التمييز وتوصيف السكان غير المتجانسة باستخدام تقنيات التصوير الكمي

Summary

قمنا بتطوير بروتوكول جديد لدراسة الديناميات السكانية غير المتجانسة في الاستجابة للاضطرابات. تصف هذه المخطوطة منصة تعتمد على التصوير تنتج مجموعات بيانات كمية لتوصيف في وقت واحد من المظاهر الخلوية متعددة من السكان غير المتجانسة بطريقة قوية.

Abstract

العمليات الخلوية معقدة وتنتج عن التفاعل بين أنواع الخلايا المتعددة وبيئتها. غالبا ما لا تسمح تقنيات البيولوجيا الخلوية الحالية بتفسير دقيق لهذا التفاعل. باستخدام نهج الكمي القائم على التصوير، نقدم بروتوكول عالية المحتوى لتوصيف الاستجابات الظاهرية الديناميكية ( أي تغيرات مورفولوجيا، وانتشار، موت الخلايا المبرمج) من السكان الخلايا غير المتجانسة للتغيرات في المحفزات البيئية. نحن نسلط الضوء على قدرتنا على التمييز بين أنواع الخلايا على أساس إما كثافة مضان أو ملامح مورفولوجيا الأصيلة اعتمادا على التطبيق. هذه المنصة تسمح لتوصيف أكثر شمولية من استجابة السكان الفرعي للاضطراب أثناء استخدام وقت أقصر، كميات صغيرة من الكواشف، وانخفاض احتمال الخطأ من المقايسات البيولوجيا الخلية التقليدية. ومع ذلك، في بعض الحالات، قد يكون من الصعب تحديد السكان الخلية و كوانتيتات على أساس الخلوية المعقدةلير وسوف تتطلب المزيد من استكشاف الأخطاء وإصلاحها. ونحن نسلط الضوء على بعض هذه الظروف في البروتوكول. علينا أن نظهر هذا التطبيق باستخدام الاستجابة للدواء في نموذج السرطان. ومع ذلك، فإنه يمكن بسهولة أن تطبق على نطاق أوسع إلى العمليات الفسيولوجية الأخرى. يسمح هذا البروتوكول واحد لتحديد الفئات السكانية الفرعية داخل نظام الثقافة المشتركة وتوصيف استجابة معينة من كل إلى المحفزات الخارجية.

Introduction

وكانت المقايسات القائمة على الخلايا عاملا أساسيا في البحوث الأساسية وإعدادات المخدرات المخدرات. ومع ذلك، فإن القيود المفروضة على هذه المقايسات القياسية أصبحت واضحة على نحو متزايد مع التناقض بين في المختبر والبيانات السريرية وفشل معظم الأدوية للحصول على موافقة ادارة الاغذية والعقاقير. هنا، نقدم طريقة جديدة لاستخدام التصوير الكمي لتحليل في وقت واحد الظواهر غير المتجانسة ردا على المحفزات البيئية ذات الصلة، التي تحدث المشتركة.

المقايسات القائمة على الخلية التقليدية التي تستخدم لقياس بقاء الخلية ما يلي: المقايسات استبعاد التريبان الأزرق، مت / متس، والملحق V- فيتس تلطيخ الخلوي التدفق. تريبان المقايسات استبعاد الأزرق، في حين بسيطة وغير مكلفة، تتطلب عددا كبيرا من الخلايا، وتستغرق وقتا طويلا، وغالبا ما تتأثر التحيز المستخدم ¹ . مت و المقايسات متس قياس غير مباشر بقاء الخلية من خلال قياسات معدل الأيض الميتوكوندريا. ومع ذلك، فإن النشاط الأيضيتي من الخلايا يمكن أن تتأثر ظروف الثقافة المختلفة (مثل وسائل الإعلام أو تركيز الأكسجين)، الأمر الذي يؤدي إلى نتائج غير دقيقة ويمنع التوحيد عبر أنواع الخلايا والشروط ^{2 ، 3} . عيب رئيسي آخر من هذه التقنيات هو عدم قدرتها على التمييز بين أنواع الخلايا متعددة - معظم النظم البيولوجية هي هيتيروسلولار. في حين أن أساليب التدفق الخلوي لديها القدرة على التمييز بين السكان خلية متعددة، مطلوب تسميات الخلية، أخذ العينات ديناميكية صعبة، وعند استخدام الخلايا الملتصقة، يصبح هذا التطبيق تستغرق وقتا طويلا والخطأ عرضة.

