أوكنب--بمساعدة من الإنزيمات أو البروتينات لم يتم اختباره حتى الآن. لأنه لا توجد أي حالة ناجحة لاستخدام الضوء الأحمر أو قوائم الجرد الوطنية فوتواكتيفي إنزيم، نحن كانت تطالب بإجراء التنشيط آثار تقرير الجرد الوطني لبناء البروتين/إنزيم تتألف من مجمعات إنزيم محبوس معدلة كيميائيا مع السليكا المغلفة، لانثانيدات يخدر أوكنب¹⁵. في هذه الدراسة، أوكنب كان مترافق مع سرعة في رد فعل إشارة توصيل كيناز في شكل قفص PKA. يتحكم PKA توليف الجليكوجين والتنظيم سيتوسكيليتال يستجيب للمنبهات الخارجية عن طريق دوري أدينوسين الفوسفات (معسكر) التنظيم في سيتوسول¹⁶. علينا دراسة جدوى لتنشيط إنزيم في الخلق الزماني والمكاني في تجربة الهاتف خلوي بعد التشعيع الجرد. هذا المنبر فوتواكتيفيشن أوكنب-بمساعدة منهجية جديدة إلى فوتواكتيفاتي إنزيم استخدام قوائم الجرد الوطنية ويتجنب استجابة الخلايا الناجم عن إشعاع الأشعة فوق البنفسجية التقليدية^2،4توصيل إشارة غير مرغوب فيها.

من الصعب جداً ترانسلوكاتي بيوفيكتورس كبيرة (مثلاً، البروتينات) عبر غشاء الخلية للتحكم في النشاط الخلوي. على الرغم من أن قد يكون من الأسهل ترانسلوكاتي عن طريق الالتقام في سيتوسول البروتين الجسيمات معطلة، قد تضررت الالتقام أو المتدهورة عن طريق فخ اندوسومال وما يترتب عليه من تدهور الليزوزومية^2،4. مبالغ ذوبانها حتى لو البروتين محبوس الفنية لا تزال بعد الغشاء إزفاء، قد لا يكون كافياً لإحداث الاستجابة الخلوية^2،17. في تناقض حاد، microinjection نهجاً مباشرا والكمية لتسليم بيوفيكتورس الكبيرة إلى السيتوبلازم للخلية. وعلاوة على ذلك، يتطلب المعطل تداولها أوكنب بيوفيكتور تحويل الضوء لتفعيلها. ولذلك، الأجهزة البصرية يتطلب المزيد من التعديل لقياس، تصور، والاستفادة من الضوء upconversion. وسيرد في هذا العمل، تسليم مجمع أوكنب PKA محبوس إلى خلية باستخدام microinjection والتعديلات الأساسية التالية التحليل الطيفي، والفحص المجهري نير فوتواكتيفيشن بالتفصيل.

Protocol

ملاحظة: يصف البروتوكول تعديل أجهزة مفصلة لساعد upconversion فوتواكتيفيشن، وإجراء اصطناعية لتوليد محبوس PKA-أوكنب، مجهر إلكتروني (TEM) من أوكنب والسليكا المغلفة وقفص عينات PKA-أوكنب والإعداد التحلل الضوئي الأشعة فوق البنفسجية والجرد، وإعداد الخلية، microinjection PKA-أوكنب، ودراسة فوتواكتيفيشن وتلطيخ الألياف الإجهاد من الخلايا REF52-