تحدث المظاهر الخلوية الهامة الأخرى، بما في ذلك التغيرات المورفولوجية، استجابة للمؤثرات البيئية ولكن لا يتم التقاطها بواسطة المقايسات التقليدية القائمة على الخلية. التنميط الحالات الخلية من خلال توصيف المورفولوجية ورسم خرائط أوجه التشابه عبر العينات هو أداة قوية وغير منحازة مع أبيليتي لتقديم رؤى جديدة في العديد من جوانب البحوث الأساسية والترجمة، بما في ذلك البيولوجيا الخلية الأساسية واكتشاف المخدرات ⁴ . وعلاوة على ذلك، وقد ثبت مورفولوجيا الخلايا السرطانية لربط مع الأنواع الفرعية الورم ⁵ والعدوانية ⁶ . وبالتالي، فمن مصلحة كبيرة لدراسة هذه الميزات الخلوية وكيفية ارتباطها الاضطرابات البيئية محددة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن استخدام الاختلافات في السمات المورفولوجية للتمييز بين المجموعات السكانية الفرعية في نظم الثقافة المشتركة. فلوريسنتلي الخلايا وضع العلامات لديه شلالات ( أي تغيير خصائص الخلايا الكامنة، تستغرق وقتا طويلا) وبالتالي أساليب إضافية لتصنيف أنواع الخلايا هي مفيدة.

التصوير القائم على الفحص المجهري هو طريقة بديلة لتحديد المظاهر الخلوية بطريقة متعددة، وكمية، وقوية. في هذه المخطوطة، نطبق خط أنابيب التصوير الكمي لتسليط الضوء على إفولوتيوديناميات ناري من السكان الخلايا غير متجانسة داخل الورم. ونحن نركز على التفاعل بين الخلايا غير الصغيرة سرطان الرئة الخلايا (نسكلك) والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان (كافس)، الأكثر انتشارا نوع الخلايا اللحمية وجدت في الأورام. وقد تورط كافس في بدء الورم، والتقدم، والاستجابة العلاجية. وبالتالي، وإجراء المقايسات المظهري على الخلايا السرطانية في غياب كافس يمكن أن يكون مضللا ^{7 ، 8 ، 9} . على وجه التحديد، قمنا بتقييم آثار كافس على الخلايا السرطانية ردا على إرلوتينيب، وهو جزيء صغير يستهدف البشرة عامل النمو مستقبلات (إغفر) التي غالبا ما تستخدم في العلاج السريري لل نسكلك. لقد استخدمنا منصة فحص عالية المحتوى وبرامجها المصاحبة لتحليل الصور للتقييم؛ ومع ذلك، في محاولة لجعل هذه المنهجية في متناول الباحثين الآخرين وضعنا أيضا بروتوكول المصب مماثلة باستخدام البرمجيات مفتوحة المصدر:سيلبروفيلر ¹⁰ و سيلبروفيلر محلل ¹¹ . يتم تحليل معظم المقايسات فحص عالية المحتوى القائم على صورة مع البرمجيات التجارية محددة لنموذج صك معين. النتائج يصعب تكرارها في مختبرات أخرى مع برامج مختلفة لأن الخوارزميات الكامنة غالبا ما تكون ملكية. باستخدام هذه الأنابيب القائمة على الصورة، تم قياس تكاثر الخلايا، والموت، والتشكل من كل مجموعة فرعية من ثقافة مغاير استجابة للعلاج من تعاطي المخدرات باستخدام كل من الفلورسنس والتصنيف القائم على التشكل. يوفر البروتوكول التالي منهجية قوية للبحث في العمليات الخلوية المعقدة.

Protocol

1. خلية الثقافة

ملاحظة: هنا تم التحقيق الاستجابات الظواهر من الخلايا نسكلك (H3255) إلى وكيل استهداف إغفر، إرلوتينيب، عندما شارك في مثقف مع الخلايا الليفية الرئة (كسد-19Lu غفب). لنفس مجموعة البيانات، ومقرها مضان والتصنيف القائم على التشكل من السكان خلية اثنين (H3255 و كسد-19Lu غفب) لتجسيد التوافق. ومع ذلك، لا بد من استخدام أسلوب تصنيف واحد فقط وينبغي اختياره بناء على التطبيق.

1. إعداد 500 مل من رمي-1640 تستكمل مع 10٪ فبس المعطل الحرارة و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
   ملاحظة: يمكن استبدال المتوسطة النمو والمكملات الغذائية كما هو مطلوب لأنواع الخلايا الأخرى.
2. خلايا الثقافة في 10 سم ³ لوحات كما السكان النقي في 5٪ كو ₂ عند 37 درجة مئوية والمرور في نسبة مناسبة كل 3-4 أيام.

2. إعداد الخلايا

1. لإعداد تعليق خلية، وإزالة جإل وسائل الإعلام وغسل الخلايا مع 5 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس).
2. نضح قبالة برنامج تلفزيوني، إضافة 1 مل من 0.05٪ التربسين تحسنت إلى 37 درجة مئوية واحتضان لمدة 5 دقائق (أو حتى الخلايا لم تعد التمسك لوحة) عند 37 درجة مئوية.
3. لتحييد التربسين، إضافة 4 مل من رمي إلى H3255 و كسد-19Lu غفب لوحات والماصة حلول الخلايا إلى 15 مل أنابيب مخروطية.
4. خلايا الطرد المركزي في 150 x ج لمدة 5 دقائق في رت.
5. نضح قبالة طاف و ريسوسبيند الكريات خلية في 10 مل من وسائل الإعلام رمي في أنابيب مخروطية للتحضير للبذر.

3. خلية تصفيح

1. عد الخلايا لتوحيد البذر.
   1. عكس أنابيب لخلط الخلايا في الحل. ماصة 10 ميكرولتر من كل تعليق خلية في أنبوب ميكروسنتريفوج وإضافة 10 ميكرولتر الأزرق التريبان.
   2. ماصة 10 ميكرولتر من هذا الحل في شريحة العد الخلية وإدراجها في عداد الخلية الآلي.
      ملاحظة: طرق أخرى من عد الخلايا ( أي. عدادة الكريات).
   3. كرر عدد الخلايا ثلاث مرات على الأقل، أو حتى يتم الحصول على التهم التي يتم الحصول عليها.
2. خلايا البذور على لوحة متعددة جيدا
   ملاحظة: عدد لوحات البذور يعتمد على عدد من النقاط الزمنية التي سيتم تصويرها. بدلا من ذلك، لوحة واحدة يمكن إعادة تصويرها مع مرور الوقت إذا تم ترانزدوسد الخلايا مع هيستون-2B-غفب (أو غيرها من البقع النووية لنتيفيرال مستقرة التي توفر تجزئة النووية كافية).
   1. البذور ما مجموعه 1500 خلية / جيدا في 100 ميكرولتر من رمي. إعداد ثلاثة تعليق خلية إلى لوحة ثلاثة سكان الخلية: H3255، كسد-19Lu غفب، و 50٪ H3255 + 50٪ كسد-19Lu غفب. أداء كل في ثلاث نسخ مع الاجهزة لوحة متطابقة لكل نقطة زمنية.
      ملاحظة: يجب أن تكون الأمثل الكثافة البذر الأولية لكل خط الخلية وحجم اللوحة.
   2. خلايا البذور في لوحات 3 × 96 جيدا باستخدام ماصة الأقنية. احتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية، 5٪ كو ₂ .

4. المخدرات الجرعات

1. إضافة دمسو إلى مسحوق إرلوتينيب لجعل الحل النهائي إرلوتينيب الأسهم من تركيز 10 ملم.
   ملاحظة: الدواء يمكن أن تكون بديلا كما هو مطلوب.
2. تمييع المخدرات مع وسط ثقافة الخلية إلى 2X التركيز النهائي مع أعلى تركيز النهائي في 10 ميكرومتر وتسلسل تمييع أربع مرات في نسبة 01:10، لما مجموعه خمسة تركيزات المخدرات وعدم وجود مراقبة المخدرات.
   ملاحظة: إذا كان تركيز دمسو يساوي أو يتجاوز 0.1٪ v / v في أعلى جرعة الدواء، لا ينبغي أن تحتوي على أي مكافحة المخدرات على كمية مماثلة من دمسو لضمان الآثار الملاحظة لوحظ لا يرجع إلى سمية دمسو.
3. ماصة 100 ميكرولتر من محلول المخدرات في البئر المناسب لتركيز الدواء النهائي من 1X المخفف في وسائل الإعلام.