1-الإعداد فلوريميتير لقياس الطيف Upconversion

1. تثبيت عدسة هدف X 4 بجوار حامل ومبومو مطياف الأسفار حيث أن الليزر وتركز على منتصف ومبومو.
ضع
2. 0.5-8 ث الانضباطي 980 نانومتر ليزر الصمام ثنائي 90° ضد العدسة الهدف.
   تنبيه: المشغل يحتاج إلى معرفة سلامة الليزر وارتداء نظارات الليزر نير.
3. تثبيت مرآة انعكاس كامل في تقاطع مسار الضوء من العدسة والهدف والليزر. ضع لوحة معدنية أسود المؤكسد إلى كتلة نافذة الإثارة للتحليل الطيفي وحماية الأجزاء الداخلية-
4. مكان ومبومو المغلفة السليكا أوكنب الحل (0.2-0.6 مغ/مل) في حامل ومبومو حتى يمكن تصور شعاع upconversion مشرق ويمكن استخدامها لضبط محاذاة الخفيفة أفضل لتركيب مرآة.
5. التبديل التحليل الطيفي إلى وضع التﻷلؤ مع أدنى إعداد الجهد PMT (ضبط لإعداد أعلى إذا كان الإشارة ضعيفة جداً). ضبط مرآة لمحاذاة أفضل، حيث الشعاع في وسط ومبومو وتلتقط PMT أقوى إشارة.
6. قياس الطيف upconversion، بعد المحاذاة، مع إعداد الطاقة المطلوبة. استخدم مقياس طاقة حرارية كومة لبناء منحنى معايرة للطاقة الليزر ضد القراءة الكهربائية الحالية في إمدادات الطاقة الليزر. تحقق باستمرار أداء الليزر للتأكد من أن الأداء يقع ضمن نطاق معايرة.

2. إعداد المجهر

ملاحظة: يعمل الإعداد التالي لمجاهر مزودة بمسار بصري مستويين. إذا كان المستخدم تنوي تثبيت رمز تبديل مصدر ضوء إثارة في المنفذ مرة أخرى لجعل الليزر الجرد ومصباح هاليد تتقاسم نفس المنفذ، صيد تلسكوب في المنفذ الخلفي كثيرا كتلة تقرير الجرد الوطني أنها مصممة للحد من تدفئة العينة. يجب أن تجعل المستخدم خيار صعب: الحفاظ صيد تلسكوب ويعانون من كفاءة upconversion منخفضة جداً، أو إزالة صيد تلسكوب والتضحية بكثافة الإثارة الخفيفة ابيفلوريسسينسي-

ملاحظة: رسم تخطيطي كوتاواي عرض مخطط مسار الضوء على سبيكتروفلوروميتير معدلة، الفحص المجهري التﻷلؤ upconversion ووضع قوائم الجرد الوطنية التحلل الضوئي وابيفلوريسسينسي ووضع التحلل الضوئي الأشعة فوق البنفسجية، والإعداد التجريبية استخدمت في هذه التجربة موضحة في الشكل رقم 2-

دليل

1. تجهيز مجهر الأسفار مع هاليد معدنية خفيفة، توجه إلى الخلف منفذ
   ملاحظة: في هذا المسار الخفيفة الطبقة العليا حيث يوجد برج مكعب، موضع مكعب واحد يجب أن تكون فارغة للسماح نير قادمة من المسار. خفيفة الطبقة السفلي
2. تثبيت الانضباطي 0.5 إلى 8.0 W 980 نانومتر ليزر الصمام ثنائي في الميناء الجانب الأيمن، مع صيد تلسكوب الجانب المنفذ مفتوح.
   ملاحظة: وهذا يوسع ميكرومتر الموضعية إلى حوالي 500 ضوء الليزر في القطر عند استخدام عدسة هدف X 10. إزالة هذا صيد تلسكوب النتائج في بقعة ضوء مدى ميكرومتر ويجعل نير تشعيع الخلايا غير عملي. صيد تلسكوب هذا هو نير شفاف.
3. تثبيت مرآة مزدوج اللون (850 نانومتر قصيرة-تمرير) وعامل تصفية إثارة (950 نانومتر طويلة-تمرير) في الطبقة السفلي الخفيفة المسار.
استخدام
4. حل أوكنب لتصور بقعة ضوء الجرد. ضبط موضع الليزر مركز شعاع ضوء الجرد في مجال الرؤية لإنهاء المحاذاة.

3. إعداد وتوصيف من قفص PKA-أوكنب بناء

1. إينكوباتي PKA المؤتلف (9 ميكرومتر) مع 0.5 مم 2-نيتروبينزيلبروميدي (NBB) في حبس المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl، مجكل 100 كلوريد الصوديوم، و 10 ملم ₂؛ الرقم الهيدروجيني 8.5) لح 1-2 في 25 ° الطفايات جيم NBB الزائدة مع 10 مم دثيوثريتول (DTT)، وبعد ذلك دياليزي ضد 4-(2-هيدروكسيثيل) حمض الببرازين-1-اثانيسولفونيك (حبيس) المخزن المؤقت (10 ملم، ودرجة الحموضة 7.5) لإزالة الزائدة الكواشف والأملاح.
   ملاحظة: الرقم الهيدروجيني لحل كاجينج هو خفض من 8.5 إلى 7.5 أثناء الغسيل الكلوي مع حبيس الرقم الهيدروجيني 7.5 لرد فعل التثبيت لاحقاً.
2. ميكس لانثانيدات أملاح-Y(CH₃CO₂) ₃ الهيدرات (99.9%، 0.4527 ز، ملمول 1.38)، Yb (CH ₃ CO ₂) ₃ هيدرات (99.9%، 0.2533 ز، ملمول 0.60)، و Tm (CH ₃ CO ₂) ₃ هيدرات (99.9%، 0.0168 ز، 0.02 ميللي مول)-أوكتاديسيني (30 مل) وحمض الأولييك (12 مل)، تسخين المخلوط إلى 115 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وتبريد لهم إلى 50 درجة مئوية. بعد ذلك، حل الخليط رد الفعل في حل باثانول (20 مل) مع 0.2 ز (5.0 مليمول) بيليه هيدروكسيد الصوديوم و 0.2964 ز (8 ميللي مول) من فلوريد الأمونيوم التي سونيكيشن عن 15 دقيقة زيادة رد فعل درجة الحرارة إلى 300 درجة مئوية للحصول على نواة أوكنب (β-كفر ₄ : 1.0% Tm ^{3 +}/30% الماليزي ^{3 +}) جسيمات نانوية.
حل
3. nanoparticles الأساسية (25 ملغم) مع شركة-520 (0.5 مل) في الحلقي (10 مل). إضافة الأمونيا (wt 30% v/v، مل 0.08) وتيترايثيلورثوسيليكاتي (تيوس، مل 0.04) وتطبيق التحريك المستمر ح 12 في درجة حرارة الغرفة للحصول على السليكا المغلفة β-كفر ₄: 1.0%Tm ^{3 +}/30%Yb ^{3 +} الأساسية جسيمات نانوية.
4. احتضانها في PKA (نمول 6) أو قفص PKA (نمول 6) مع أوكنب (1 ملغ) ¹⁵ في هيبيس المخزن المؤقت (10 ملم، ودرجة الحموضة 7.5) في 4 درجات مئوية عن ح 3 شل PKA على السليكا المغلفة أوكنب عن طريق التفاعل الالكتروستاتيكي.
5. تصفية المخلوط باستخدام تصفية PVDF (0.45 ميكرومتر)، أجهزة الطرد المركزي في 17,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، وريديسبيرسي بيليه في 0.1% هيبيس (50 ميليلتر، 10 مم، الرقم الهيدروجيني 7.5) تحتوي على بروتين استقرار الحصول على المجمع PKA-أوكنب المنقي. الطرد المركزي في 17,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وجمع المادة طافية مقايسة برادفورد في أنبوب 1.5 مل.
تحليل
6. PKA غير محدودة في المادة طافية المحفوظة من الخطوة 3.5 مع مقايسة برادفورد للخلف-حساب مستوى الإحلال PKA على الجسيمات أوكنب، الذي عادة ما يكون مستوى إحلال ~ نمول 4.5 من PKA كل مغ جسيمات.
   ملاحظة: مقايسة برادفورد يكشف لون أزرق قوي في الكريات، مما يوحي تجميد بروتين عالية المستوى ومستقرة دون الامتزاز، بينما الكسر طافية من قفص الحل PKA-أوكنب يظهر لون مماثل حبيس المخزن المؤقت ( الشكل 4 ج-4e).

4. وصف

ملاحظة: المقايسة كيناز ويستخدم لقياس نشاط بيروفات كيناز محددة. وباختصار، الفسفرة الببتيد، الذي يقترن إلى بيروفات كيناز ونازعه لاكتات، ينتج عن أكسدة NADH. ويرصد تشكيل هذا الأخير بقياس الانخفاض في امتصاص NADH في 340 نانومتر.