5. صورة اكتساب

ملاحظة: تم الحصول على الصور في أيام 0 و 2 و 3. اعتمادا على أنواع الخلايا والعمليات الخلوية التي يجري دراستها، سيمكن دراسة نقاط الوقت المطلوبة.

1. خلايا وصمة عار للتحضير للتصوير.
   1. تشكل الحل صبغ في التركيزات النهائية التالية.
      1. للتصنيف القائم على مضان، وإعداد 5 ميكروغرام / مل وصمة عار النووية و 5 ميكرومتر وصمة عار خلية ميتة في برنامج تلفزيوني (انظر جدول المواد ).
      2. للتصنيف القائم على التشكل، وإعداد 5 ميكروغرام / مل وصمة عار النووية، 5 ميكرومتر وصمة عار خلية ميتة، و 5 ميكرومتر وصمة عار الخلية في برنامج تلفزيوني (انظر جدول المواد ).
   2. إضافة 20 ميكرولتر حل صبغ لكل بئر. احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية المحمية من الضوء.
2. تحسين والحصول على الصور.
   1. إزالة لوحة جيدا من حاضنة، يمسح الجزء السفلي من لوحة مع 70٪ إتوه، ووضع لوحة في غرفة التصوير.
   2. في علامة التبويب "إعداد"، انقر على الزر "+" ضمن "تحديد القناة" لإضافة قنوات مناسبة إلى( أي برايتفيلد، وصمة عار النووية، وصمة عار الخلية الميتة، غفب، وإشارات رفب).
   3. انقر فوق "اختيار تخطيط"، واتخاذ صور اختبار مكدسة ض كل 2 ميكرون بدءا من 0 ميكرون وتنتهي في 20 ميكرون لتحديد الطائرة من التركيز. أدخل هذه المسافة لكل قناة ضمن "الارتفاع".
   4. انقر فوق "لقطة" تحت كل قناة لتقييم الشدة وتحسين أوقات التعرض. أدخل قيم أعلى أو أقل ضمن "الوقت" كما هو مطلوب.
   5. على الجانب الأيمن من الشاشة، وتسليط الضوء الآبار المناسبة (ليتم تصويرها) على لوحة التخطيطي. في الآبار التخطيطي أدناه، تسليط الضوء على الحقول الخمسة والعشرين ليتم تصويرها بطريقة مماثلة.
   6. تحت "تشغيل التجربة"، وتحديد لوحة في "اسم اللوحة" على علامة التبويب اليسرى، وانقر على زر "ابدأ" (تحتها) لتشغيل بروتوكول الحصول على الصور مع هدف 10X لتوليد الصور تيف الرمادية في القنوات المذكورة أعلاه.
      ملاحظة: خطوة بخطوة إنستقد تختلف الاختلافات لبروتوكول التصوير بين الأدوات، ولكن يجب أن تظل القيم المعلمة الأمثل.
   7. كرر التصوير على أيام اثنين وثلاثة.

6. تحليل الصورة

ملاحظة: تم تنفيذ جميع تحليل الصور باستخدام البرمجيات الملكية. ومع ذلك، ولأن هذه ليست متاحة للجمهور، تم تصميم تحليلات مماثلة أيضا على سيلبروفيلر 2.2 ومحلل سيلبروفيلر 2.0، مع بروتوكول موجز المدرجة أدناه والبروتوكول مفصلة كمادة تكميلية (صور الاختبار هي بالفعل تحميلها في خطوط الأنابيب لاختبار سير العمل). تم تجميع الصور من هذه التجربة معا على أساس كل جيدا بحيث يمكن تحميل كل بئر بشكل فردي. تحتوي خطوط أنابيب سيلبروفيلر أدناه على تعبير منتظم يقوم بتحليل معلومات البيانات الوصفية من كل اسم ملف صورة ويسمح بتجميع الصور بشكل أكبر حسب القناة.