1. تحديد نشاط PKA و PKA-أوكنب في حجم الخليط المقايسة التي تحتوي على حمض مورفولينيبروبانيسولفونيك 4 (الممسحات، 100 ملم، ودرجة الحموضة 7.5)، مجموع 60 ميليلتر بوكل (100 ملم)، فوسفونولبيروفاتي (بيب، 1 ملم)، أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP، 1 ملم)، β- نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide، خفضت النموذج (NADH، 0.8 ملم) وكلوريد المغنيسيوم (MgCl ₂, 1 ملم)، كيمبتيدي (0.4 ملم) وخليط نازعة بيروفات كيناز/لاكتات (30/40 وحدة من PK/رابطة حقوق الإنسان)-
2. قياس الانخفاض في امتصاص NADH مع مرور الوقت بعد إضافة الحل PKA (2 ميليلتر) إلى خليط المقايسة. حساب منحدر الخط مباشرة تعكس نشاط كيناز يجري قياسه.
3. قياس نشاط PKA-أوكنب ¹⁵ والنشاط العام، والتي يجب أن تتطابق تماما مع الضرب المنتج الأصلي PKA محددة النشاط ومبلغ المغلفة بسطح PKA محسوب.

5. الإعداد التحلل

1. الاتفاقات البيئية المتعددة الأطرافإليها باعتبارها قوة الضوء جميع المصادر باستخدام جهاز استشعار حراري كومة وحساب كثافة الطاقة (PD = الطاقة (W)/المنطقة (سم ²)) ¹⁸ استناداً إلى منطقة بقعة الضوء.
2. القيام بتجارب في المختبر الأشعة فوق البنفسجية التحلل الضوئي على نظام تجاري مع 365 نانومتر الصمام (200 ميغاواط/سم ²) ¹⁵-
3. فوتواكتيفيشن "للأشعة فوق البنفسجية" على المسرح المجهر، وإلقاء الضوء على الحل أوكنب PKA مع الإثارة الخفيفة تتم تصفيتها بواسطة مكعب تجاري ¹⁵.
   ملاحظة: هو كثافة الطاقة ~ 15 ميغاواط/سم ²، دون التركيز عدسة الهدف.
4. في المختبر فوتواكتيفيشن نير على المسرح المجهر، إلقاء الضوء على الحل PKA-أوكنب باستخدام ليزر 980 نانومتر مع إعدادات عامل التصفية/مرآة upconversion مخصصة مثبتة على مسار الطبقة السفلي الخفيفة، مرآة مزدوج اللون (850 نانومتر قصيرة-تمرير)، و عامل تصفية إثارة (950 نانومتر طويلة-تمرير).
   ملاحظة: هو كثافة الطاقة الناتج 5 واط/سم ² قبل 4 X عدسة الهدف التركيز. كثافة الطاقة يقدر بنحو ~ 68 ث/سم ² بعد 4 × تركز عدسة الهدف.

6. خلية إعداد العينة و Microinjection مجمعات PKA-أوكنب

1. قبل تصفية العينات من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر بعد التثبيت PKA (الخطوة 3، 5)-
2. احتضان الخلايا في 10% مصل بقرى الجنين (FBS) تحتوي على L-15 المتوسطة خلال فترة microinjection لمراقبة درجة الحموضة مستقرة خارج الحاضنة.
   ملاحظة: للتأكد من إتمام microinjection، شارك حقن الأصلية PKA-أوكنب، أوكنب PKA محبوس، أو سي أوكنب (7.5 مغ/مل) ¹⁵ 5 6-كاربوكسيتيتراميثيلرهوداميني (طمره) (10 ميكرومتر) في الخلايا.
3. ضبط تركيز الجسيمات PKA-أوكنب أن، بعد microinjection، تركيز سيتوسوليك 1-3 ميكرومتر PKA-مجموعة تركيز فسيولوجية ل PKA في خلية، مع افتراض أن حجم الحقن هو 1/10 حجم الهاتف الخلوي .
4. أداء microinjection في الخلايا (الخطوة 6.2) باستخدام جهاز ميكروينجيكتور مقرونا محور واحد ميكرومانيبولاتور هيدروليكية ( الشكل 3).
5. استخدام مقياس الضغط رقمي لمراقبة الضغوط التي مورست قبل ميكروينجيكتور في نطاق التشغيل (~ 50-200 hPa) وختم صمام موزع في حجرة الضغط على مخصصة لتوفير التعويض الضغط ل microinjection. سحب الإبرة استخدام ساحبة.
6. الحفاظ على ضغط الحقن بين 50 و 75 hPa، مع وقت حقن ms 200-300 والضغط التعويض في 15 hPa لمنع الدفق المتوسطة الثقافة في إبرة بعمل شعري.
7. دراسة الفتحات نصيحة من الإبر ضمان أن تكون لديهم قطر خارجي بين 1.3 و 1.5 ميكرومتر، التي يمكن تأكيدها بأخذ الصور باستخدام عدسة هدف 40 x-
أغسل
8. الخلايا مع 2 مل من L-15 المتوسطة التي تحتوي على 10% FBS بعد microinjection. مراقبة تصوير fluorescence الخلوية من-كاربوكسيتيتراميثيل-والرودامين 5 (6) (طمره) للتأكد من إتمام microinjection.