1. تحميل وتثبيت برنامج مفتوح المصدر: 'سيلبروفيلر9؛ و "محلل سيلبروفيلر". قبول كافة الخيارات والإضافات الافتراضية أثناء التثبيت.
2. تصنيف الثقافات غير المتجانسة إلى مجموعات سكانية فرعية.
   1. افتح البرنامج 'سيلبروفيلر'، انقر فوق 'ملف' | 'خط أنابيب الاستيراد' | 'من ملف'، وحدد الملف المناسب ("Fluorescence_Classification.cppipe" للتصنيف القائم على مضان ، أو "Morphology_Classification.cppipe" للتصنيف القائم على التشكل).
      ملاحظة: تحتوي هذه الملفات على بروتوكولات لمعالجة الصور الأساسية وتجزئة النوى / الخلية. بسبب متفاوتة هوشست وصمة عار الحاضر عبر هذه الخلايا، كانت مجزأة نواة ومكبرة، ثم تستخدم لإخفاء الصورة للسماح لتجزئة نوى مع كثافة أقل.
      1. حدد خط أنابيب التصنيف القائم على مضان لتصنيف الخلايا إما H3255 أو كسد-19Lu على أساس كثافة إغف، وحساب ميزات التشكل.
         ملاحظة: كسد-19Lu كانت الخلايا ترانزدوسد مع غفب.
      2. حدد خط أنابيب تصنيف المستندة إلى التشكل لتقسيم النوى والخلايا، وحساب ميزات التشكل.
         ملاحظة: هناك حاجة إلى مزيد من التحليل المصب في "محلل سيلبروفيلر" للتصنيف. وتصنف الخلايا الميتة عن طريق التصنيف القائم على مضان.
   2. انقر فوق "عرض إعدادات الإخراج" في الجزء السفلي الأيسر من الشاشة. حدد موقع ملفات الصور للتحليل ('مجلد الإدخال الافتراضي') ووجهة البيانات المستخرجة ('مجلد الإخراج الافتراضي').
   3. انقر فوق "تحليل الصور" لبدء التحليل. عند اكتمال التحليل، انقر فوق "موافق" وانتقل إلى "مجلد الإخراج الافتراضي" لعرض البيانات المحسوبة.
      ملاحظة: قيم معلمات المثال والصور متوفرة في الملف التكميلي 1-CellProfilerProtocol.pdf .
   4. للتصنيف القائم على التشكل (فقط) القيام بما يلي.
      1. فتح برنامج 'سيلبروفيلر محلل'، حدد ملف خصائص قاعدة البيانات التي تم إنشاؤها في سيلبروفيلر، ثم انقر فوق 'فتح'.
      2. انقر على علامة التبويب "المصنف" في الجزء العلوي الأيمن من الشاشة. لاستدعاء الصور خلية عشوائية من التجربة، انقر فوق "جلب". ستظهر الصور في النافذة غير المصنفة.
   5. تصنيف الخلايا يدويا كما إيجابية (H3255) أو سلبية (كسد-19Lu) عن طريق تحديد وسحب الخلايا إلى بن مناسب (انظر الملف التكميلي 2-Pipeline.pdf : الشكل B ). بعد تصنيف ما لا يقل عن 50 خلية لكل مجموعة فرعية، انقر فوق "تصنيف المصنف"، ثم انقر فوق "تحقق التقدم".
      ملاحظة: يتم تصنيف الخلايا عن طريق خوارزمية التعلم آلة الغابات التي يشرف عليها المستخدم عشوائية ¹² . إذا لم تكن الدقة فوق العتبة المعتمدة (> 90٪)، قد يكون من الضروري العودة وتحسين تجزئة الخلايا على 'سيلبروفيلر'، أو قد لا تكون الخلايا مثالية للكلاسيمن خلال التشكل.
   6. انقر فوق "نقاط الكل" لإنشاء جدول مع التهم الخلية لكل فئة فرعية.

النتائج

أنشأنا مجموعة صور تتألف من 25 حقل / جيدا، 54 بئرا / لوحة (3 خلايا السكان × 6 تركيزات المخدرات × 3 مكررات)، عبر ثلاث لوحات لما مجموعه 4050 الصور الفردية. تم تحليل مجموعات الصور التي تم إنشاؤها على مدى التجربة باستخدام البرمجيات الملكية (انظر جدول المواد) لاستخراج مختلف الخصائص الكمية للخلايا ( أي التشكل، مضان) والتي يمكن أن تستخدم بعد ذلك لتصنيف المجموعات السكانية الفرعية الخلية. ومع ذلك، لأن البرامج التجارية المستخدمة لديها وصول محدود، تم إنشاء خطوط الأنابيب المصب مماثلة في سيلبروفيلر ومحلل سيلبروفيلر.

تصنيف غير متجانسة إلى مجموعات سكانية فرعية

تم تحديد النوى وتجزئة على أساس وصمة عار الحمض النووي (هنا هويشت) وتصنيف السكان الخلية إما على أساس مضان أو موريفولوجي ( الشكل 1 ). لتصنيف القائم على مضان، كانت الخلايا الليفية (كسد-19Lu) ترانزدوسد سابقا مع غفب-لنتيفيروس. تم قياس مستويات كثافة غفب لكل نواة، وتلك التي تم حسابها فوق العتبة المقبولة (استنادا إلى إشارة الخلفية) تم تصنيفها على أنها كسد-19Lu بينما تم تحديد تلك أدناه كخلايا ورم (H3255). للتصنيف القائم على التشكل، كانت الخلايا ملطخة سابقا مع وصمة عار الخلوية غير سامة (انظر الجدول من المواد)، وكان هذا لتحديد وتجزئة السيتوبلازم. تم تدريب خوارزمية التعلم الآلي مع الخلايا ~ 50-100 من كل السكان. تم التعرف على الخصائص المورفولوجية التي كانت مختلفة بشكل كبير بين السكان، والتي كانت تستخدم بعد ذلك لتصميم مصنف خطي للتمييز بين خلايا كسد-19Lu و H3255. كانت مضان والبروتوكولات تصنيف التشكل 97.4٪ (ن = 1403) متماثلة في التمييز بين اثنين من الخلايا بوبولالأفيونات في ظروف غير المعالجة و 92.5٪ (ن = 916) متفق في ظروف علاج المخدرات (1 ميكرومتر إرلوتينيب) ( الشكل 2 ).

التحاليل النمطية للقطاعات الفرعية

بالإضافة إلى التمييز بين أنواع الخلايا، ونحن تهدف إلى تميز الخصائص الظاهرية لكل فئة فرعية. مضاعفات المقايسات يوفر الوقت والكواشف، ويضيف الاتساق، ويوفر معلومات إضافية بشأن النظام قيد الدراسة. هناك العديد من النواتج المظهرية المحتملة، وينبغي للمرء أن يختارها على أساس الأسئلة ذات الاهتمام. هنا، تم التحقيق في التغيرات في مورفولوجيا الخلية وحالة البقاء على قيد الحياة ردا على علاج إرلوتينيب. بعد ثلاثة أيام من العلاج من تعاطي المخدرات، لوحظ انخفاض في المنطقة النووية وزيادة في المنطقة الخلوية للخلايا H3255 ( الشكل 3A ). متوسط ​​الفرق في المجال النووي بينتم العثور على "غير مخدر" و "المخدرات" السكان المعالجة أن تكون ذات دلالة إحصائية عن طريق نوع من جانبين من 2 (التباين المساواة) t -test ( p = 7.92 × 10 ^-16 ). نحن نفترض أن هذه الملاحظة هي استجابة الخلوية إلى الإجهاد المفروضة من قبل العلاج من تعاطي المخدرات.

ومن المهم أيضا دراسة ما إذا كان الدواء له سامة للخلايا ( أي زيادة في عدد الخلايا الميتة مع مرور الوقت) أو تثبيط الخلايا ( أي انخفاض في عدد الولادات الخلوية مع مرور الوقت) تأثير على الخلايا، وهذا له تأثير سريري عميق. على سبيل المثال، تأثير المخدرات تثبيط الخلايا يؤدي إلى اعتقال النمو حتى الآن لا يلغي الخلايا من الورم، وبالتالي هناك إمكانية للخلايا السرطانية لإعادة التكاثر الخلايا مرة واحدة يتم إزالة المخدرات. آثار المخدرات غالبا ما يكون السياق، والتركيز، ونوع الخلية تعتمد. لاحظنا سابقا إرلوتينيب استحضار استجابة السامة للخلايا في نوع واحد من الخلايا، في حين تبين أساستجابة الارتجاع في ¹³ آخر.