7. فوتواكتيفيشن من قفص PKA-أوكنب باستخدام الأشعة فوق البنفسجية أو ضوء الجرد في "الخلايا الحية"

فوتواكتيفيشن

1. "للأشعة فوق البنفسجية" بعد microinjection PKA-أوكنب، تنمو الخلايا REF52 على طبق 3.5 ميكرون ومكان لهم في مرحلة مجهر، ويتهددها لهم مع تصفية بواسطة الأشعة فوق البنفسجية المكعب لمدة 3 دقيقة دون التركيز عدسة الهدف.
   ملاحظة: REF52 وأبقى على الخلايا في دميم التي تحتوي على 10% FBS في 37 درجة مئوية في 5% CO ₂ حاضنة، والخلايا وكانت سوبكولتوريد عندما كونفلوينسي وصلت إلى 90% كل 2-3 أيام-
2. فوتواكتيفيشن "للجرد" بعد microinjection PKA-أوكنب، تضيء الخلايا على 980 نانومتر ليزر من إعدادات تصفية الطبقة السفلي/مرآة، كما هو موضح في الخطوة 5، 4-
   ملاحظة: إخراج كثافة الطاقة وهو 5 واط/سم ² قبل 10 X عدسة الهدف التركيز يقدر بنحو 300 واط/سم ² بعد 10 x عدسة الهدف التركيز. Upconversion هو عملية تتطلب كثافة عالية فوتون، لا سيما عند الحاجة إلى تحول أنتيستوكي أكبر. ومن ثم يلزم التركيز أثناء فوتواكتيفيشن.
تشعيع
3. عند الحاجة إلى بقعة ضوء أكبر (650 مكم x 520 ميكرومتر)، هذه الخلايا مع تقرير الجرد الوطني ركز بعدسة هدف العاشر 10 مع صيد تلسكوب ل 15 دقيقة السماح لفاصل الظلام 5 دقائق بعد كل تشعيع 5-دقيقة لتجنب التدفئة.
   ملاحظة: عند الحاجة مكانية-دقة عالية (بقعة الضوء سوبسيلولار)، استخدام عدسة الهدف X 40 مع ثقب المثبتة في نهاية المطاف الخروج من توجيه الضوء لتوليد بقعة ضوء سوبسيلولار البعد (5 ميكرون x 4 ميكرومتر). في هذه الحالة، 1 s تشعيع ما يكفي نير فوتواكتيفيشن بسبب ارتفاع تدفق الفوتونات.
4. التحلل بعد الأشعة فوق البنفسجية أو الجرد، تسمح للخلايا لاسترداد في 5% CO ₂ حاضنة في 37 درجة مئوية ح 1 في المتوسط كاملة لتوليد الاستجابات الخلوية. في وقت لاحق، إصلاحها في 1 مل من 4% بارافورمالدهيد/الفوسفات-مخزنة المالحة (PBS) لمدة 20 دقيقة قبل مواصلة تلطيخ.
   تنبيه: بارافورمالدهيد شديدة السمية؛ تجنب ملامسة الجلد أو العينين أو الأغشية المخاطية. تجنب التنفس المسحوق أثناء قياس وإعداد-

8. التصور "إجهاد الألياف التفكك الناجمة عن نير فوتواكتيفيشن"

1. بعد التثبيت، استخدم أليكسا 594-فالويدين (إضافة 5 ميليلتر من 6.6 مكم الحل الأسهم إلى 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لتلطيخ؛ واحتضان لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) وصمة عار و تصور الألياف الإجهاد. تصور صور أليكسا 594-فالويدين (ت 581 نانومتر nm/م 609) باستخدام عامل تصفية مجموعة-
2. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) في درجة حرارة الغرفة. بعد تلطيخ، غسل العينات مع برنامج تلفزيوني وتأخذ كل على حدة الصور الفلورية ألياف الإجهاد ونوى-

النتائج

ويتضح تصميم بناء قفص الإنزيم-أوكنب في الشكل 1. أولاً كان رد فعل الإنزيم PKA مع بروميد 2-نيتروبينزيل لتوليد PKA محبوس غير نشط، ومن ثم المعطل تداولها الكهربية الاستاتية على سطح أوكنب. تنبعث منها في ضوء تحويل أوكنبس ونتيجة لذلك فوتوليتيكالي تنشق الجماعات س-نيترو...