اختبارات المقايسة التقليدية الناتج عدد الخلايا النسبية، وبالتالي، لا تميز بين الاعتقالات النمو والموت الخلية. هنا، تم تحديد الخلايا الميتة على أساس وصمة عار يوديد بروبيديوم ( الشكل 3B ). وقد لوحظت كل من السامة للخلايا وآثار تثبيط الخلايا من إرلوتينيب على خلايا H3255، مع زيادة في عدد الوفيات وانخفاض في عدد الولادات بعد العلاج من تعاطي المخدرات ( الشكل 3C ). ومن الجدير بالذكر أن عدد الخلايا الميتة يسقط بعد يوم 1 المرجح بسبب إزالة الخلايا. لم تتأثر خلايا كسد-19Lu من المخدرات. ميزة إضافية من هذا المنبر هو توليد البيانات الكمية. على سبيل المثال، في تجربتنا في الثقافة المشتركة، تم العثور على مجموعة فرعية أولية من 1،118 (75.8٪) H3255 الخلايا لتكون 2،817 (87.9٪) أو 396 (57.2٪) بعد ثلاثة أيام دون أو مع إرلوتينيب العلاج، على التوالي ( الشكل 4 ). لأننا يمكن أن تولد التهم الخلية الفعلية بدلا من النسبة المئوية النسبية (كما هو الحال مع أساليب التدفق الخلوي)، نستنتج أن التغيير في تكوين خلال العلاج من تعاطي المخدرات ويرجع ذلك إلى انخفاض في خلايا H3255 وليس زيادة في كسد-19Lu. ومن الجدير بالذكر أن معدلات الوفيات قد يكون التقليل من شأنها بسبب إزالة الخلايا، وهو أمر صعب لتقييم تجريبيا ومن المرجح أن تختلف عبر أنواع الخلايا.

الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول تحليل الصور. اثنين من خطوط أنابيب تحليل الصور المصب المحتملة لتصنيف السكان غير المتجانسة باستخدام إما التصنيف القائم على التشكل أو التصنيف القائم على الفلورسنس. الحانات مقياس = 100 ميكرون. الرجاء النقر عليهاه لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التوافق بين التشكل والتصنيف القائم على مضان. ( A ) مؤامرة التوافق عرض التداخل لبروتوكولات التصنيف اثنين. تم تصنيف الخلايا نفسها على أنها H3255 باستخدام كل من التشكل- مورفولوغي ومقرها مضان. تم الاتفاق على اثنين من البروتوكولات، مع تصنيف 97.4٪ (n = 1403) من الخلايا غير المعالجة و 92.5٪ (ن = 916) من الخلايا تعامل مع إرلوتينيب (ملاحظة: منطقة بيضاء صغيرة جدا لتصور). ( B ) 10X الصور التي تصور أمثلة من التوافق الجيد والفقير بين القائم على مضان والتصنيف القائم على التشكل. تشير الأسهم البيضاء إلى الخلايا التي تم تصنيفها بشكل غير متسق بين المنصات. إدخال الصورة: الأزرق - نوى (هوشست). الأخضر - CCD19Lu (غفب). المصنفةفيكاتيون الصور: الأحمر - H3255. الأخضر - كسد-19Lu. شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: القياسات النمطية المضاعفة من إعداد تجريبي واحد. ( أ ) تم حساب الخصائص المورفولوجية، مثل النوى ومنطقة الخلية، على مستوى الخلية الواحدة في وجود وغياب المخدرات. ملاحظة: اعتبرت المناطق الخلوية التي يقل حجمها عن 100 ميكرومتر ² حطام واستبعدت من التحليلات. مؤامرة مربع يصور الوسيط مع النطاقات الرباعية الأولى والثالثة و 95٪ أشرطة الخطأ الفاصل الثقة. ( B ) H3255 (الأزرق) و كسد-19Lu (الأخضر) خلايا شارك في تربيتها وتم تحديد الخلايا الميتة على أساس كثافة بروبيدأيوم يوديد وصمة عار (الأحمر) وتصويرها باستخدام هدف 10X. شريط مقياس = 1 مم (اللوحة العليا)؛ 100 ميكرون (الصور القاع). ( C ) تم حساب إجمالي عدد الخلايا الحية والميتة على مدى ثلاثة أيام مع أو بدون العلاج من تعاطي المخدرات، مع انخفاض واضح في عدد الخلايا الحية وزيادة في الخلايا الميتة مع إضافة إرلوتينيب. أشرطة الخطأ تمثل الخطأ القياسي للمتوسط ​​استنادا إلى ثلاث مكررات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: الديناميات السكانية الفرعية على مر الزمن. ممثل صور 10X من الآبار التي تحتوي على H3255 (الأزرق) و كسد-19Lu (الأخضر) في يوم 0 أو يوم 3 مع وبدون المخدرات. تم حساب الخلايا التي تنتمي إلى كل سكانية فرعية والرسوم البيانية الدائرية النسبية أكتوال في التركيبة السكانية عبر العينات. مقياس الحانات = 1 ملم (لوحات الأوسط، شبون في؛ لوحة إفتموست)، 1 مم (أعلى صورة)، 100 ميكرون (الصور القاع). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

The protocol described above improves upon current cell biology assays by providing more comprehensive insights into phenotypic dynamics of multiple cell types in response to environmental perturbations while using reduced reagents and time. A major advantage of this experimental design is the ability to analyze multiple phenotypes with a single setup and generate quantitative data characterizing these phenotypes on a single cell level. One technical advantage to this platform is the ease of initial troubleshooting compared to other assays. Because this method is image-based, one is able to visualize the wells for apparent over/under seeding. It is advisable to have cells in the exponential growth phase for the duration of the experiment and not be limited by nutrient or spatial constraints or confounded by senescence due to scarce seeding. Otherwise, birth and death rates may not be reproducible between experiments. For reference, CellPD is a publicly available program for computation of birth and death rates¹⁴. Additionally, one can visualize whether adequate concentrations of dyes were added to each well. Pipetting issues in an individual well could result in missegmentation and skewed data, but can easily be detected with the aforementioned protocol.

Unfortunately, not all cell types may be amenable to this application. It is important to be able to accurately segment the nuclei and cells, therefore analysis of cells that organize in more sphere-like or clumped structures may not be suitable. For some cells, it also may be advantageous to use a cell strainer prior to seeding to ensure initial seeding of single cells. In addition, the linear classifier technique is only applicable to cell types that can be readily distinguished based on morphology features.

For the success of the protocol, it is important to first optimize the imaging conditions, as the validity of downstream analyses is dependent on the quality of the images. While here we performed experiments using a high-content screening platform, image acquisition can also be performed using any fluorescent microscope (although an automated imaging platform is ideal for high-throughput approaches). Test images should be taken prior to each imaging time point to ensure that there are no problems with the microscope or protocol. The signal to noise ratio should be high, especially for the channels that will be used for segmentation (i.e. nuclei, cell stains). Additionally, it is important to image in the optimal plane of focus. If the images are out of focus, segmentation becomes much more difficult and the calculated morphological features will likely be inaccurate. Illumination differences between fields can cause problems with image segmentation as well. Large differences in brightness make the automated selection of threshold values difficult. Additionally, if there are heterogeneous fluorescence intensities between cells, a single threshold value may not sufficiently segment all the cells in an image. In this analysis, these problems were overcome by creating masks around brighter and dimmer cell populations and segmenting each population separately.

While the phenotypes under investigation in this protocol are limited to live, dead, and morphological characterization, they can easily be expanded to investigate other features. For example, functional genetic studies can be added with RNAi, overexpression, or other chemical perturbations.

In this paper, the capabilities of the protocol to measure the response of non-small cell lung cancer cells to erlotinib in the presence and absence of CAFs was demonstrated. However, this is merely one example of the many cell types and microenvironmental parameters that can be tested. We have extended this protocol to be used with other cell types and drug studies, including primary cells isolated from patient tumors^13,15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640	Corning	10-040-CV	cell culture medium
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gemini	100-106	medium supplement
Penicillin/streptomycin	Gibco	15-140-122	medium supplement
TC20	Biorad	1450102	cell counter
TC20 slides with trypan blue	Biorad	1450003	cell counter slides
96-well plates	Corning	3904	clear bottom black plates
Erlotinib	LC Laboratories	E-4007
DMSO	VWR	317275-100ML	solution to resuspend drug
Hoechst	Invitrogen	H21491	nuclear dye
Propidium Iodide (PI)	Invitrogen	P1304MP	dead cell stain
Cell Tracker Orange CMRA	Life Technologies	C34551	whole cell stain
Operetta high content imaging system	Perkin Elmer
CellProfiler	Broad Institue	version 2.2.0 (rev 9969f42)	http://cellprofiler.org/releases/
Cell culture incubator			Any cell culture incubator will be suitable - cells were cultured under 37 ºC at 5% CO2.
15 mL Falcon conical tubes	Falcon	14-959-53A
10 cm2 cell culture plates	TPP	93040