Discussion

سابقا، هوفمان وزملاء العمل وجدت أن التغييرات الشكلية المثيرة وقد لوحظت في الخلايا REF52 بعد microinjection PKA الحرة¹⁹. وفي دراسة أخرى، أن المجموعة لورانس أثبتت أن PKA محبوس يمكن تفعيلها في فيفو، مما يؤدي إلى التغييرات الشكلية وتفكك ألياف الإجهاد عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية التح...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma	154563
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272
MOPS	Sigma	M1254
HEPES	Sigma	H4034
Sodium chloride	Sigma	31434
Potassium chloride	Sigma	12636
Yttrium acetate hydrate	Sigma	326046	Y(C2H3CO2)3 · xH2O
Thulium(III) acetate hydrate	Alfa Aesar	14582	Tm(CH3CO2)3 · xH2O
Ytterbium(III) acetate tetrahydrate	Sigma	326011	Yb(C2H3O2)3 · 4H2O
1-Octadecene	Sigma	O806
Oleic acid	Sigma	364525
Methanol	macron	304168
Sodium hydroxide	Sigma	30620
Ammonium fluoride	J.T.Baker	69804
IGEPAL CO-520	Sigma	238643
Cyclohexane	J.T.Baker	920601
Ammonium hydroxide (28% - 30%)	J.T.Baker	972101	Ammonia
Tetraethyl orthosilicate (TEOS)	Sigma	8658
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D0632
N-hydroxymaleimide (NHM)	Sigma	226351	PKA activity blocking reagent
Prionex protein stabilizer solution from hog collagen	Sigma	81662	Protein stabilizer solution
2-nitrobenzyl bromide (NBB)	Sigma	107794	PKA caging reagent
8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma	C3912	8-CPT-cAMP
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	Sigma	P0294	PK/LDH
Adenosine 5'-triphosphate disodium	Sigma	A2387	ATP
β-NADH reduced from dipotassium	Sigma	N4505
Phosphoenolpyruvate	Sigma	P7127	PEP
Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL	Thermo Scientific	23200	Bradford assay reagent
cAMP-dependent protein kinase	Promega	V5161	PKA activity control
pET15b-PKACAT plasmid	Addgene	#14921
pKaede-MC1 plasmid	CoralHue	AM-V0012
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Scientific	10010023
DMEM, high glucose, pyruvate	Gibco	12800-017	Cell culture medium
Leibovitz L-15 Medium	Biological Industries	01-115-1A	Cell culture medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1A
Paraformaldehyde	ACROS	416785000
DAPI	Invitrogen	D1306	Nucleus staining dye
Alexa 594-phalloidin	Invitrogen	A12381	F-actin staining dye
5(6)-Carboxytetramethylrhodamine	Novabiochem	8.51030.9999
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23200
CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da	Membrane Filtration Products, Inc.	1430-33	Dialysis membrane
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized	EMD Milipore	SLHVX13NL
Equipment
Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS	Malvern	M104
Transmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1400
Fluorescence Spectrophotometer	Agilent Technologies	10075200	Cary Eclipse
UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies	10068900	Cary 50
Fluorescence Microscope	Olympus	IX-71
950 nm longpass filter	Thorlabs	FEL0950
850 nm dichroic mirror shortpass	Chroma	NC265609
RT3 color CCD system	SPOT	RT2520
Fluorescence Illumination	PRIOR	Lumen 200
980 nm Infra-red diode laser	CNI	MDL-N-980-8W
UV LED Spot Light Source	UVATA	UVATA-UPS412	With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2
Thermal pile sensor	OPHIR	12A-V1-ROHS
Picospritzer III	Parker Hannifin	052-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
PC-10 Needle puller	Narishige	PC-10
MANOMETER Digital pressure gauge	Lutron	PM-9100
One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-220A
Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated	Thermo Scientific	75002421